卵巢癌组织中p16基因甲基化的研究
【摘要】 目的 探讨抑癌基因p16基因5’端CpG岛甲基化在卵巢癌癌变过程中的作用。方法 应用甲基化特异性PCR(MSP)分别检测17例卵巢癌样本中p16基因启动子区域(M 1 /U 1 )以及启动子和第一个外显子5’端部分(M 2 /U 2 )的甲基化状态。结果 在我们检测的17例卵巢癌样本中，有3例M 1 阳性，阳性率为17.65%(3/17)，这些病例恶性度较低。无1例M 2 阳性。结论 抑癌基因p16基因5’端CpG岛甲基化参与卵巢癌特别是恶性度低的卵巢癌的癌变过程，它可能与其它抑癌基因协同作用。
关键词 卵巢癌 甲基化 抑癌基因p16
【文献标识码】 A 【文章编号】 1684-2030(2003)08-0678-02
The study on the methylation of p16gene in the ovarian cancers
, http://www.100md.com
Lu Lina，Wang Hanping，He Huiyi，et al.
The First People’s Hospital of Guangzhou，Guangdong510180.
【Abstract】 Objective To explore the action of the tumor-suppressor gene p16DNA methylation at the5’end in the carcinogenesis of ovarian cancers.Methods Methylation-specific PCR(MSP)was used to detect the p16gene within promoter regions(M 1 /U 1 )and within the regions from promoter and the partial exon1at5’end(M 2 /U 2 )for DNA methylation in17ovarian cancer samples.Results The fragments of p16gene between M 1 /U 1 were methyˉlated in3samples(3/16)which belonged to low malignancy cancers.None of samples showed methylation between M 2 /U 2.Conclusion The methylation of the tumor-suppressor gene p16may be important for the development of oˉvarian cancers，especially lowmalignancy cancers.It would be involved in the carcinogenesis of ovarian cancers togethˉer with the othertumor-suppressor genes.
, 百拇医药
Key words ovarian cancer methylation tumor-suppressor gene p16
卵巢癌与其它恶性肿瘤一样是一种多基因病，在卵巢癌的发生发展过程中，多个基因的分子变异起着至关重要的作用。p16是细胞周期的负调节基因，研究表明p16的基因变异如突变、纯合性丢失或5′端CpG岛甲基化等致使p16基因灭活，表达下调或缺乏，在恶性肿瘤的癌变过程中起到重要作用。大多数卵巢癌p16基因表达亦下调，但p16基因突变或纯合性丢失却较少发生;对卵巢癌p16基因甲基化的研究，则报道不一。对此，我们进行了探索，现报道如下。
1 材料和方法
1.1 样本来源 随机抽取2000年1月～2001年6月我院卵巢癌手术病人17例，切除肿瘤病理结果分别为:浆液性囊腺癌6例;交界性浆液性囊腺瘤1例;内膜样癌4例;未成熟畸胎瘤4例;颗粒细胞瘤2例。
, http://www.100md.com
1.2 甲基化特异性PCR 应用甲基化特异性PCR(methylaˉtion-spectific PCR，MSP)分析p16基因5’端CpG岛甲基化状态，具体步骤如下。
1.2.1 DNA提取 应用试剂盒QIAamp DNA Mini Kit(购自基因有限公司)提取卵巢癌组织DNA，操作按说明书。
1.2.2 引物的设计与合成 本文研究p16基因5’端CpG岛甲基化状态 [1，2] 。我们采用不同的引物分析甲基化与非甲基化状态，M 1 /U 1 分析启动子区域(150bp)甲基化与非甲基化，M 2 /U 2 分析启动子和第1外显子5’端部分区域(234bp)甲基化与非甲基化。所有引物均由大连宝生物工程有限公司合成。
1.2.3 DNA亚硫酸氢盐处理 将卵巢癌组织DNA溶液20 μl置95℃加热变性20min，加入新鲜配制的3M NaOH溶液5μl，置45℃20min;然后分别加入新鲜配制的0.1M氢醌12μl，3.6M亚硫酸氢钠208μl，混匀后加1滴矿物油覆盖，置55℃避光温育16h。用Wizard DNA purfication resin(购自Promega公司)纯化处理过的DNA溶液，洗脱时用50μl的双蒸水。最后在洗脱液中加入3MNaOH5μl，置40℃15min;接着用无水乙醇沉淀DNA，双蒸水溶解备用 [2] 。
, 百拇医药
1.2.4 PCR反应和产物检测 每例样本均分别用甲基化引物(M 1 和M 2 )和非甲基化引物(U 1 和U 2 )加以扩增，反应体积为50μl，PCR前处理为95℃热变性5min(热启动)，循环条件为94℃变性45s，60～65℃退火45s，72℃延伸45s，共进行35个循环，最后72℃延伸7min。PCR产物用3%琼脂糖凝胶电泳检测，紫外灯下观察结果。
2 结果
我们应用MSP检测了17例卵巢癌样本p16基因5’CpG岛甲基化状态，检测的区域分为两个部分，M 1 /U 1 分析的是启动子区域140bp范围内甲基化状态，M 2 /U 2 分析的是启动子和第1外显子5’端部分区域共224bp范围内甲基化状态。17例样本中有3例M 1 阳性，阳性率为17.65%;这3例样本中，1例为交界性浆液性囊腺癌，2例为颗粒细胞瘤，均属于恶性度较低的卵巢肿瘤。17例样本无1例M 2 阳性。
, 百拇医药
3 讨论
p16基因是一种重要的肿瘤抑制基因，它通过抑制细胞周期依赖性激酶4(CDK4)的活性而发挥负调节作用。CDK4是细胞周期的正性调节因子，它与细胞周期素D 1 结合形成cyclin D 1 -CDK4复合物，该复合物使RB蛋白磷酸化，从而解除了对DNA合成的抑制，使细胞从G1期进入S期。而p16蛋白与cyclin D 1 竞争性结合CDK4，通过抑制其活性阻止RB蛋白磷酸化，使细胞分裂的进程在起始期受阻。p16基因若发生变异，p16不能正常表达，CDK4失去抑制而过度活化，刺激细胞异常增殖而促使肿瘤发生。不少研究已经在膀胱癌、鼻咽癌等众多恶性肿瘤及肿瘤细胞株中发现高频率的p16基因变异 [3] 。在原发性卵巢癌中，p16基因突变的频率较低，且局限于粘液性卵巢癌、子宫内膜样癌等几种类型的卵巢癌;纯合性丢失的频率则更低，不管在什么类型的卵巢癌都极少发生 [4] 。推测在卵巢癌中可能存在别的形式的基因变异使p16灭活。
, 百拇医药
5’CpG岛的甲基化通过阻遏转录使p16灭活，研究已经证明这种形式的p16基因变异在许多肿瘤的癌变过程中起到重要的作用。在我们研究的17例卵巢癌样本中，p16基因甲基化的检出率为17.65%(3/17)，这3例样本中，2例为颗粒细胞瘤，1例为交界性浆液性囊腺瘤，均恶性度较低，这与McCluskey等 [4] 的报道相吻合。推测这是由于在恶性度较低的卵巢癌中，p16基因的突变、纯合性丢失等基因变异较少出现，与此相比较，通过甲基化灭活p16基因，显得更为重要 [5] 。
在本文研究的恶性度高的卵巢癌样本中，并未发现p16基因甲基化，这与本文研究p16基因的范围有关。p16基因有3个外显子，本研究仅限于启动子区域和第1外显子5’端部分;本文检出的p16基因甲基化的3例样本为启动子区域内甲基化(M 1 阳性)，第1外显子并未检出甲基化(无M 2 阳性)，这与文献报道相一致 [6] 。Niederacher等 [7] 亦 未检出第1外显子的甲基化，但却检出较高频率的第2外显子甲基化，且仅限于恶性度高的卵巢癌。第2外显子甲基化的作用机制尚不清楚，推测在恶性度高的卵巢癌癌变过程中，可能存在其它抑癌基因的灭活，例如与p16基因共享第2外显子的p15或p19基因。
, 百拇医药
本文由于研究例数较少，不能进行归类分析，因此无法得知卵巢癌特异性基因变异模式。我们初步研究的结果提示，抑癌基因p16甲基化参与卵巢癌特别是恶性度低的卵巢癌癌变过程，它可能与其它抑癌基因一起协同参与。
参考文献
1 Herman J G，Graff JR，Myohanen S，et al.Methylation-specific PCR:A novel PCR assay for methylation status of CpG islands.Proc Natl Acad Sci USA，1996，93:9821-9826.
2 McCluskey LL，Chen C，Delgadillo E，et al.Differences in p16gene methylation and expression in benign and malignant ovarian tumors.Gyˉnecol Oncol，1999，72:87-92.
, 百拇医药
3 Carius P，Mao L，Merlo A，et al.Rates of p16mutations in primary tuˉmors with9p loss.Science，1994，265:415-416.
4 Milde-Langosch K，Ocon E，Becker G，et al.p16/MTS1inactivation in ovarian carcinomas:high frequency of reduced protein expression associˉated with hyper-methylation of mutation in endometrioid and mucinous tumors.Int J Cancer，1998，79:61-65.
5 McCluskey LL，Dubeau L.Biology of ovarian cancer Curr Opin Oncol，1997，9:465-670.
, 百拇医药
6 Ryan A，Al-Jehani RM，Mulligam KT，et al.No evidence exists for methylation inactivation of the p16tumor suppressor gene in ovarian carˉcinogenesis.Gynecon Oncol，1998，68:14-17.
7 Niederacher D，Yan HY，An HX，et al.CDKN2A gene inactivation in epithelial sporadic ovarian cancer，Br J Can，1999，80:1920-1926.
作者单位:510180广东省广州市第一人民医院
(收稿日期:2003-04-15)
(编辑 浮萍), 百拇医药(卢丽娜)
关键词 卵巢癌 甲基化 抑癌基因p16
【文献标识码】 A 【文章编号】 1684-2030(2003)08-0678-02
The study on the methylation of p16gene in the ovarian cancers
, http://www.100md.com
Lu Lina，Wang Hanping，He Huiyi，et al.
The First People’s Hospital of Guangzhou，Guangdong510180.
【Abstract】 Objective To explore the action of the tumor-suppressor gene p16DNA methylation at the5’end in the carcinogenesis of ovarian cancers.Methods Methylation-specific PCR(MSP)was used to detect the p16gene within promoter regions(M 1 /U 1 )and within the regions from promoter and the partial exon1at5’end(M 2 /U 2 )for DNA methylation in17ovarian cancer samples.Results The fragments of p16gene between M 1 /U 1 were methyˉlated in3samples(3/16)which belonged to low malignancy cancers.None of samples showed methylation between M 2 /U 2.Conclusion The methylation of the tumor-suppressor gene p16may be important for the development of oˉvarian cancers，especially lowmalignancy cancers.It would be involved in the carcinogenesis of ovarian cancers togethˉer with the othertumor-suppressor genes.
, 百拇医药
Key words ovarian cancer methylation tumor-suppressor gene p16
卵巢癌与其它恶性肿瘤一样是一种多基因病，在卵巢癌的发生发展过程中，多个基因的分子变异起着至关重要的作用。p16是细胞周期的负调节基因，研究表明p16的基因变异如突变、纯合性丢失或5′端CpG岛甲基化等致使p16基因灭活，表达下调或缺乏，在恶性肿瘤的癌变过程中起到重要作用。大多数卵巢癌p16基因表达亦下调，但p16基因突变或纯合性丢失却较少发生;对卵巢癌p16基因甲基化的研究，则报道不一。对此，我们进行了探索，现报道如下。
1 材料和方法
1.1 样本来源 随机抽取2000年1月～2001年6月我院卵巢癌手术病人17例，切除肿瘤病理结果分别为:浆液性囊腺癌6例;交界性浆液性囊腺瘤1例;内膜样癌4例;未成熟畸胎瘤4例;颗粒细胞瘤2例。
, http://www.100md.com
1.2 甲基化特异性PCR 应用甲基化特异性PCR(methylaˉtion-spectific PCR，MSP)分析p16基因5’端CpG岛甲基化状态，具体步骤如下。
1.2.1 DNA提取 应用试剂盒QIAamp DNA Mini Kit(购自基因有限公司)提取卵巢癌组织DNA，操作按说明书。
1.2.2 引物的设计与合成 本文研究p16基因5’端CpG岛甲基化状态 [1，2] 。我们采用不同的引物分析甲基化与非甲基化状态，M 1 /U 1 分析启动子区域(150bp)甲基化与非甲基化，M 2 /U 2 分析启动子和第1外显子5’端部分区域(234bp)甲基化与非甲基化。所有引物均由大连宝生物工程有限公司合成。
1.2.3 DNA亚硫酸氢盐处理 将卵巢癌组织DNA溶液20 μl置95℃加热变性20min，加入新鲜配制的3M NaOH溶液5μl，置45℃20min;然后分别加入新鲜配制的0.1M氢醌12μl，3.6M亚硫酸氢钠208μl，混匀后加1滴矿物油覆盖，置55℃避光温育16h。用Wizard DNA purfication resin(购自Promega公司)纯化处理过的DNA溶液，洗脱时用50μl的双蒸水。最后在洗脱液中加入3MNaOH5μl，置40℃15min;接着用无水乙醇沉淀DNA，双蒸水溶解备用 [2] 。
, 百拇医药
1.2.4 PCR反应和产物检测 每例样本均分别用甲基化引物(M 1 和M 2 )和非甲基化引物(U 1 和U 2 )加以扩增，反应体积为50μl，PCR前处理为95℃热变性5min(热启动)，循环条件为94℃变性45s，60～65℃退火45s，72℃延伸45s，共进行35个循环，最后72℃延伸7min。PCR产物用3%琼脂糖凝胶电泳检测，紫外灯下观察结果。
2 结果
我们应用MSP检测了17例卵巢癌样本p16基因5’CpG岛甲基化状态，检测的区域分为两个部分，M 1 /U 1 分析的是启动子区域140bp范围内甲基化状态，M 2 /U 2 分析的是启动子和第1外显子5’端部分区域共224bp范围内甲基化状态。17例样本中有3例M 1 阳性，阳性率为17.65%;这3例样本中，1例为交界性浆液性囊腺癌，2例为颗粒细胞瘤，均属于恶性度较低的卵巢肿瘤。17例样本无1例M 2 阳性。
, 百拇医药
3 讨论
p16基因是一种重要的肿瘤抑制基因，它通过抑制细胞周期依赖性激酶4(CDK4)的活性而发挥负调节作用。CDK4是细胞周期的正性调节因子，它与细胞周期素D 1 结合形成cyclin D 1 -CDK4复合物，该复合物使RB蛋白磷酸化，从而解除了对DNA合成的抑制，使细胞从G1期进入S期。而p16蛋白与cyclin D 1 竞争性结合CDK4，通过抑制其活性阻止RB蛋白磷酸化，使细胞分裂的进程在起始期受阻。p16基因若发生变异，p16不能正常表达，CDK4失去抑制而过度活化，刺激细胞异常增殖而促使肿瘤发生。不少研究已经在膀胱癌、鼻咽癌等众多恶性肿瘤及肿瘤细胞株中发现高频率的p16基因变异 [3] 。在原发性卵巢癌中，p16基因突变的频率较低，且局限于粘液性卵巢癌、子宫内膜样癌等几种类型的卵巢癌;纯合性丢失的频率则更低，不管在什么类型的卵巢癌都极少发生 [4] 。推测在卵巢癌中可能存在别的形式的基因变异使p16灭活。
, 百拇医药
5’CpG岛的甲基化通过阻遏转录使p16灭活，研究已经证明这种形式的p16基因变异在许多肿瘤的癌变过程中起到重要的作用。在我们研究的17例卵巢癌样本中，p16基因甲基化的检出率为17.65%(3/17)，这3例样本中，2例为颗粒细胞瘤，1例为交界性浆液性囊腺瘤，均恶性度较低，这与McCluskey等 [4] 的报道相吻合。推测这是由于在恶性度较低的卵巢癌中，p16基因的突变、纯合性丢失等基因变异较少出现，与此相比较，通过甲基化灭活p16基因，显得更为重要 [5] 。
在本文研究的恶性度高的卵巢癌样本中，并未发现p16基因甲基化，这与本文研究p16基因的范围有关。p16基因有3个外显子，本研究仅限于启动子区域和第1外显子5’端部分;本文检出的p16基因甲基化的3例样本为启动子区域内甲基化(M 1 阳性)，第1外显子并未检出甲基化(无M 2 阳性)，这与文献报道相一致 [6] 。Niederacher等 [7] 亦 未检出第1外显子的甲基化，但却检出较高频率的第2外显子甲基化，且仅限于恶性度高的卵巢癌。第2外显子甲基化的作用机制尚不清楚，推测在恶性度高的卵巢癌癌变过程中，可能存在其它抑癌基因的灭活，例如与p16基因共享第2外显子的p15或p19基因。
, 百拇医药
本文由于研究例数较少，不能进行归类分析，因此无法得知卵巢癌特异性基因变异模式。我们初步研究的结果提示，抑癌基因p16甲基化参与卵巢癌特别是恶性度低的卵巢癌癌变过程，它可能与其它抑癌基因一起协同参与。
参考文献
1 Herman J G，Graff JR，Myohanen S，et al.Methylation-specific PCR:A novel PCR assay for methylation status of CpG islands.Proc Natl Acad Sci USA，1996，93:9821-9826.
2 McCluskey LL，Chen C，Delgadillo E，et al.Differences in p16gene methylation and expression in benign and malignant ovarian tumors.Gyˉnecol Oncol，1999，72:87-92.
, 百拇医药
3 Carius P，Mao L，Merlo A，et al.Rates of p16mutations in primary tuˉmors with9p loss.Science，1994，265:415-416.
4 Milde-Langosch K，Ocon E，Becker G，et al.p16/MTS1inactivation in ovarian carcinomas:high frequency of reduced protein expression associˉated with hyper-methylation of mutation in endometrioid and mucinous tumors.Int J Cancer，1998，79:61-65.
5 McCluskey LL，Dubeau L.Biology of ovarian cancer Curr Opin Oncol，1997，9:465-670.
, 百拇医药
6 Ryan A，Al-Jehani RM，Mulligam KT，et al.No evidence exists for methylation inactivation of the p16tumor suppressor gene in ovarian carˉcinogenesis.Gynecon Oncol，1998，68:14-17.
7 Niederacher D，Yan HY，An HX，et al.CDKN2A gene inactivation in epithelial sporadic ovarian cancer，Br J Can，1999，80:1920-1926.
作者单位:510180广东省广州市第一人民医院
(收稿日期:2003-04-15)
(编辑 浮萍), 百拇医药(卢丽娜)