去甲斑蝥素对人原发性胆囊癌GBC-SD细胞系侵袭力的影响
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)04-0486-03
Influence of norcantharidin on invasion of GBC-SD cells in human gallbladder carcinoma
Fan Yuezu，Fu Jinye，Zhao Zeming，et al.
Dept.of Surgery，Tongji Hospital of Tongji University，Shanghai200065.
【Abstract】 Objective To study the influence of norcantharidin on invasion of GBC-SD cell lines in human gallbladder carcinoma.Methods GBC-SD cell lines in human gallbladder carcinoma were cultured by cell culture technique.The Matrigel experiment and the crossing-river test were used to examine the inhibitory effect
, 百拇医药
of norcanˉtharidin on invasion of GBC-SD cells.Results The Matrigel experiment showed that norcantharidin began to inhibit the invasion of GBC-SD cells at the concentration of5μg/ml.At40μg/ml of norcantharidin，the invasive action of GBC-SD cells was inhibited completely.Its effect was dose-dependent.The crossing-r
iver test indicated time of the crossing-river of GBC-SD cells treated with norcantharidin(40μg/ml)for72hours became long significantly.Conclusion Norcantharidin can inhibit the invasive capability of GBC-SD cells of human gallbladder carcinoma at a lower dose;its inhibitory effect was in a dose and time-dependent m
, 百拇医药
anner.The mechanism might correlate with diˉrective inhibition of GBC-SD cell movement.
Key words gallbladder carcinoma norcantharidin cell culture invasion matrigel or crossing-river experiˉment
胆囊癌是一种起病隐匿，早期诊断困难，浸润转移早，预后差的恶性肿瘤。目前的治疗方法如手术、化疗，疗效均不甚满意。本研究从传统医学着手，探讨中药斑蝥的提取物去甲斑蝥素(norcantharidin，NCTD)对人原发性胆囊癌GBC-SD细胞系的体外侵袭能力的影响，以探讨其抗癌作用及其机制。现报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验材料
, 百拇医药
1.1.1 细胞株 体外培养的人原发性胆囊癌细胞株GBC-SD购自上海细胞所国家细胞库。该株取自一名61岁男性胆囊体部的低分化腺癌组织，经传代培养而建株。该细胞以多角形、梭形和方形为主，多中心或多细胞克隆来源;细胞增殖快，倍增时间约为21.4h;染色体分布范围为37～145体，众数为81，属超三倍体。该细胞株恶性程度高，病人于术后2个月死于全身广泛转移。
1.1.2 药物 去甲斑蝥素，购自北京第四制药厂，批号为980125，剂型为10mg/2ml，4℃保存。
1.1.3 Matrigel侵袭室(Matrigel invasion chamber) 购自美国Becton Dickinson公司。由孔径为8.0μm的PET膜上覆一层均匀的人工合成的基底膜基质组成。
1.2 方法和步聚
1.2.1 细胞培养、传代 用含10%小牛血清(杭州四季青生物公司产品)的RPMI-1640(GBICO公司产品)培养液，37℃，5%CO 2 孵育箱(MCO-175型，三洋电机贸易株式会社产品)中培养细胞，每2～3d更换培养液;当细胞长满瓶底80%时，倒掉培养液，加入D-Hanks液约冲洗2遍，加入0.25%胰蛋白酶(GBICO公司产品)2ml，37℃消化2～3min，在倒置显微镜(重庆光学仪器厂产品)下发现细胞间隙增大，胞质回缩，终止消化。倒掉胰酶，加入含10%小牛血清的培养液，用吸管轻轻吹打瓶壁至细胞悬浮，以1∶2～3传代，再培养。待细胞贴壁，胞浆延展即进入对数生长期约为传代后24h，倒掉原培养液，用D-Hanks(GBICO公司产品)液冲洗2遍后用于实验。
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1.2.2 Matrigel体外细胞侵袭实验 ①取生长旺盛的GBC-SD细胞，用0.25%胰酶消化，经吹打、收集、离心，用含10%小牛血清的培养液配成1×10 6 /ml的细胞悬液;按每室0.3ml接种于Matrigel侵袭腔的上层;在其下层加入含10%小牛血清的RPMI-1640培养液0.8ml。②37℃，5%CO 2 条件下培养24h，使细胞贴壁。③轻轻吸去上层培养液，加入含不同浓度去甲斑蝥素的培养液0.3ml，每一浓度复设3室，对照组加入等量不含药物的培养液，37℃，5%CO 2 继续培养72h。④取出上层的Matrigel腔，收集所有的过膜细胞，离心，台盼蓝染色，细胞计数。同样实验重复3次。见图1。
图1 Matrigel侵袭力实验示意图 (图略)
1.2.3 过河实验 肿瘤细胞的转移能力包括细胞分泌各种酶或因子降解周围组织和其本身的运动能力。过河实验即直接检测细胞的运动能力。其操作如下:①取生长旺盛的GBC-SD细胞，经消化、吹打、收集、离心后，用含10%小牛血清的培养液配成3×10 5 /ml的细胞悬液，按每孔3ml加入六孔板;37℃，5%CO 2 孵育24h，使之贴壁;②吸弃原培养液，加入含有不同浓度去甲斑蝥素的培养液，每孔3ml;对照组加入等量不含药物的培养液;37℃，5%CO 2 继续培养48h;③吸弃孔中的液体，PBS液冲洗1遍;用10μl的枪头在孔中划一条直线，PBS液再冲洗2遍;加入含10%小牛血清的培养液，37℃，5%CO 2 继续培养，每2h观察一次，至划痕完全被细胞填满。同样实验重复3次。
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1.2.4 统计学处理 所有数据均使用SPSS10.0统计软件包进行处理。计量资料用ˉx±s表示，经方差齐性检验后各组间比较用t检验，以P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 Matrigel细胞体外侵袭力实验 如表1、图2所示，未经去甲斑蝥素处理的GBC-SD细胞有较多过膜，细胞体外侵袭能力强;经去甲斑蝥素处理后，其过膜细胞数随去甲斑蝥素浓度增加而明显减少，至40μg/ml时仅见零星散在的过膜细胞(P<0.01)。表明，去甲斑蝥素可明显抑制GBC-SD细胞的体外侵袭能力，且其抑制作用呈剂量效应关系。另外，光镜检查发现:经
去甲斑蝥素处理后的过膜细胞，其中台盼蓝着色的细胞(表明细胞死亡，再形成细胞克隆能力的概率小)随去甲斑蝥素浓度增加而增多—即过膜细胞死亡数增多，且明显多于对照组(P<0.01)。由此可见，去甲斑蝥素能明显抑制人胆囊癌GBC-SD细胞的体外侵袭模拟基底膜的能力。
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2.2 过河实验 如表2，去甲斑蝥素处理后各组细胞的过河时间明显延长:5μg/ml组过河时间延长160%;40μg/ml以上浓度组，72h后仍未见细胞完全过河。表明，去甲斑蝥素可明显抑制胆囊癌细胞GBC-SD的运动能力。
图2 不同浓度去甲斑蝥素对GBC-SD细胞侵袭能力的影响多于(图略)
表1 不同浓度去甲斑蝥素对GBC-SD细胞侵袭能力的影响 (ˉx±s)(表略)
表2 不同浓度去甲斑蝥素处理后的GBC-SD细胞过河时间(ˉx±s)(表略)
3 讨论
癌细胞侵袭能力是恶性肿瘤的基本特征之一。诸多病人并非死于肿瘤原发病灶而死于肿瘤全身转移，其初始基本步骤即是具有极强侵袭潜能的癌细胞，突破正常细胞基底膜，造成侵及突入，而在别处形成转移灶。因此，抑制癌细胞侵袭能力是抗肿瘤转移治疗的基本机制之一。
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随着肿瘤生物学特性研究的不断深入，针对肿瘤侵袭特性的抗肿瘤药物应运而生，如目前热门的抗肿瘤血管生成和金属蛋白酶组织抑制剂等药物。尽管天然药、传统中药在现代肿瘤治疗中的作用日益受到重视，许多源于中药的抗肿瘤药物如羟基喜树碱，鬼臼乙叉甙，紫杉醇等，已在临床证实有较好的抗肿瘤疗效，但对抑制癌侵袭和转移，尤其是抗胆囊癌侵袭力的研究却极少。
去甲斑蝥素是从传统中药中提取并经人工合成的一种新型的抗肿瘤药物，已用于多种肿瘤的治疗，并取得较好的疗效。已有研究证明，去甲斑蝥素能抑制包括人红白血病细胞K562、人早幼粒白血病细胞HL-60、卵巢癌3AO、AO细胞、人肝癌细胞BEL-7402等多种肿瘤细胞的生长，其抗肿瘤的机理包括诱导细胞的凋亡、阻滞癌细胞生长，使之停滞于细胞周期的G 2 /M期，并抑制细胞DNA合成，干扰细胞的代谢、影响细胞NF-kB表达等。笔者曾报道，去甲斑蝥素能抑制人原发性胆囊癌GBC-SD细胞的生长，作用呈剂量-时间效应关系;其机理可能与去甲斑蝥素抑制GBC-SD细胞增殖，干扰生长周期，抑制DNA合成，影响代谢及诱导GBC-SD细胞凋亡有关。本实验应用Matrigel体外侵袭力实验和细胞过河实验探讨去甲斑蝥素的抗癌细胞侵袭转移的能力。实验表明，去甲斑蝥素在5μg/ml时即能明显抑制人胆囊癌GBC-SD细胞体外侵袭的能力如GBC-SD过膜细胞数仅为对照组的53.16%，过河时间延长了25%;在40μg/ml浓度时，仅散在见到过膜细胞且大多死亡，过河实验72h仍未见细胞完全过河，即GBC-SD细胞体外侵袭的能力几乎完全被抑制。可见，去甲斑蝥素不仅能杀伤人胆囊癌GBC-SD细胞，而且在较低浓度下还能抑制人胆囊癌GBC-SD细胞的侵袭转移能力。其机制是否与去甲斑蝥素直接抑制GBC-SD细胞的迁移运动有关，有待作进一步的研究。
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参考文献
1 Fan Yuezu，Zhang Jingtao.Significance of MMP-2/TIMP-2in gallˉ bladder carcinoma.J Tumor Marker Oncology，2001，16(4):339.
2 Stamenkovic I.Matrix metalloproteinases in turmor invasion and metastaˉsis.Semin Cancer Biol，2000，10:415-433.
3 Giannelli G，Falk-Marzillier J，Schiraldi O，et al.Induction of cell miˉgration by matrix metalloproteinase-2cleavage of laminin-5.Science，1997，277:225-228.
, 百拇医药
4 Zocker S，Cao J，Chen WT.Critical appraisal of the use of matrix metalˉloproteinase inhibitor in cancer treatment.Oncogene，2000，19:6642-6650.
5 傅锦业，范跃祖.原发性胆囊癌化疗的现状和评价.同济大学学报(医学版)，2001，22(2):73-75.
6 严英，钟秀驰，周伟生，等.中药制剂介入治疗恶性肿瘤的药理与临床研究概述.中药新药与临床药理，2000，11(3):185-188.
7 唐龙英，王昭梅，宓鹤鸣，等.去甲斑蝥素治疗卵巢癌的实验研究.肿瘤，2000，20(2):96-99.
8 陈家旭，刘晓兰，刘燕，等.去甲斑蝥素诱导K-562细胞凋亡的影响.中国医药学报，2000，15(2):21-23.
9 戴书静，王继峰，莫日根，等.去甲斑蝥素增强Bel7402k IkBα表达和抑制细胞增殖的研究.解剖学报，2001，32(2):155-158.
10 Albini A，Iwamoto Y，Kleinman HK，et al.A rapid in vitro assay for quantitating the invasive potential of tumor cells.Cancer Res，1987，47:3239-3245.
(编辑 小川), http://www.100md.com
Influence of norcantharidin on invasion of GBC-SD cells in human gallbladder carcinoma
Fan Yuezu，Fu Jinye，Zhao Zeming，et al.
Dept.of Surgery，Tongji Hospital of Tongji University，Shanghai200065.
【Abstract】 Objective To study the influence of norcantharidin on invasion of GBC-SD cell lines in human gallbladder carcinoma.Methods GBC-SD cell lines in human gallbladder carcinoma were cultured by cell culture technique.The Matrigel experiment and the crossing-river test were used to examine the inhibitory effect
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of norcanˉtharidin on invasion of GBC-SD cells.Results The Matrigel experiment showed that norcantharidin began to inhibit the invasion of GBC-SD cells at the concentration of5μg/ml.At40μg/ml of norcantharidin，the invasive action of GBC-SD cells was inhibited completely.Its effect was dose-dependent.The crossing-r
iver test indicated time of the crossing-river of GBC-SD cells treated with norcantharidin(40μg/ml)for72hours became long significantly.Conclusion Norcantharidin can inhibit the invasive capability of GBC-SD cells of human gallbladder carcinoma at a lower dose;its inhibitory effect was in a dose and time-dependent m
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anner.The mechanism might correlate with diˉrective inhibition of GBC-SD cell movement.
Key words gallbladder carcinoma norcantharidin cell culture invasion matrigel or crossing-river experiˉment
胆囊癌是一种起病隐匿，早期诊断困难，浸润转移早，预后差的恶性肿瘤。目前的治疗方法如手术、化疗，疗效均不甚满意。本研究从传统医学着手，探讨中药斑蝥的提取物去甲斑蝥素(norcantharidin，NCTD)对人原发性胆囊癌GBC-SD细胞系的体外侵袭能力的影响，以探讨其抗癌作用及其机制。现报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验材料
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1.1.1 细胞株 体外培养的人原发性胆囊癌细胞株GBC-SD购自上海细胞所国家细胞库。该株取自一名61岁男性胆囊体部的低分化腺癌组织，经传代培养而建株。该细胞以多角形、梭形和方形为主，多中心或多细胞克隆来源;细胞增殖快，倍增时间约为21.4h;染色体分布范围为37～145体，众数为81，属超三倍体。该细胞株恶性程度高，病人于术后2个月死于全身广泛转移。
1.1.2 药物 去甲斑蝥素，购自北京第四制药厂，批号为980125，剂型为10mg/2ml，4℃保存。
1.1.3 Matrigel侵袭室(Matrigel invasion chamber) 购自美国Becton Dickinson公司。由孔径为8.0μm的PET膜上覆一层均匀的人工合成的基底膜基质组成。
1.2 方法和步聚
1.2.1 细胞培养、传代 用含10%小牛血清(杭州四季青生物公司产品)的RPMI-1640(GBICO公司产品)培养液，37℃，5%CO 2 孵育箱(MCO-175型，三洋电机贸易株式会社产品)中培养细胞，每2～3d更换培养液;当细胞长满瓶底80%时，倒掉培养液，加入D-Hanks液约冲洗2遍，加入0.25%胰蛋白酶(GBICO公司产品)2ml，37℃消化2～3min，在倒置显微镜(重庆光学仪器厂产品)下发现细胞间隙增大，胞质回缩，终止消化。倒掉胰酶，加入含10%小牛血清的培养液，用吸管轻轻吹打瓶壁至细胞悬浮，以1∶2～3传代，再培养。待细胞贴壁，胞浆延展即进入对数生长期约为传代后24h，倒掉原培养液，用D-Hanks(GBICO公司产品)液冲洗2遍后用于实验。
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1.2.2 Matrigel体外细胞侵袭实验 ①取生长旺盛的GBC-SD细胞，用0.25%胰酶消化，经吹打、收集、离心，用含10%小牛血清的培养液配成1×10 6 /ml的细胞悬液;按每室0.3ml接种于Matrigel侵袭腔的上层;在其下层加入含10%小牛血清的RPMI-1640培养液0.8ml。②37℃，5%CO 2 条件下培养24h，使细胞贴壁。③轻轻吸去上层培养液，加入含不同浓度去甲斑蝥素的培养液0.3ml，每一浓度复设3室，对照组加入等量不含药物的培养液，37℃，5%CO 2 继续培养72h。④取出上层的Matrigel腔，收集所有的过膜细胞，离心，台盼蓝染色，细胞计数。同样实验重复3次。见图1。
图1 Matrigel侵袭力实验示意图 (图略)
1.2.3 过河实验 肿瘤细胞的转移能力包括细胞分泌各种酶或因子降解周围组织和其本身的运动能力。过河实验即直接检测细胞的运动能力。其操作如下:①取生长旺盛的GBC-SD细胞，经消化、吹打、收集、离心后，用含10%小牛血清的培养液配成3×10 5 /ml的细胞悬液，按每孔3ml加入六孔板;37℃，5%CO 2 孵育24h，使之贴壁;②吸弃原培养液，加入含有不同浓度去甲斑蝥素的培养液，每孔3ml;对照组加入等量不含药物的培养液;37℃，5%CO 2 继续培养48h;③吸弃孔中的液体，PBS液冲洗1遍;用10μl的枪头在孔中划一条直线，PBS液再冲洗2遍;加入含10%小牛血清的培养液，37℃，5%CO 2 继续培养，每2h观察一次，至划痕完全被细胞填满。同样实验重复3次。
, 百拇医药
1.2.4 统计学处理 所有数据均使用SPSS10.0统计软件包进行处理。计量资料用ˉx±s表示，经方差齐性检验后各组间比较用t检验，以P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 Matrigel细胞体外侵袭力实验 如表1、图2所示，未经去甲斑蝥素处理的GBC-SD细胞有较多过膜，细胞体外侵袭能力强;经去甲斑蝥素处理后，其过膜细胞数随去甲斑蝥素浓度增加而明显减少，至40μg/ml时仅见零星散在的过膜细胞(P<0.01)。表明，去甲斑蝥素可明显抑制GBC-SD细胞的体外侵袭能力，且其抑制作用呈剂量效应关系。另外，光镜检查发现:经
去甲斑蝥素处理后的过膜细胞，其中台盼蓝着色的细胞(表明细胞死亡，再形成细胞克隆能力的概率小)随去甲斑蝥素浓度增加而增多—即过膜细胞死亡数增多，且明显多于对照组(P<0.01)。由此可见，去甲斑蝥素能明显抑制人胆囊癌GBC-SD细胞的体外侵袭模拟基底膜的能力。
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2.2 过河实验 如表2，去甲斑蝥素处理后各组细胞的过河时间明显延长:5μg/ml组过河时间延长160%;40μg/ml以上浓度组，72h后仍未见细胞完全过河。表明，去甲斑蝥素可明显抑制胆囊癌细胞GBC-SD的运动能力。
图2 不同浓度去甲斑蝥素对GBC-SD细胞侵袭能力的影响多于(图略)
表1 不同浓度去甲斑蝥素对GBC-SD细胞侵袭能力的影响 (ˉx±s)(表略)
表2 不同浓度去甲斑蝥素处理后的GBC-SD细胞过河时间(ˉx±s)(表略)
3 讨论
癌细胞侵袭能力是恶性肿瘤的基本特征之一。诸多病人并非死于肿瘤原发病灶而死于肿瘤全身转移，其初始基本步骤即是具有极强侵袭潜能的癌细胞，突破正常细胞基底膜，造成侵及突入，而在别处形成转移灶。因此，抑制癌细胞侵袭能力是抗肿瘤转移治疗的基本机制之一。
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随着肿瘤生物学特性研究的不断深入，针对肿瘤侵袭特性的抗肿瘤药物应运而生，如目前热门的抗肿瘤血管生成和金属蛋白酶组织抑制剂等药物。尽管天然药、传统中药在现代肿瘤治疗中的作用日益受到重视，许多源于中药的抗肿瘤药物如羟基喜树碱，鬼臼乙叉甙，紫杉醇等，已在临床证实有较好的抗肿瘤疗效，但对抑制癌侵袭和转移，尤其是抗胆囊癌侵袭力的研究却极少。
去甲斑蝥素是从传统中药中提取并经人工合成的一种新型的抗肿瘤药物，已用于多种肿瘤的治疗，并取得较好的疗效。已有研究证明，去甲斑蝥素能抑制包括人红白血病细胞K562、人早幼粒白血病细胞HL-60、卵巢癌3AO、AO细胞、人肝癌细胞BEL-7402等多种肿瘤细胞的生长，其抗肿瘤的机理包括诱导细胞的凋亡、阻滞癌细胞生长，使之停滞于细胞周期的G 2 /M期，并抑制细胞DNA合成，干扰细胞的代谢、影响细胞NF-kB表达等。笔者曾报道，去甲斑蝥素能抑制人原发性胆囊癌GBC-SD细胞的生长，作用呈剂量-时间效应关系;其机理可能与去甲斑蝥素抑制GBC-SD细胞增殖，干扰生长周期，抑制DNA合成，影响代谢及诱导GBC-SD细胞凋亡有关。本实验应用Matrigel体外侵袭力实验和细胞过河实验探讨去甲斑蝥素的抗癌细胞侵袭转移的能力。实验表明，去甲斑蝥素在5μg/ml时即能明显抑制人胆囊癌GBC-SD细胞体外侵袭的能力如GBC-SD过膜细胞数仅为对照组的53.16%，过河时间延长了25%;在40μg/ml浓度时，仅散在见到过膜细胞且大多死亡，过河实验72h仍未见细胞完全过河，即GBC-SD细胞体外侵袭的能力几乎完全被抑制。可见，去甲斑蝥素不仅能杀伤人胆囊癌GBC-SD细胞，而且在较低浓度下还能抑制人胆囊癌GBC-SD细胞的侵袭转移能力。其机制是否与去甲斑蝥素直接抑制GBC-SD细胞的迁移运动有关，有待作进一步的研究。
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参考文献
1 Fan Yuezu，Zhang Jingtao.Significance of MMP-2/TIMP-2in gallˉ bladder carcinoma.J Tumor Marker Oncology，2001，16(4):339.
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5 傅锦业，范跃祖.原发性胆囊癌化疗的现状和评价.同济大学学报(医学版)，2001，22(2):73-75.
6 严英，钟秀驰，周伟生，等.中药制剂介入治疗恶性肿瘤的药理与临床研究概述.中药新药与临床药理，2000，11(3):185-188.
7 唐龙英，王昭梅，宓鹤鸣，等.去甲斑蝥素治疗卵巢癌的实验研究.肿瘤，2000，20(2):96-99.
8 陈家旭，刘晓兰，刘燕，等.去甲斑蝥素诱导K-562细胞凋亡的影响.中国医药学报，2000，15(2):21-23.
9 戴书静，王继峰，莫日根，等.去甲斑蝥素增强Bel7402k IkBα表达和抑制细胞增殖的研究.解剖学报，2001，32(2):155-158.
10 Albini A，Iwamoto Y，Kleinman HK，et al.A rapid in vitro assay for quantitating the invasive potential of tumor cells.Cancer Res，1987，47:3239-3245.
(编辑 小川), http://www.100md.com
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