人Ⅰ型补体受体重组腺病毒的构建和鉴定
【摘要】 目的 构建并鉴定CR 1 重组腺病毒，为有关基因转染研究作准备。方法 CR 1 目的基因经酶切插入pAxCAwt载体，构建成CR 1 -pAxCAwt重组粘粒。磷酸钙共沉淀法转染293细胞获取重组腺病毒。结果 CR 1 -pAxCAwt重组粘粒插入方向正确，所获腺病毒为复制缺陷型sCR 1 重组腺病毒。结论 采用的粘粒构建、转染方法可行，所获重组腺病毒可靠。
关键词 Ⅰ型补体受体 重组腺病毒
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)05-0641-02
Construction of replication-deficient recombinant
adenovirus coding sCR 1 gene
, http://www.100md.com
Huang Shengdong，Gong Dejun，Xu Zhiyun，et al.
Department of Cardiothoracic Surgery，Changhai Hospital，Shanghai200433.
【Abstract】 Objective To construct the replication-deficient recombinant adenovirus coding sCR 1 gene before the studies of gene transfection to cardiac muscle of transplanted heart.Methods The sCR 1 -pAxCAwt was constructed by inserted the cDNA of interest into the SwaI site of pAxCAwt.Results The right direction of the insert was confirmed by restriction.Conclusion The direction of the insert must be confirmed by restriction analysis，and the DNA package protein is much helpful during the transfection of the recombinant cosmid to E.coli.
, 百拇医药
Key words CR 1 recombinant adenovirus
Ⅰ型补体受体(Complement receptor，I，CR 1 )广泛存在于红细胞等多种血细胞膜 [1] ，能与体内的补体活性抑制因子(Ⅰ因子)、DAF等共同抑制补体C3b、C4b的活性，减小补体本身及激发免疫细胞所造成的损伤 [2] 。近年来，国外学者成功地将CR 1 膜外段表达为可溶性的CR 1 蛋白(Soluble complement receptor I，sCR 1 )。
动物实验证明，sCR 1 能有效地抑制异种心脏移植后的超急性排斥反应，减轻心肌炎性坏死 [3，4] 。不足之处在于sCR 1 在体内半衰期较短，所需用药量较大;其次，大剂量全身性地给予sCR 1 ，会削弱受体动物抗炎性反应能力。如能将基因转染心肌原位表达sCR 1，可能会起到局部而较为持续的保护作用。本研究将CR 1 活性区基因构建成重组腺病毒，为基因治疗研究的开展打下基础。
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1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要试剂 反转录试剂盒:德国Boehringer公司产品;PCR试剂:加拿大生工公司产品;PCR引物:P 1 :ATGTGCTTGGGGAGAATGGG; P 2 :TCAGATGAGTAAAATAAAGAAGA。生工公司合成;限制性内切酶、T 4 DNA多核苷酸激酶、T 4 DNA连接酶等:美国BioLabs公司产品;DNA分子量标准品:皓嘉公司产品;腺病毒表达载体试剂盒:日本TaKaRa公司产品。质粒纯化试剂盒:德国Qiagen公司产品。DNA包装蛋白:美国Novagen公司产品。胎牛血清:GIBICO公司。
1.1.2 菌株、质粒和粘粒 PUC119质粒、大肠杆菌TG 1 菌株由复旦大学遗传学研究所提供。粘粒载体pAxCAwt及菌株LE392为日本TaKaRa公司腺病毒表达载体试剂盒所带。
, 百拇医药
1.1.3 细胞株 人胚肾细胞(293)细胞:美国ATCC公司。
1.2 方法
1.2.1 Ⅰ型补体受体的腺病毒重组粘粒构建 取1.5μg pAxCAwt粘粒，用SwaI酶切;用KpnI、NotI双酶切Ⅰ型补体受体pBVKS重组质粒，1%琼脂糖凝胶电泳回收Ⅰ型补体受体cDNA片段，用Klenow大片段将两端补平。片段DNA与粘粒DNA以20:1摩尔数比混合，加入500U高浓度T 4连接酶置16℃连接过夜。酚氯仿抽提后用DNA包装蛋白包装，转染LE392细菌，涂布加有氨苄青霉素的TB固体培养基，37℃培养过夜，挑取菌落培养抽提粘粒。
1.2.2 重组粘粒及插入方向鉴定 PCR扩增出阳性且SwaI酶切未被切断的粘粒判断为重组阳性克隆。进一步用SalI酶切，1%琼脂糖凝胶电泳回收8729bp大小的片段，自连后转染TG 1感受态菌，LB培养挑取阳性克隆，抽提质粒后用EcoRI酶切电泳，片段为1580和7149bp的为反向插入，片段为3868和4861bp的为正向插入。挑取正向插入克隆扩增粘粒待用。
, 百拇医药
1.2.3 大量扩增重组粘粒 为提高重组粘粒对大肠杆菌感染效率，用λ-包装蛋白包裹重组粘粒，并感染大肠杆菌。DNA纯化试剂盒纯化粘粒DNA以备转染用。
1.2.4 转染人胚肾细胞 应用磷酸钙共沉淀方法将8μg粘粒DNA与5μl DNA-TPC转染293细胞。培养12～18h后更换培养基，悬浮细胞收集离心再接种。8h后消化重悬细胞，按1:1、1:10、1:100稀释度将细胞分别接种于三个96孔培养板上，每孔加100μl。
1.2.5 重组腺病毒株的筛选 第5天和第10天每孔补充50μl10%FCS-DMEM，选择10管细胞死亡发生在8天之后的样孔中培养液，反复冻融数次，上清保存于-80℃。
1.2.6 重组腺病毒的鉴定 用上述上清液感染293细胞及Hela细胞，293细胞受病毒感染而Hela细胞无明显病毒感染现象的克隆初步判断为重组腺病毒株，抽提感染腺病毒的293细胞中的总DNA，并用限制性核酸内切酶Xhol酶切鉴定重组腺病毒DNA结构。
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1.2.7 腺病毒鉴定 选取3个上述复制缺陷型腺病毒进行PCR和酶切鉴定。
2 结果
2.1 Ⅰ型补体受体的腺病毒重组粘粒及插入鉴定 经SwaI酶切鉴定，获取多个未被切断的重组阳性克隆。
2.2 重组粘粒插入方向鉴定 用SalI酶切，1%凝胶电泳回收8729bp大小的片段，自连后转染TG1菌，LB培养挑取阳性克隆，抽提质粒后用EcoRI酶切电泳，其中一个为正向插入阳性克隆，两个为反向插入阳性克隆(图1)。
图1 CR1重组质粒EcoRI酶切电泳结果(略)
泳道A、D为反向插入，泳道C为正向插入。
泳道B为分子量标记:250、1000、2500、5000、7500、10000、15000
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2.3 磷酸钙共沉淀后 8～15天在1:1稀释度的96孔培养板上，发现有18个样孔出现病毒噬斑(图2)。
图2 重组粘粒转染293细胞后出现噬斑(略)
经上清反复感染293细胞和Hela细胞至第四代，筛选出单克隆病毒感染株后酶切鉴定，得到15株CR1重组腺病毒。
PCR电泳可见在3300bp处有高度特异性条带，而空病毒和野生型病毒的DNA进行PCR时均不出现此条带。对PCR的产物进行SphI酶切鉴定，所得片段为2735和565bp，电泳结果与理论计算值一致。
3 讨论
生物因子在应用中遇到的最大问题是半衰期短及靶细胞外的其他副作用等，sCR 1也不例外。近来国外研究人员将基因转染作为解决这一问题的一个方向，而腺病毒是所有病毒载体中被研究得最多也是最具前途的一种。
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目前，有关基因转染研究最多的载体为腺病毒载体。和其他基因载体系统相比，腺病毒载体具有宿主范围广、感染率高;靶细胞内多拷贝高效表达;理化性质稳定;遗传毒性较低等优点。而且，有关靶细胞定向转染的研究也取得了一定的进展。但其最大的缺点是重组腺病毒的产生较复杂且效率不高。因此，用基因组DNA末端蛋白复合物和重组粘粒共同转染293细胞的方法，使重组腺病毒阳性提高了几十倍到几百倍 [5，6] 。
尽管该系统具有上述优点，但由于所用的粘粒较大，为44kb，所以使用DNA包装蛋白对提高转染率起到了至关重要的作用。同样，在鉴定粘粒载体中是否有目的基因插入及插入方向时，直接用酶切鉴定几乎是不可能的。因此，我们在用PCR粗筛后，用SalI酶切并自连成为带有目的基因的亚克隆重组质粒，进一步酶切鉴定是否有插入及插入方向。
此外，共转染的基因纯度和共转移方法的选择对同源重组率有重要影响，基因纯度高、转移效率高，则同源重组率也高;而病毒在扩增和纯化步骤中病毒活性的保护和适当的稀释度是维持较高的病毒颗粒浓度和滴度的关键。
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可溶性Ⅰ型补体受体是近年来新发现的具有较强抑制补体作用的蛋白活性因子，有关其重组腺病毒在心脏移植后抑制排异的作用国内外未见报道。本研究成功地构建了Ad.sCR 1 重组腺病毒，为进一步探索可溶性Ⅰ型补体受体在抗移植后的排异作用研究打下了坚实的基础。
参考文献
1 Craig ML，Bankovich AJ，Taylor RP.Visualization of the transfer reaction:tracking immune complexes from erythrocyte complement receptor1to macrophages.Clin Immunol，2002，105(1):36-47.
2 Pratt JR，Hibbs MJ，Laver AJ，et al.Allograft immune respose with sCR 1 intervention.Transpl Immunol，1996，4(1):72-75.
, http://www.100md.com
3 Fujiwara I，Nakajima H，Akioka K，et al.Soluble complement receptor type1and antithrombin-Ⅲcombination therapy prologns xenograft survival:the role of thrombin and prostacyclin in hyperacute rejection.Transplant Proc，1997，29(1-2):935-937.
4 Pruitt SK，Bollinger RR，Collins BH，et al.Effect of continuous complement inhibition using soluble complement receptor type1on survival of pig-to-primatecardiac xenografts.Transplantation，1997，27，63(6):900-902.
, 百拇医药
5 Miyake S，Makimura M，Kanegae Y，et al.Efficient generation of recombinant adenoviruses using adenovirus DNA-terminal protein complex and a cosmid bearing the full-lenght virus genome.Proc Natl Acad Sci USA，1996，93(3):1320-1324.
6 Kanegae Y，Lee G，Sato Y，et al.Efficient gene activation in mammalian cells by using recobinant adenovirus expressing site-specific Cre recombinase.Nucleic Acids Res，1995，23(19):3816-3821.
基金项目:国家自然科学基金资助课题(基金批准号:39870756)
作者单位:200433上海第二军医大学附属长海医院胸心外科
(编辑 元红), 百拇医药(黄盛东)
关键词 Ⅰ型补体受体 重组腺病毒
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)05-0641-02
Construction of replication-deficient recombinant
adenovirus coding sCR 1 gene
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Huang Shengdong，Gong Dejun，Xu Zhiyun，et al.
Department of Cardiothoracic Surgery，Changhai Hospital，Shanghai200433.
【Abstract】 Objective To construct the replication-deficient recombinant adenovirus coding sCR 1 gene before the studies of gene transfection to cardiac muscle of transplanted heart.Methods The sCR 1 -pAxCAwt was constructed by inserted the cDNA of interest into the SwaI site of pAxCAwt.Results The right direction of the insert was confirmed by restriction.Conclusion The direction of the insert must be confirmed by restriction analysis，and the DNA package protein is much helpful during the transfection of the recombinant cosmid to E.coli.
, 百拇医药
Key words CR 1 recombinant adenovirus
Ⅰ型补体受体(Complement receptor，I，CR 1 )广泛存在于红细胞等多种血细胞膜 [1] ，能与体内的补体活性抑制因子(Ⅰ因子)、DAF等共同抑制补体C3b、C4b的活性，减小补体本身及激发免疫细胞所造成的损伤 [2] 。近年来，国外学者成功地将CR 1 膜外段表达为可溶性的CR 1 蛋白(Soluble complement receptor I，sCR 1 )。
动物实验证明，sCR 1 能有效地抑制异种心脏移植后的超急性排斥反应，减轻心肌炎性坏死 [3，4] 。不足之处在于sCR 1 在体内半衰期较短，所需用药量较大;其次，大剂量全身性地给予sCR 1 ，会削弱受体动物抗炎性反应能力。如能将基因转染心肌原位表达sCR 1，可能会起到局部而较为持续的保护作用。本研究将CR 1 活性区基因构建成重组腺病毒，为基因治疗研究的开展打下基础。
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1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要试剂 反转录试剂盒:德国Boehringer公司产品;PCR试剂:加拿大生工公司产品;PCR引物:P 1 :ATGTGCTTGGGGAGAATGGG; P 2 :TCAGATGAGTAAAATAAAGAAGA。生工公司合成;限制性内切酶、T 4 DNA多核苷酸激酶、T 4 DNA连接酶等:美国BioLabs公司产品;DNA分子量标准品:皓嘉公司产品;腺病毒表达载体试剂盒:日本TaKaRa公司产品。质粒纯化试剂盒:德国Qiagen公司产品。DNA包装蛋白:美国Novagen公司产品。胎牛血清:GIBICO公司。
1.1.2 菌株、质粒和粘粒 PUC119质粒、大肠杆菌TG 1 菌株由复旦大学遗传学研究所提供。粘粒载体pAxCAwt及菌株LE392为日本TaKaRa公司腺病毒表达载体试剂盒所带。
, 百拇医药
1.1.3 细胞株 人胚肾细胞(293)细胞:美国ATCC公司。
1.2 方法
1.2.1 Ⅰ型补体受体的腺病毒重组粘粒构建 取1.5μg pAxCAwt粘粒，用SwaI酶切;用KpnI、NotI双酶切Ⅰ型补体受体pBVKS重组质粒，1%琼脂糖凝胶电泳回收Ⅰ型补体受体cDNA片段，用Klenow大片段将两端补平。片段DNA与粘粒DNA以20:1摩尔数比混合，加入500U高浓度T 4连接酶置16℃连接过夜。酚氯仿抽提后用DNA包装蛋白包装，转染LE392细菌，涂布加有氨苄青霉素的TB固体培养基，37℃培养过夜，挑取菌落培养抽提粘粒。
1.2.2 重组粘粒及插入方向鉴定 PCR扩增出阳性且SwaI酶切未被切断的粘粒判断为重组阳性克隆。进一步用SalI酶切，1%琼脂糖凝胶电泳回收8729bp大小的片段，自连后转染TG 1感受态菌，LB培养挑取阳性克隆，抽提质粒后用EcoRI酶切电泳，片段为1580和7149bp的为反向插入，片段为3868和4861bp的为正向插入。挑取正向插入克隆扩增粘粒待用。
, 百拇医药
1.2.3 大量扩增重组粘粒 为提高重组粘粒对大肠杆菌感染效率，用λ-包装蛋白包裹重组粘粒，并感染大肠杆菌。DNA纯化试剂盒纯化粘粒DNA以备转染用。
1.2.4 转染人胚肾细胞 应用磷酸钙共沉淀方法将8μg粘粒DNA与5μl DNA-TPC转染293细胞。培养12～18h后更换培养基，悬浮细胞收集离心再接种。8h后消化重悬细胞，按1:1、1:10、1:100稀释度将细胞分别接种于三个96孔培养板上，每孔加100μl。
1.2.5 重组腺病毒株的筛选 第5天和第10天每孔补充50μl10%FCS-DMEM，选择10管细胞死亡发生在8天之后的样孔中培养液，反复冻融数次，上清保存于-80℃。
1.2.6 重组腺病毒的鉴定 用上述上清液感染293细胞及Hela细胞，293细胞受病毒感染而Hela细胞无明显病毒感染现象的克隆初步判断为重组腺病毒株，抽提感染腺病毒的293细胞中的总DNA，并用限制性核酸内切酶Xhol酶切鉴定重组腺病毒DNA结构。
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1.2.7 腺病毒鉴定 选取3个上述复制缺陷型腺病毒进行PCR和酶切鉴定。
2 结果
2.1 Ⅰ型补体受体的腺病毒重组粘粒及插入鉴定 经SwaI酶切鉴定，获取多个未被切断的重组阳性克隆。
2.2 重组粘粒插入方向鉴定 用SalI酶切，1%凝胶电泳回收8729bp大小的片段，自连后转染TG1菌，LB培养挑取阳性克隆，抽提质粒后用EcoRI酶切电泳，其中一个为正向插入阳性克隆，两个为反向插入阳性克隆(图1)。
图1 CR1重组质粒EcoRI酶切电泳结果(略)
泳道A、D为反向插入，泳道C为正向插入。
泳道B为分子量标记:250、1000、2500、5000、7500、10000、15000
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2.3 磷酸钙共沉淀后 8～15天在1:1稀释度的96孔培养板上，发现有18个样孔出现病毒噬斑(图2)。
图2 重组粘粒转染293细胞后出现噬斑(略)
经上清反复感染293细胞和Hela细胞至第四代，筛选出单克隆病毒感染株后酶切鉴定，得到15株CR1重组腺病毒。
PCR电泳可见在3300bp处有高度特异性条带，而空病毒和野生型病毒的DNA进行PCR时均不出现此条带。对PCR的产物进行SphI酶切鉴定，所得片段为2735和565bp，电泳结果与理论计算值一致。
3 讨论
生物因子在应用中遇到的最大问题是半衰期短及靶细胞外的其他副作用等，sCR 1也不例外。近来国外研究人员将基因转染作为解决这一问题的一个方向，而腺病毒是所有病毒载体中被研究得最多也是最具前途的一种。
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目前，有关基因转染研究最多的载体为腺病毒载体。和其他基因载体系统相比，腺病毒载体具有宿主范围广、感染率高;靶细胞内多拷贝高效表达;理化性质稳定;遗传毒性较低等优点。而且，有关靶细胞定向转染的研究也取得了一定的进展。但其最大的缺点是重组腺病毒的产生较复杂且效率不高。因此，用基因组DNA末端蛋白复合物和重组粘粒共同转染293细胞的方法，使重组腺病毒阳性提高了几十倍到几百倍 [5，6] 。
尽管该系统具有上述优点，但由于所用的粘粒较大，为44kb，所以使用DNA包装蛋白对提高转染率起到了至关重要的作用。同样，在鉴定粘粒载体中是否有目的基因插入及插入方向时，直接用酶切鉴定几乎是不可能的。因此，我们在用PCR粗筛后，用SalI酶切并自连成为带有目的基因的亚克隆重组质粒，进一步酶切鉴定是否有插入及插入方向。
此外，共转染的基因纯度和共转移方法的选择对同源重组率有重要影响，基因纯度高、转移效率高，则同源重组率也高;而病毒在扩增和纯化步骤中病毒活性的保护和适当的稀释度是维持较高的病毒颗粒浓度和滴度的关键。
, http://www.100md.com
可溶性Ⅰ型补体受体是近年来新发现的具有较强抑制补体作用的蛋白活性因子，有关其重组腺病毒在心脏移植后抑制排异的作用国内外未见报道。本研究成功地构建了Ad.sCR 1 重组腺病毒，为进一步探索可溶性Ⅰ型补体受体在抗移植后的排异作用研究打下了坚实的基础。
参考文献
1 Craig ML，Bankovich AJ，Taylor RP.Visualization of the transfer reaction:tracking immune complexes from erythrocyte complement receptor1to macrophages.Clin Immunol，2002，105(1):36-47.
2 Pratt JR，Hibbs MJ，Laver AJ，et al.Allograft immune respose with sCR 1 intervention.Transpl Immunol，1996，4(1):72-75.
, http://www.100md.com
3 Fujiwara I，Nakajima H，Akioka K，et al.Soluble complement receptor type1and antithrombin-Ⅲcombination therapy prologns xenograft survival:the role of thrombin and prostacyclin in hyperacute rejection.Transplant Proc，1997，29(1-2):935-937.
4 Pruitt SK，Bollinger RR，Collins BH，et al.Effect of continuous complement inhibition using soluble complement receptor type1on survival of pig-to-primatecardiac xenografts.Transplantation，1997，27，63(6):900-902.
, 百拇医药
5 Miyake S，Makimura M，Kanegae Y，et al.Efficient generation of recombinant adenoviruses using adenovirus DNA-terminal protein complex and a cosmid bearing the full-lenght virus genome.Proc Natl Acad Sci USA，1996，93(3):1320-1324.
6 Kanegae Y，Lee G，Sato Y，et al.Efficient gene activation in mammalian cells by using recobinant adenovirus expressing site-specific Cre recombinase.Nucleic Acids Res，1995，23(19):3816-3821.
基金项目:国家自然科学基金资助课题(基金批准号:39870756)
作者单位:200433上海第二军医大学附属长海医院胸心外科
(编辑 元红), 百拇医药(黄盛东)