高压氧对脑外伤后大鼠认知功能影响的实验研究
【摘要】 目的 探讨高压氧对脑外伤后大鼠神经功能的影响。方法 应用Morris水迷宫(MWM)实验检测高压氧治疗前后脑外伤大鼠的认识功能改变。结果 高压氧能明显缩短脑外伤后大鼠逃生时间(P<0.05)。结论 高压氧能明显提高脑外伤大鼠的学习记忆功能。
关键词 颅脑外伤 高压氧 水迷宫实验
【文献标识码】 A 【文章编号】 1726-7587(2003)08-0681-03
Experimental study on cognition and spatial memory in
rats after traumatic brain injury by hyperbaric oxygenation
Zhu Zhian，Chen Xin，Ma Yanbin，et al.
, 百拇医药
Department of Neurosurgery，Bao Gang Hospital，Shanghai Second Medical University，Shanghai201900.
【Abstract】 Objective To explore the effects of hyperbaric oxygenation on cognition and spatial memory in rats after traumatic brain injuring.Methods Neurological evaluation for Cognition and Spatial memory in rats was conducted with Morris water maze.Results The escape latency was markedly shortened(P<0.05)by
HBO.Conˉclusion HBO has an obvious effects to improve cognition and spatial memory in rats.
, 百拇医药
Key words traumatic brain injury hyperbaric oxygenation Morris water maze
高压氧(HBO)治疗是指周期性呼吸超过一个大气压纯氧的治疗，国内外大量临床及实验报道其对中重度颅脑损伤具有治疗意义 [1～3] ，但有关HBO对创伤性脑损伤后神经功能，特别是认知功能影响的实验研究尚未报道。就此，我们设计了如下实验。
1 材料与方法
1.1 实验动物与分组 SD雄性大鼠18只，大鼠由中科院动物中心提供，体重260～295g，随机分为假手术组、高压氧治疗组和损伤对照组，每组各6只。
1.2 动物模型的制作 采用袁氏大鼠自由落体脑挫裂伤模型 [4] 并稍加改进，造成右顶叶较为一致的局限性脑挫裂伤(打击力为50g×15cm)、1%戊巴比妥钠(按50mg/kg体重腹腔注射)麻醉后，将动物固定于固定架上头顶部剃毛备皮后，2%的利多卡因0.2ml局麻。正中切开皮肤，分离皮下组织及骨膜至颞肌边缘充分暴露右侧顶骨，在前囟后及中线旁1mm处用牙科钻钻孔，并扩大骨窗至直径为4.5mm。避免操作硬脑膜，将动物置于打击装置(宝钢集团机械厂精密仪器车间)上，调节砝码高度至15cm处，并使撞针轻微接触骨窗处硬膜，调节打击深度为3mm，放下砝码撞针造成较为一致的以脑挫裂伤为主的损伤灶，止血后缝合皮肤。术后注意保暖和防止窒息，各组动物苏醒后回笼正常喂养，饲养条件同伤前。
, 百拇医药
1.3 高压氧治疗 动物实验用高压氧舱，购自上海701所杨园氧舱厂。治疗组于脑外伤后半小时，将大鼠置于动物氧舱内，用纯氧洗舱10min后，匀速加压10min至0.2MPa稳压30min，其间间断性给舱内输入氧以维护舱内纯氧状态，随后匀速减压20min至常压，使大鼠在常压下呼吸空气 10min，重复上述过程1次，此为1次治疗 [5] 。30min后重复治疗1次。HBO治疗每天4次，持续至脑外伤后第5天。
1.4 MWM(水迷宫)实验 用来测试大鼠空间记忆和学习能力。MWM [6，7] ，为一圆柱形不锈钢容器，由宝钢集团机械厂精密仪器车间制造，直径120cm，高60cm，容器中充有不透明(加入奶粉)温水(水温约20℃)，水面距容器顶约20cm，水面下1cm处于容器侧壁上装有一可拆卸的直径10cm的逃生平台。
将大鼠面向容器侧壁于远离逃生平台处(每次位置相同)置入水中，记录其至爬上逃生平台所花费时间(Escape Latency，EL)，于伤前4天每天测试8次，共32次，每次间隔30min，取8次之均值为当天测试值。
, http://www.100md.com
将MWM中逃生平台拆卸掉，于伤后3天将大鼠再次置入水中，观察其游泳情况，3min后将其取出。将逃生平台装于原先安放的对角位置处，再次将动物置入水中测试其EL，伤后2～5天每天8次，共计24次，每次间隔仍为30min，8次之均值为当天测试值。
1.5 统计学处理 各组数值以ˉx±s表示，组间比较采用SPSS统计软件的S-N-K方差分析法进行显著性检验。
2 结果
受伤前各组间逃生时间(EL)差异无显著性，EL呈逐渐缩短之趋势。伤后第3天，各组间亦无明显差异(图1);第4天假手术组动物EL显著短于另两组;第5天，高压氧治疗组EL显著短于损伤组(图2)3 讨论有关高压氧(HBO)在中重度颅脑外伤中的治疗作用长期存在着争论，Rockswold[8] 认为HBO治疗能够将颅脑外伤的死亡率降低50%，而无助于改善生存患者的神经功能。随着颅脑外伤救治水平的不断提高，中重度患者的抢救成活率已经今非昔比，而如何提高生存患者的生活质量则成了神经外科医生的重要任务。高压氧无疑仍是中重度颅脑外伤患者的重要治疗康复手段，本实验研究了HBO对中度颅脑外伤后大鼠神经功能的影响。
, 百拇医药
图1 各组伤前4天逃生时间(EL)略
图2 各组伤后3～5天EL，与假手术组(Sham)相比ˇP<0.01，与高压氧治疗组(HBO)相比#P<0.05 略
行为的控制是中枢神经系统的重要功能，而行为学分析是神经功能检查的一个重要组成部分。学习和记忆功能是行为学分析中的一个重要组成部分，对于高级动物的生活质量而言无疑是极其重要的，因此我们选择其作为检测指标。
检测大鼠学习和记忆功能有很多方法，其中包括诸多的迷宫实验，其中Morris水迷宫(MWM)的应用最为广泛。MWM [9] 的最大优点在于其无须食物或其他动力推动动物完成测试，因而实验结果客观性强。
我们的实验结果显示，损伤前动物的逃生时间随着实验次数的增加呈逐渐缩短的趋势，表明大鼠具备较强的学习和对周边参照物的记忆能力;而各组间数据非常接近，差异无显著性，则证实了分组的随机性和可靠性。于脑外伤后第三天，我们将大鼠放入拆卸逃生平台的MWM中，发现大鼠在原平台安放处穿越次数多于其他位置(因无水下录像及电脑分析系统，仅供参考)，表明伤后大鼠仍保留了部分对伤前测试的记忆，为保证伤后测试的准确性，我们改变了逃生平台的位置 [7] 。术后第三天的测试结果显示各组间数据仍差异无显著性，表明伤后各组动物的初始空间记忆能力是相同的。
, 百拇医药
术后第四天，损伤组的高压氧治疗组的逃生时间(EL)明显长于假手术组，表明中度脑外伤后，大鼠的学习和记忆功能的确出现了明显的减退，同时也证实了我们的脑挫裂伤动物模型是可靠的。
术后第五天，高压氧治疗组的逃生时间(EL)明显短于 损伤组的逃生时间(EL)，表明高压氧治疗组动物的学习和记忆功能好于损伤组，高压氧的确改善了中度脑外伤后大鼠的神经功能。
我们的研究表明高压氧可以改善中度颅脑外伤后的神经功能，这与Rockswold [8] 关于HBO只能降低颅脑外伤死亡率，而无助于改善存活患者神经功能的论断不一致。究其原因须从了解HBO对颅脑外伤的治疗作用的可能机理入手。
一般认为HBO治疗脑外伤有如下作用:(1)通过有效增加氧的弥散力，增加脑组织对氧的利用从而纠正脑缺氧，维持脑细胞的能量代谢，恢复可逆性损伤神经元的功能;(2)使脑血管收缩，减少局部血供从而减轻脑水肿，期间尽管局部组织的血供减少，但由于血液中氧含量的增加，因而在减轻脑水肿的同时仍能保持脑组织的氧合作用，从而降低颅内压;(3)在收缩颈动脉使脑血流减少的同时，HBO对椎动脉系统作用相反，从而使网状激活系统和脑干部分氧分压相对增加，促进昏迷觉醒和神经系
, 百拇医药
统功能恢复。
由于颅脑外伤后，患者往往伴有呼吸、消化、循环和泌尿等其他系统的损伤或处于应激代偿状态，HBO大多数是在病人病情相对稳定后才予以实施，因而失去了早期治疗的时机。而大量有关颅脑外伤的病理生理机制的研究表明，伤后早期特别是24h以内是颅脑外伤的各种继发性损伤的启动阶段 [11] 。结合上述HBO对颅脑外伤治疗作用的可能机理的分析，我们
不难发现，尽早开始高压氧治疗有利于充分发挥其治疗作用。
此外，以往研究中，HBO治疗通常是每次1h，而每天1～2次。最近有学者研究发现，HBO可以降低颅内压，但是这种降低并非持续性的，在治疗的前30min内颅内压是在平稳降低的，而30min后，颅内压反而呈现升高的趋势。因而缩短HBO治疗的次均时间至30min，而增加日均治疗次数可能提高治疗效果，我们的实验即采用了早期(伤后3天)HBO治疗，缩短次均时间，增加日均治疗次数的方案，确实收到了良好的效果。
, 百拇医药
综上所述，与前人研究相比较在认知功能的改善与否方面，出现不同结果的原因是我们改进了高压氧治疗的实施方案，更加符合HBO治疗脑损伤病理生理机制的缘故。我们的结论是:高压氧可以改善中度颅脑外伤后的认知功能;早期实施高压氧，适当缩短每次的治疗时间，而增加每天治疗次数，是高压氧治疗颅脑外伤的适宜方案。
参考文献
1 Shimazaki K，Urabe M，Monahan J，et al.Adeno-associated virus vector-mediated bcl-2gene transfer into post-ischemic gerbil brain in viˉvo:prospects for gene therapy of ischemia-induced neuronal death.Gene Ther，2000，7(14):1244-1249.
2 Banasiak KJ，Cronin T，Haddad GG.Bcl-2prolongs neuronal survival during hypoxia-induced apoptosis.Brain Res Mol Brain Res，1999，1，72(2):214-225.
, 百拇医药
3 Nakamura M，Raghupathi R，Merry DE，et al.Overexpression of Bcl-2is neuroprotective after experimental brain injury in transgenic mice.J Comp Neurol，1999，412(4):681-692.
4 Vekrellis K，Mccarthy MJ，Watson A，et al.Bax promotes neuronal cell deathand is downregulated during the development of the nervous sysˉtem.Development，1997，124:1239-1249.
5 Clark RSB，Chen J，Watkins SC，et al.Apoptosis-suppressor gene bcl-2expression after traumatic brain injury in rats.J Neurosci，1997，17:9172-9182.
, 百拇医药
6 Tsujimoto Y，Cossman J，Jaffe E，et al.Involvement of the bcl-2gene in human follicular lymphoma.Science，1985，228:1440-1443.
7 Oltvai ZN，Milliman CL，Korsmeyer SJ.Bcl-2heterodimerizes in vivo with a conserved homolog，Bax，that accelerates programmed cell death.Cell，1993，74:609-619.
8 Kluck RM，Bossy-Wetzel E，Green DR，et al.The release of cyˉtochrome C from mitochondria:a primary site for Bcl-2regulation of apoptosis.Science，1997，275:1132-1136. 9 Yang J，Liu X，Bhalla K，et al.Prevention of apoptosis by Bcl-2:reˉlease of cytochrome c from mitochondria blocked.Science，1997，275:1129-1132.
, 百拇医药
10 Li P，Ni jhawan D，Budihardjo I，et al.Cytochrome c and dATP-deˉpendent formation of Apaf-1/caspase-9complex initiate an apoptotic protease cascade.Cell，1997，91:479-489.
11 Pan G，Humke EW，Dixit VM.Activation of capases triggered by cyˉtochromec in vitro.FEBS Lett，1998，426:151-154.
作者单位:1 201900上海第二医科大学附属宝钢医院神经外科
2 上海第二医科大学神经创伤与脑血管病研究室
(收稿日期:2003-09-06)
(编辑 刘娜), 百拇医药(朱志安 陈鑫 马延斌 张红 邱建华 赵希敏 李祖晟)
关键词 颅脑外伤 高压氧 水迷宫实验
【文献标识码】 A 【文章编号】 1726-7587(2003)08-0681-03
Experimental study on cognition and spatial memory in
rats after traumatic brain injury by hyperbaric oxygenation
Zhu Zhian，Chen Xin，Ma Yanbin，et al.
, 百拇医药
Department of Neurosurgery，Bao Gang Hospital，Shanghai Second Medical University，Shanghai201900.
【Abstract】 Objective To explore the effects of hyperbaric oxygenation on cognition and spatial memory in rats after traumatic brain injuring.Methods Neurological evaluation for Cognition and Spatial memory in rats was conducted with Morris water maze.Results The escape latency was markedly shortened(P<0.05)by
HBO.Conˉclusion HBO has an obvious effects to improve cognition and spatial memory in rats.
, 百拇医药
Key words traumatic brain injury hyperbaric oxygenation Morris water maze
高压氧(HBO)治疗是指周期性呼吸超过一个大气压纯氧的治疗，国内外大量临床及实验报道其对中重度颅脑损伤具有治疗意义 [1～3] ，但有关HBO对创伤性脑损伤后神经功能，特别是认知功能影响的实验研究尚未报道。就此，我们设计了如下实验。
1 材料与方法
1.1 实验动物与分组 SD雄性大鼠18只，大鼠由中科院动物中心提供，体重260～295g，随机分为假手术组、高压氧治疗组和损伤对照组，每组各6只。
1.2 动物模型的制作 采用袁氏大鼠自由落体脑挫裂伤模型 [4] 并稍加改进，造成右顶叶较为一致的局限性脑挫裂伤(打击力为50g×15cm)、1%戊巴比妥钠(按50mg/kg体重腹腔注射)麻醉后，将动物固定于固定架上头顶部剃毛备皮后，2%的利多卡因0.2ml局麻。正中切开皮肤，分离皮下组织及骨膜至颞肌边缘充分暴露右侧顶骨，在前囟后及中线旁1mm处用牙科钻钻孔，并扩大骨窗至直径为4.5mm。避免操作硬脑膜，将动物置于打击装置(宝钢集团机械厂精密仪器车间)上，调节砝码高度至15cm处，并使撞针轻微接触骨窗处硬膜，调节打击深度为3mm，放下砝码撞针造成较为一致的以脑挫裂伤为主的损伤灶，止血后缝合皮肤。术后注意保暖和防止窒息，各组动物苏醒后回笼正常喂养，饲养条件同伤前。
, 百拇医药
1.3 高压氧治疗 动物实验用高压氧舱，购自上海701所杨园氧舱厂。治疗组于脑外伤后半小时，将大鼠置于动物氧舱内，用纯氧洗舱10min后，匀速加压10min至0.2MPa稳压30min，其间间断性给舱内输入氧以维护舱内纯氧状态，随后匀速减压20min至常压，使大鼠在常压下呼吸空气 10min，重复上述过程1次，此为1次治疗 [5] 。30min后重复治疗1次。HBO治疗每天4次，持续至脑外伤后第5天。
1.4 MWM(水迷宫)实验 用来测试大鼠空间记忆和学习能力。MWM [6，7] ，为一圆柱形不锈钢容器，由宝钢集团机械厂精密仪器车间制造，直径120cm，高60cm，容器中充有不透明(加入奶粉)温水(水温约20℃)，水面距容器顶约20cm，水面下1cm处于容器侧壁上装有一可拆卸的直径10cm的逃生平台。
将大鼠面向容器侧壁于远离逃生平台处(每次位置相同)置入水中，记录其至爬上逃生平台所花费时间(Escape Latency，EL)，于伤前4天每天测试8次，共32次，每次间隔30min，取8次之均值为当天测试值。
, http://www.100md.com
将MWM中逃生平台拆卸掉，于伤后3天将大鼠再次置入水中，观察其游泳情况，3min后将其取出。将逃生平台装于原先安放的对角位置处，再次将动物置入水中测试其EL，伤后2～5天每天8次，共计24次，每次间隔仍为30min，8次之均值为当天测试值。
1.5 统计学处理 各组数值以ˉx±s表示，组间比较采用SPSS统计软件的S-N-K方差分析法进行显著性检验。
2 结果
受伤前各组间逃生时间(EL)差异无显著性，EL呈逐渐缩短之趋势。伤后第3天，各组间亦无明显差异(图1);第4天假手术组动物EL显著短于另两组;第5天，高压氧治疗组EL显著短于损伤组(图2)3 讨论有关高压氧(HBO)在中重度颅脑外伤中的治疗作用长期存在着争论，Rockswold[8] 认为HBO治疗能够将颅脑外伤的死亡率降低50%，而无助于改善生存患者的神经功能。随着颅脑外伤救治水平的不断提高，中重度患者的抢救成活率已经今非昔比，而如何提高生存患者的生活质量则成了神经外科医生的重要任务。高压氧无疑仍是中重度颅脑外伤患者的重要治疗康复手段，本实验研究了HBO对中度颅脑外伤后大鼠神经功能的影响。
, 百拇医药
图1 各组伤前4天逃生时间(EL)略
图2 各组伤后3～5天EL，与假手术组(Sham)相比ˇP<0.01，与高压氧治疗组(HBO)相比#P<0.05 略
行为的控制是中枢神经系统的重要功能，而行为学分析是神经功能检查的一个重要组成部分。学习和记忆功能是行为学分析中的一个重要组成部分，对于高级动物的生活质量而言无疑是极其重要的，因此我们选择其作为检测指标。
检测大鼠学习和记忆功能有很多方法，其中包括诸多的迷宫实验，其中Morris水迷宫(MWM)的应用最为广泛。MWM [9] 的最大优点在于其无须食物或其他动力推动动物完成测试，因而实验结果客观性强。
我们的实验结果显示，损伤前动物的逃生时间随着实验次数的增加呈逐渐缩短的趋势，表明大鼠具备较强的学习和对周边参照物的记忆能力;而各组间数据非常接近，差异无显著性，则证实了分组的随机性和可靠性。于脑外伤后第三天，我们将大鼠放入拆卸逃生平台的MWM中，发现大鼠在原平台安放处穿越次数多于其他位置(因无水下录像及电脑分析系统，仅供参考)，表明伤后大鼠仍保留了部分对伤前测试的记忆，为保证伤后测试的准确性，我们改变了逃生平台的位置 [7] 。术后第三天的测试结果显示各组间数据仍差异无显著性，表明伤后各组动物的初始空间记忆能力是相同的。
, 百拇医药
术后第四天，损伤组的高压氧治疗组的逃生时间(EL)明显长于假手术组，表明中度脑外伤后，大鼠的学习和记忆功能的确出现了明显的减退，同时也证实了我们的脑挫裂伤动物模型是可靠的。
术后第五天，高压氧治疗组的逃生时间(EL)明显短于 损伤组的逃生时间(EL)，表明高压氧治疗组动物的学习和记忆功能好于损伤组，高压氧的确改善了中度脑外伤后大鼠的神经功能。
我们的研究表明高压氧可以改善中度颅脑外伤后的神经功能，这与Rockswold [8] 关于HBO只能降低颅脑外伤死亡率，而无助于改善存活患者神经功能的论断不一致。究其原因须从了解HBO对颅脑外伤的治疗作用的可能机理入手。
一般认为HBO治疗脑外伤有如下作用:(1)通过有效增加氧的弥散力，增加脑组织对氧的利用从而纠正脑缺氧，维持脑细胞的能量代谢，恢复可逆性损伤神经元的功能;(2)使脑血管收缩，减少局部血供从而减轻脑水肿，期间尽管局部组织的血供减少，但由于血液中氧含量的增加，因而在减轻脑水肿的同时仍能保持脑组织的氧合作用，从而降低颅内压;(3)在收缩颈动脉使脑血流减少的同时，HBO对椎动脉系统作用相反，从而使网状激活系统和脑干部分氧分压相对增加，促进昏迷觉醒和神经系
, 百拇医药
统功能恢复。
由于颅脑外伤后，患者往往伴有呼吸、消化、循环和泌尿等其他系统的损伤或处于应激代偿状态，HBO大多数是在病人病情相对稳定后才予以实施，因而失去了早期治疗的时机。而大量有关颅脑外伤的病理生理机制的研究表明，伤后早期特别是24h以内是颅脑外伤的各种继发性损伤的启动阶段 [11] 。结合上述HBO对颅脑外伤治疗作用的可能机理的分析，我们
不难发现，尽早开始高压氧治疗有利于充分发挥其治疗作用。
此外，以往研究中，HBO治疗通常是每次1h，而每天1～2次。最近有学者研究发现，HBO可以降低颅内压，但是这种降低并非持续性的，在治疗的前30min内颅内压是在平稳降低的，而30min后，颅内压反而呈现升高的趋势。因而缩短HBO治疗的次均时间至30min，而增加日均治疗次数可能提高治疗效果，我们的实验即采用了早期(伤后3天)HBO治疗，缩短次均时间，增加日均治疗次数的方案，确实收到了良好的效果。
, 百拇医药
综上所述，与前人研究相比较在认知功能的改善与否方面，出现不同结果的原因是我们改进了高压氧治疗的实施方案，更加符合HBO治疗脑损伤病理生理机制的缘故。我们的结论是:高压氧可以改善中度颅脑外伤后的认知功能;早期实施高压氧，适当缩短每次的治疗时间，而增加每天治疗次数，是高压氧治疗颅脑外伤的适宜方案。
参考文献
1 Shimazaki K，Urabe M，Monahan J，et al.Adeno-associated virus vector-mediated bcl-2gene transfer into post-ischemic gerbil brain in viˉvo:prospects for gene therapy of ischemia-induced neuronal death.Gene Ther，2000，7(14):1244-1249.
2 Banasiak KJ，Cronin T，Haddad GG.Bcl-2prolongs neuronal survival during hypoxia-induced apoptosis.Brain Res Mol Brain Res，1999，1，72(2):214-225.
, 百拇医药
3 Nakamura M，Raghupathi R，Merry DE，et al.Overexpression of Bcl-2is neuroprotective after experimental brain injury in transgenic mice.J Comp Neurol，1999，412(4):681-692.
4 Vekrellis K，Mccarthy MJ，Watson A，et al.Bax promotes neuronal cell deathand is downregulated during the development of the nervous sysˉtem.Development，1997，124:1239-1249.
5 Clark RSB，Chen J，Watkins SC，et al.Apoptosis-suppressor gene bcl-2expression after traumatic brain injury in rats.J Neurosci，1997，17:9172-9182.
, 百拇医药
6 Tsujimoto Y，Cossman J，Jaffe E，et al.Involvement of the bcl-2gene in human follicular lymphoma.Science，1985，228:1440-1443.
7 Oltvai ZN，Milliman CL，Korsmeyer SJ.Bcl-2heterodimerizes in vivo with a conserved homolog，Bax，that accelerates programmed cell death.Cell，1993，74:609-619.
8 Kluck RM，Bossy-Wetzel E，Green DR，et al.The release of cyˉtochrome C from mitochondria:a primary site for Bcl-2regulation of apoptosis.Science，1997，275:1132-1136. 9 Yang J，Liu X，Bhalla K，et al.Prevention of apoptosis by Bcl-2:reˉlease of cytochrome c from mitochondria blocked.Science，1997，275:1129-1132.
, 百拇医药
10 Li P，Ni jhawan D，Budihardjo I，et al.Cytochrome c and dATP-deˉpendent formation of Apaf-1/caspase-9complex initiate an apoptotic protease cascade.Cell，1997，91:479-489.
11 Pan G，Humke EW，Dixit VM.Activation of capases triggered by cyˉtochromec in vitro.FEBS Lett，1998，426:151-154.
作者单位:1 201900上海第二医科大学附属宝钢医院神经外科
2 上海第二医科大学神经创伤与脑血管病研究室
(收稿日期:2003-09-06)
(编辑 刘娜), 百拇医药(朱志安 陈鑫 马延斌 张红 邱建华 赵希敏 李祖晟)