尼莫同治疗小鼠脑梗塞的时间窗研究
【摘要】 目的 研究尼莫同治疗小鼠脑梗塞的最佳时机。方法 经右侧颈总动脉将尼龙单丝线栓至大脑中动脉造成永久性缺血模型。经尾静脉及腹腔给药。动物均于术后第7天处死取脑，用TTC染色、图像分析仪测定脑梗塞体积。结果 单缺组脑梗塞体积最大，术后6h以内及术前给药组脑梗塞体积较小，术后12h以后给药组脑梗塞体积介于两者之间。结论 术前及术后6h以内给药可使小鼠脑梗塞体积减少，这一段时间可能为治疗时间窗。
关键词 尼莫同 脑梗塞 小鼠 时间窗
【文献标识码】 A 【文章编号】 1726-7587(2003)08-0684-02
Therapeutic time window of nimotop in focal cerebral ischemia of mice
He Guohou，Xi Gangming，Wei Guoyao，et al.
, http://www.100md.com
Department of Neurology，Taihe Hospital Afiliated to Yunyang Medical College，Shiyan，Hubei442000.
【Abstract】 Objective To find out the therapeutic time window of nimotop in focal cerebral ischemia of mice.Methods Focal ischemic models of middle cerebral artery occlusion(MCAO)were established by inserting nylon monofilament through the right common carotid artery into the anterior cerebral artery.Nimotop was injected through caudal vein and abdominal cavity.The infarct size were measured by TTC stain and image analyzer.Results The inˉfarct volume was the biggest in untreatment group，the smallest in preoperative treatment and postoperative treatment group within6h，but the infarct size didn’t reduce administration after
, http://www.100md.com
12h.Conclusion The optimal therapeutic time window of nimotop is less than6h after MCAO of mice.
Key words nimotop cerebral infarction mice time window
脑血流完全阻断后，缺血脑组织迅速产生不可逆性损伤，尤以缺血中心区往往为不可逆性损伤。但缺血周边区，即
半暗带，不可逆性损伤比较缓慢，通过治疗干预是有可能被挽救的。但缺血半暗带的存在有一定的时限性，即挽救缺血半暗带存在着治疗时间窗，在时间窗内给予治疗是有效的。尼莫地平是一种L型钙通道拮抗剂，可抑制电压调节和受体依赖性钙通道、减少因钙离子内流所致的脑细胞死亡。在应用尼莫地平治疗急性缺血卒中的10余年研究中，对其疗效评价仍未取得
, http://www.100md.com
一致，可能与开始治疗的时机差异有关。因此，合理选择时机，适时使用尼莫地平，寻找其有效治疗时间窗，显得非常重要。本研究选择小鼠为观察对象，建立大脑中动脉栓线模型，应用TTC染色，观察梗塞体积的变化，以及尼莫同治疗干预情况，以确定尼莫同治疗时间窗，以指导临床应用。
1 材料和方法
1.1 实验动物与分组 健康雄性昆明小鼠84只，平均体重(32.40±4.28)g，从武汉大学医学院动物实验中心购得。在自然光线下饲养1周后，随机分为单纯缺血组，缺血前预防给药组，缺血后0、1、2、3、4、5、6、12、24、48、72h给药组，假手术组，共14组，每组6只动物。
1.2 小鼠大脑中动脉栓线模型的制作 用10%水合氯醛(0.03ml/10g体重)腹腔注射麻醉动物后，仰卧位固定于手术台上，沿颈前正中剪开约1cm长的切口。在SXP-1B手术显微镜下，依次暴露右侧颈总动脉，颈外动脉起始部，翼腭动脉。结扎颈外动脉和翼腭动脉起始部。然后将颈总动 脉近心端结扎，靠近分叉部套一结扎线，并上一微型动脉夹。于两线之间，将颈总动脉剪一小口，根据动物大小选择0.2号、0.3号或0.4号尼龙单丝线，迅速经切口插入，松开动脉夹，继续插入。当丝线进入约9mm时，即有轻微的阻挡感，立即停止送线。此时线的头端恰好抵达大脑前中动脉分叉部。结扎分叉部位的丝线。剪除多余的单丝线。于切口内点入几滴庆大霉素后，逐层缝合软组织及皮肤，再消毒后，置于红外灯下保温。
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1.3 给药方法 尼莫同由Bayer公司生产，每瓶50ml，含尼莫通10mg，首次经尾静脉给药1次，以后每日经腹腔给药1次。给药量按每日每公斤体重30μg换算。
1.4 脑梗塞体积的测定 各组小鼠手术后第7天，麻醉后立即取脑，置-70℃低温冰箱冷冻后，切成2mm厚的冠状脑片。用2%TTC(红四氮唑，用0.1MPB配制)，于37℃染色30min，正常脑组织呈红色，梗塞脑组织呈白色。
将TTC染色的脑片裱于玻片上，每个脑所切得的脑片裱于一张玻片上，用摄像机录入电脑内，用图像处理软件，测定每张脑片上的梗塞面积，乘以脑片的厚度，即得脑片梗塞体积的近似值，所有脑片的梗塞体积之和，即为脑的总的梗塞体积。如图1所示。
图1 小鼠脑冠状切片，TTC染色，白色区为梗死灶 略
1.5 统计学处理 所有原始数据建立数据库，用Excel统计软件，进行分析。
, 百拇医药
2 结果
术前、术后不同时间点给药，第7天观察脑梗塞体积情 况。见表1和图2。可见术前及6h以内给药组，梗塞体积均较小，与其他各时间点给药组相比，差异均有显著性(P<0.05)。假手术组未发生脑梗塞。
图2不同时间点给药小鼠脑梗塞体积柱形图 略
表1 不同时间开始给药第7天时梗塞体积(ˉx±s)略
3 讨论
本研究证实了尼莫同的有效性，并存在治疗时间窗。术后不同时间开始给药，效果明显不同，即6h内给药，梗塞体积明显缩小，而12h后给药，梗塞体积明显扩大，几乎接近单纯缺血组。这说明尼莫同治疗的时间窗小于6h。
从小鼠脑梗塞病灶的冠状切面上看，单纯缺血组表现为整个半球的梗死，即梗塞病灶包括皮质，整个基底节。而用药组(不论术前用药，还是术后即刻用药组)均表现为皮质梗塞，而基底节仅部分受累，说明皮质是中心缺血区，而皮质下主要是基底节为半暗带，与模型本身的特点有关，即栓线部位为大脑中动脉主干，那么越靠近主干的部分缺血越严重，越远离主干部位，缺血相对较轻。一方面依靠与大脑前、后动脉的侧支循环而重新建立血液循环，挽救了交界部位的神经元，尼莫同的使用，促成了这种侧支循环的建 立。另一方面，尼莫同通过阻止大量Ca 2+ 在脑细胞内蓄积，增加了脑组织对缺血和缺氧的耐受能力，使得半暗带区的神经元有机会等待侧支循环的建立，而重新获得赖以生存的氧分。
, http://www.100md.com
冯玉兰等应用尼莫地平治疗大面积脑梗塞的临床研究发现，尼莫地平可明显缩小梗塞灶的体积，并建议发病在6～12h内应用效果更好 [1，2] 。彭永高进行双盲安慰剂对照研究发现尼莫地平对急性缺血性脑血管病的显效率明显优于对照组，但总有效率差异无显著性 [3] 。本研究结果与上述结论基本一致，即尼莫同可明显缩小梗塞灶体积，且用药时间越早越好。
国外也有不少学者认为，使用尼莫地平治疗脑梗塞，可以缩小最终脑梗塞体积 [4，5]。但也有作者认为超早期尼莫地平的使用对脑梗塞病人并无多大益处 [6] 。可能存在着种族差异，或由用药剂量及观察角度不同所造成。
参考文献
1 冯玉兰，于峻，邵京山.尼莫地平治疗大面积脑栓塞的临床研究.中国临床医学，2002，9(3):277-278.
, http://www.100md.com
2 赵振升，华正进.尼莫地平治疗急性脑梗塞的CT对照分析.河北医药，2000，22(5):380.
3 彭永，资晓宏，宋治，等.尼莫地平胶囊治疗脑血管病的双盲安慰剂对照研究.中国医师杂志，2002，4(5):273-275.
4 Fogelhom R，Erilat，Palomaki，et al.Effect of nimodipine on final infarct volume after acute ischemic stroke.Cerebrovasc Dis，2000，10(3):189-193.
5 Lanier WL.The prevention and treatment of cerebral ischemia.Can J Anaesth，1999，46(5ptz):R46-56.
6 Horn J，de Hean RJ，Verneulen M，et al.Very Early Nimodipine use in stroke(VENUS):a randomized，double-blind，placebo controlled trial.Stroke，2001，32(2):461-465.
作者单位:442000湖北省十堰市太和医院神经内科
(收稿日期:2003-09-01)
(编辑 刘娜), 百拇医药(何国厚)
关键词 尼莫同 脑梗塞 小鼠 时间窗
【文献标识码】 A 【文章编号】 1726-7587(2003)08-0684-02
Therapeutic time window of nimotop in focal cerebral ischemia of mice
He Guohou，Xi Gangming，Wei Guoyao，et al.
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Department of Neurology，Taihe Hospital Afiliated to Yunyang Medical College，Shiyan，Hubei442000.
【Abstract】 Objective To find out the therapeutic time window of nimotop in focal cerebral ischemia of mice.Methods Focal ischemic models of middle cerebral artery occlusion(MCAO)were established by inserting nylon monofilament through the right common carotid artery into the anterior cerebral artery.Nimotop was injected through caudal vein and abdominal cavity.The infarct size were measured by TTC stain and image analyzer.Results The inˉfarct volume was the biggest in untreatment group，the smallest in preoperative treatment and postoperative treatment group within6h，but the infarct size didn’t reduce administration after
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12h.Conclusion The optimal therapeutic time window of nimotop is less than6h after MCAO of mice.
Key words nimotop cerebral infarction mice time window
脑血流完全阻断后，缺血脑组织迅速产生不可逆性损伤，尤以缺血中心区往往为不可逆性损伤。但缺血周边区，即
半暗带，不可逆性损伤比较缓慢，通过治疗干预是有可能被挽救的。但缺血半暗带的存在有一定的时限性，即挽救缺血半暗带存在着治疗时间窗，在时间窗内给予治疗是有效的。尼莫地平是一种L型钙通道拮抗剂，可抑制电压调节和受体依赖性钙通道、减少因钙离子内流所致的脑细胞死亡。在应用尼莫地平治疗急性缺血卒中的10余年研究中，对其疗效评价仍未取得
, http://www.100md.com
一致，可能与开始治疗的时机差异有关。因此，合理选择时机，适时使用尼莫地平，寻找其有效治疗时间窗，显得非常重要。本研究选择小鼠为观察对象，建立大脑中动脉栓线模型，应用TTC染色，观察梗塞体积的变化，以及尼莫同治疗干预情况，以确定尼莫同治疗时间窗，以指导临床应用。
1 材料和方法
1.1 实验动物与分组 健康雄性昆明小鼠84只，平均体重(32.40±4.28)g，从武汉大学医学院动物实验中心购得。在自然光线下饲养1周后，随机分为单纯缺血组，缺血前预防给药组，缺血后0、1、2、3、4、5、6、12、24、48、72h给药组，假手术组，共14组，每组6只动物。
1.2 小鼠大脑中动脉栓线模型的制作 用10%水合氯醛(0.03ml/10g体重)腹腔注射麻醉动物后，仰卧位固定于手术台上，沿颈前正中剪开约1cm长的切口。在SXP-1B手术显微镜下，依次暴露右侧颈总动脉，颈外动脉起始部，翼腭动脉。结扎颈外动脉和翼腭动脉起始部。然后将颈总动 脉近心端结扎，靠近分叉部套一结扎线，并上一微型动脉夹。于两线之间，将颈总动脉剪一小口，根据动物大小选择0.2号、0.3号或0.4号尼龙单丝线，迅速经切口插入，松开动脉夹，继续插入。当丝线进入约9mm时，即有轻微的阻挡感，立即停止送线。此时线的头端恰好抵达大脑前中动脉分叉部。结扎分叉部位的丝线。剪除多余的单丝线。于切口内点入几滴庆大霉素后，逐层缝合软组织及皮肤，再消毒后，置于红外灯下保温。
, http://www.100md.com
1.3 给药方法 尼莫同由Bayer公司生产，每瓶50ml，含尼莫通10mg，首次经尾静脉给药1次，以后每日经腹腔给药1次。给药量按每日每公斤体重30μg换算。
1.4 脑梗塞体积的测定 各组小鼠手术后第7天，麻醉后立即取脑，置-70℃低温冰箱冷冻后，切成2mm厚的冠状脑片。用2%TTC(红四氮唑，用0.1MPB配制)，于37℃染色30min，正常脑组织呈红色，梗塞脑组织呈白色。
将TTC染色的脑片裱于玻片上，每个脑所切得的脑片裱于一张玻片上，用摄像机录入电脑内，用图像处理软件，测定每张脑片上的梗塞面积，乘以脑片的厚度，即得脑片梗塞体积的近似值，所有脑片的梗塞体积之和，即为脑的总的梗塞体积。如图1所示。
图1 小鼠脑冠状切片，TTC染色，白色区为梗死灶 略
1.5 统计学处理 所有原始数据建立数据库，用Excel统计软件，进行分析。
, 百拇医药
2 结果
术前、术后不同时间点给药，第7天观察脑梗塞体积情 况。见表1和图2。可见术前及6h以内给药组，梗塞体积均较小，与其他各时间点给药组相比，差异均有显著性(P<0.05)。假手术组未发生脑梗塞。
图2不同时间点给药小鼠脑梗塞体积柱形图 略
表1 不同时间开始给药第7天时梗塞体积(ˉx±s)略
3 讨论
本研究证实了尼莫同的有效性，并存在治疗时间窗。术后不同时间开始给药，效果明显不同，即6h内给药，梗塞体积明显缩小，而12h后给药，梗塞体积明显扩大，几乎接近单纯缺血组。这说明尼莫同治疗的时间窗小于6h。
从小鼠脑梗塞病灶的冠状切面上看，单纯缺血组表现为整个半球的梗死，即梗塞病灶包括皮质，整个基底节。而用药组(不论术前用药，还是术后即刻用药组)均表现为皮质梗塞，而基底节仅部分受累，说明皮质是中心缺血区，而皮质下主要是基底节为半暗带，与模型本身的特点有关，即栓线部位为大脑中动脉主干，那么越靠近主干的部分缺血越严重，越远离主干部位，缺血相对较轻。一方面依靠与大脑前、后动脉的侧支循环而重新建立血液循环，挽救了交界部位的神经元，尼莫同的使用，促成了这种侧支循环的建 立。另一方面，尼莫同通过阻止大量Ca 2+ 在脑细胞内蓄积，增加了脑组织对缺血和缺氧的耐受能力，使得半暗带区的神经元有机会等待侧支循环的建立，而重新获得赖以生存的氧分。
, http://www.100md.com
冯玉兰等应用尼莫地平治疗大面积脑梗塞的临床研究发现，尼莫地平可明显缩小梗塞灶的体积，并建议发病在6～12h内应用效果更好 [1，2] 。彭永高进行双盲安慰剂对照研究发现尼莫地平对急性缺血性脑血管病的显效率明显优于对照组，但总有效率差异无显著性 [3] 。本研究结果与上述结论基本一致，即尼莫同可明显缩小梗塞灶体积，且用药时间越早越好。
国外也有不少学者认为，使用尼莫地平治疗脑梗塞，可以缩小最终脑梗塞体积 [4，5]。但也有作者认为超早期尼莫地平的使用对脑梗塞病人并无多大益处 [6] 。可能存在着种族差异，或由用药剂量及观察角度不同所造成。
参考文献
1 冯玉兰，于峻，邵京山.尼莫地平治疗大面积脑栓塞的临床研究.中国临床医学，2002，9(3):277-278.
, http://www.100md.com
2 赵振升，华正进.尼莫地平治疗急性脑梗塞的CT对照分析.河北医药，2000，22(5):380.
3 彭永，资晓宏，宋治，等.尼莫地平胶囊治疗脑血管病的双盲安慰剂对照研究.中国医师杂志，2002，4(5):273-275.
4 Fogelhom R，Erilat，Palomaki，et al.Effect of nimodipine on final infarct volume after acute ischemic stroke.Cerebrovasc Dis，2000，10(3):189-193.
5 Lanier WL.The prevention and treatment of cerebral ischemia.Can J Anaesth，1999，46(5ptz):R46-56.
6 Horn J，de Hean RJ，Verneulen M，et al.Very Early Nimodipine use in stroke(VENUS):a randomized，double-blind，placebo controlled trial.Stroke，2001，32(2):461-465.
作者单位:442000湖北省十堰市太和医院神经内科
(收稿日期:2003-09-01)
(编辑 刘娜), 百拇医药(何国厚)