冷冻法与免疫抑制剂法对鼠异体神经移植影响的比较研究
【摘要】 目的 探讨应用冷冻法与免疫抑制剂法对同种异体鼠坐骨神经再生效果的比较。方法 实验分为新鲜自体神经移植组、新鲜异体神经移植组、供体神经冷冻后异体神经移植组、异体神经移植后应用免疫抑制剂组。于移植后3周各组分别进行电生理学、组织学、电镜、混合淋巴细胞培养及迟发性超敏反应检测神经移植效果。结果 各组神经移植效果由优至差排序为自体神经移植组、冷冻神经移植组、应用免疫抑制剂组、新鲜异体神经移植组。结论 周围神经的细胞成分可被低温保存，移植后可存活并具功能，冷冻法优于应用免疫抑制剂法。
关键词 同种异体 免疫 周围神经
【文献标识码】 A 【文章编号】 1726-7587(2003)08-0673-03
Comparison study on affection between cryotherapy and immunosuppressive
, 百拇医药
agent for allograft of rat sciatic nerve
Meng Qinggang，Yue Qi，Ma Yongsheng
The First Affiliated Hospital，Haerbin Medical University，Haerbin150001.
【Abstract】 Objective To compare on affection between cryotherapy and immunosuppressive agent for alloˉgraft of rat sciatic nerve.Methods The experimentanimals were divided into fresh autograft group，fresh allograft group，autograft group of freezing donor nerve and allograft group of freezing donor nerve with immunosuppressive aˉgent.The electric physiology，histology，electromicroscope，mixed lymphocyte culture and delayed super-allergy reacˉtion of transplantation nerve were detected3weeks later after transplantation.Results The effect of nerve transplantaˉtion sequenced from better to worse:fresh autograft group，autograft group of freezing donor nerve，allograft group of freezing donor nerve with immunosuppressive agent and fresh allograft group.Conclusion The cellular component of peripheral nerve could be preserved with lowtemperature.Cryotherapy could decrease lymphocyte immigrating to transˉplanted tissue.The effect of cryot
, 百拇医药
herapy transplantation might be better than that in immunosuppressive agent group.
Key words cryotherapy allograft immunology peripheral nerve
周围神经损伤导致神经缺损的修复，尤其是对于长段主要神经干缺损的修复在临床中一直是较难处理的问题。虽然自体神经移植效果良好，但由于其来源有限，同时又常给供区带来功能损害，因而限制了其在临床中的应用。本实验通过研究经冷冻处理的供体坐骨神经移植后免疫学方面的变化，并与神经移植后应用免疫抑制剂方法进行对比，以进一步探讨神经移植物移植成活的机理，为临床寻找大段周围神经缺损移植提供理论依据。
1 资料与方法
1.1 实验动物与分组 取受体Balb/c(H-2 b )雄性小鼠30只(北京动物实验中心提供)，供体鼠C 57 BL/6(H-2 b )雄性小鼠40只，6～8周龄，体重为(20±2)g，随机分为四组，每组小鼠10只。A组:新鲜自体坐骨神经移植组。B组:新鲜异体坐骨神经移植组。C组:移植前将异体基因供体神经经-196℃冷冻3周后移植。D组:新鲜异体坐骨神经移植同时应用免疫抑制剂组，于移植前3天开始腹腔注射环孢素A，每天1次，注射剂量为10mg·kg -1 ·d -1。
, 百拇医药
1.2 神经移植 将小鼠麻醉后俯卧位固定四肢，于手术显微镜下自股二头肌与半腱肌、半膜肌间隙剪开结缔组织。 钝性分离股二头肌与半腱肌，显露坐骨神经，由犁状肌孔下0.5cm处整齐剪下0.2cm长的坐骨神经，然后移植供体鼠坐骨神经，并于16倍显微镜下用11-0无损伤线缝合神经外膜4～6针，缝合皮肤。
1.3 神经电生理学检查 神经于移植3周后，取各组受体鼠，切开股后部暴露坐骨神经移植段，将刺激电极置入移植段神经近端，记录电极斜行45°插入胫骨前肌肌腹中部，两刺激电极距离为2.0cm，测量运动神经传导速度。
1.4 组织学检查 神经于移植3周后，取各组小鼠神经移植段，经戊二醛和多聚甲醛混合固定后，用环氧树脂包埋，切制半薄与超薄切片，进行光镜与电镜检查。
1.5 免疫学检测 于神经移植后3周，取各组小鼠进行混合淋巴细胞培养与诱导迟发性超敏反应检查。
, 百拇医药
1.5.1 混合淋巴细胞培养 于96孔培养板中加入刺激细胞和反应细胞各100μl，刺激细胞数为1×10 6 /ml，预先以丝裂霉素C(MMC)37℃处理30min。反应细胞的浓度为1×10 5 /ml，自体移植组的刺激细胞为受体的自体细胞。每个实验组设3个复孔，单独刺激细胞和单独反应细胞作为阴性对照孔，37℃、5%CO 2 培养6天，结束前18h掺入 3 H-TDR，每孔加入0.5μCi，继续培养至结束。用细胞收集器将细胞收集在49型玻璃纤维滤纸上，滤纸干燥后放入装有闪烁液的闪瓶中，用液闪仪计数cpm值。
1.5.2 诱导迟发性超敏反应 取供体鼠的脾脏配制新鲜脾细胞悬液，细胞浓度为1×10 7/ml，对受体组的小鼠后肢左侧足垫皮内注射供体鼠的脾细胞悬液100μl，对照侧注射Hanks液100μl，24h后测量足垫厚度，计算两侧足垫的厚度差。
, http://www.100md.com 1.6 统计学方法 计量数据以均数±标准差(ˉx±s)表示，采用t检验。
2 结果
2.1 电生理学检查结果 各组运动神经传导速度的测定结果，A组优于C组、D组，C组与D组优于B组，且C组与D组间差异有非常显著性(P<0.01)，见表1。
表1 各组的运动神经传导速度 m/s
2.2 组织学检查结果 A组可见神经纤维走行正常，神经纤维间可见血管增生，束膜周围可见淋巴细胞浸润。B组可见神经纤维束膜水肿明显，周围可见大量淋巴细胞浸润，神经纤维数量减少，排列紊乱。C组可见神经纤维排列紊乱，有少量炎性细胞浸润。D组可见神经纤维数量增加，排列稍紊乱，神经纤维束之间水肿轻，可见淋巴细胞浸润。
2.3 电镜检查结果 A组可见神经纤维内有大量的再生髓鞘与轴突，许旺氏细胞功能活跃，内质网发达，游离核蛋白体丰富，新生轴突内微丝密集排列，线粒体较大，轴膜清晰可见。B组可见大部分神经纤维脱髓鞘崩解，轴突消失，未见有再生的神经纤维。C组可见部分神经纤维脱髓鞘，呈葱皮样改变，有较多的再生神经纤维。D组可见新生的神经纤维和许旺氏细胞明显多于崩解的神经纤维。
, http://www.100md.com
2.4 免疫学检查结果
2.4.1 混合淋巴细胞培养 B组对供体小鼠淋巴细胞的刺激呈正常反应，C组与D组对供体小鼠淋巴细胞的刺激反应性减弱，并且两者之间的差异有非常显著性(P<0.01)。见表2。
表2 各组的混合淋巴细胞培养 cpm略组
2.4.2 受体对供体鼠的迟发性超敏反应 B组对供体小鼠的淋巴细胞呈良好的迟发性超敏反应，而C组、D组对供 体小鼠的淋巴细胞的迟发性超敏反应性降低，并且两者之间差异有非常显著性(P<0.01)，见表3。
表3 各组的迟发性超敏反应 cpm略
3 讨论
自1878年Albert首次进行人类异体神经移植报道以来，国内外学者主要集中在解决异体神经移植的免疫排斥反应问题上 [1，2] 。目前多数研究认为降低或减弱异体周围神经移植的免疫排斥反应的方法有两大类 [3] ，一类是抑制受体的免疫机能，可防止机体对异体神经移植排斥反应;另一类是降低异体神经移植物免疫抗原性，如冷冻预变性处理。但冷冻法与免疫抑制剂法哪种效果为最佳，国内尚未见报道。本项研究受体组与供体组分别采用不同基因型的小鼠，移植后电生理学检查结果A组为42.250m/s，优于B组、C组、D组，且D组略优于C组，说明从运动神经传导速度来看，冷冻组与应用免疫抑制剂组相近。组织学及电镜检查结果显示C组与D组均可见再生神经纤维。受体对供体鼠的迟发性超敏反应B组为(1.325±0.086)cpm，对供体小鼠的淋巴细胞呈良好的迟发性超敏反应，C组为(0.854±0.105)cpm、D组为(1.127±0.057)cpm，对供体小鼠的淋巴细胞迟发性超敏反应性降低，而且两组之间差异有非常显著性(P<0.01)，即C组优于D组。各组的混合淋巴细胞培养结果B组为(4312.311±534.156)cpm，对供体小鼠淋巴细胞刺激呈正常反应，C组为(2839.327±520.582)cpm、D组为(3101.316±429.342)cpm对供体小鼠淋巴细胞刺激反应性减弱，而且两组之间差异有非常显著性(P<0.01)，即冷冻组优于应用免疫抑制剂组。
, 百拇医药
异体神经移植后，一般在移植术后2周发生免疫排斥反应 [4，5] ，受体的淋巴细胞和巨噬细胞向神经移植体内侵入，使轴突破坏、神经管断裂，导致异体神经移植体逐渐被纤维结缔组织增生而代替，最后阻断再生神经纤维通过移植体 [6，7] 。本项研究组织学检查结果显示C组移植体内有少量淋巴细胞、巨噬细胞浸润，与A组相接近，经冷冻预处理后的移植体能成活，我们认为是冷冻能降低许旺氏细胞的活性或灭活移植体内大部分许旺氏细胞，但由于基膜管未被破坏尚保存完好，因而降低了其抗原性，有利于受体神经的许旺氏细胞分裂向此基膜管内增殖并形成许旺氏细胞素，为再生轴突创造了一个通过移植体的附着面，从而使神经再生获得成功。
参考文献
1 Singh R.Experiment with allografts in the surgery of peripheral nerve.Acta Neurochir，1976，34:236.
, http://www.100md.com
2 Comtet JJ，Revillard JP.Nerve allografts.In:Touraine J.Trageer j，eds.Transplantation and clinical immunology.Vol8New York:Excerpta Medical，1981，161.
3 万新海.神经生长因子与冻干异体神经桥接大鼠神经缺损的研究.微生物学免疫学学报，1997，25(1):52.
4 高新生.同种异体神经移植.创伤骨科学报，1996，25(3):202.
5 Lassner MF.Preservation of peripheral nerve grafts:a comparison of norˉmal saline HTK orgin preservation solution and schwan cell culture medˉical.J Recoustr Microsurg，1995，11:72.
, 百拇医药
6 Gulatic AK.Nerve graft immunogenecity as a factor determining axonal regeneration in the rat.J Neuro Sug，1990，72:114.
7 石强.深低温冷冻处理异体周围神经移植的研究进展.中国实用手外科杂志，2000，14(3):174-177.
基金项目:本课题为黑龙江省自然科学基金资助(2000-2002)
作者单位:1 150001哈尔滨医科大学附属第一医院创伤外科
2 黑龙江省哈尔滨市第一医院
(收稿日期:2003-08-21)
(编辑 刘娜), http://www.100md.com(孟庆刚)
关键词 同种异体 免疫 周围神经
【文献标识码】 A 【文章编号】 1726-7587(2003)08-0673-03
Comparison study on affection between cryotherapy and immunosuppressive
, 百拇医药
agent for allograft of rat sciatic nerve
Meng Qinggang，Yue Qi，Ma Yongsheng
The First Affiliated Hospital，Haerbin Medical University，Haerbin150001.
【Abstract】 Objective To compare on affection between cryotherapy and immunosuppressive agent for alloˉgraft of rat sciatic nerve.Methods The experimentanimals were divided into fresh autograft group，fresh allograft group，autograft group of freezing donor nerve and allograft group of freezing donor nerve with immunosuppressive aˉgent.The electric physiology，histology，electromicroscope，mixed lymphocyte culture and delayed super-allergy reacˉtion of transplantation nerve were detected3weeks later after transplantation.Results The effect of nerve transplantaˉtion sequenced from better to worse:fresh autograft group，autograft group of freezing donor nerve，allograft group of freezing donor nerve with immunosuppressive agent and fresh allograft group.Conclusion The cellular component of peripheral nerve could be preserved with lowtemperature.Cryotherapy could decrease lymphocyte immigrating to transˉplanted tissue.The effect of cryot
, 百拇医药
herapy transplantation might be better than that in immunosuppressive agent group.
Key words cryotherapy allograft immunology peripheral nerve
周围神经损伤导致神经缺损的修复，尤其是对于长段主要神经干缺损的修复在临床中一直是较难处理的问题。虽然自体神经移植效果良好，但由于其来源有限，同时又常给供区带来功能损害，因而限制了其在临床中的应用。本实验通过研究经冷冻处理的供体坐骨神经移植后免疫学方面的变化，并与神经移植后应用免疫抑制剂方法进行对比，以进一步探讨神经移植物移植成活的机理，为临床寻找大段周围神经缺损移植提供理论依据。
1 资料与方法
1.1 实验动物与分组 取受体Balb/c(H-2 b )雄性小鼠30只(北京动物实验中心提供)，供体鼠C 57 BL/6(H-2 b )雄性小鼠40只，6～8周龄，体重为(20±2)g，随机分为四组，每组小鼠10只。A组:新鲜自体坐骨神经移植组。B组:新鲜异体坐骨神经移植组。C组:移植前将异体基因供体神经经-196℃冷冻3周后移植。D组:新鲜异体坐骨神经移植同时应用免疫抑制剂组，于移植前3天开始腹腔注射环孢素A，每天1次，注射剂量为10mg·kg -1 ·d -1。
, 百拇医药
1.2 神经移植 将小鼠麻醉后俯卧位固定四肢，于手术显微镜下自股二头肌与半腱肌、半膜肌间隙剪开结缔组织。 钝性分离股二头肌与半腱肌，显露坐骨神经，由犁状肌孔下0.5cm处整齐剪下0.2cm长的坐骨神经，然后移植供体鼠坐骨神经，并于16倍显微镜下用11-0无损伤线缝合神经外膜4～6针，缝合皮肤。
1.3 神经电生理学检查 神经于移植3周后，取各组受体鼠，切开股后部暴露坐骨神经移植段，将刺激电极置入移植段神经近端，记录电极斜行45°插入胫骨前肌肌腹中部，两刺激电极距离为2.0cm，测量运动神经传导速度。
1.4 组织学检查 神经于移植3周后，取各组小鼠神经移植段，经戊二醛和多聚甲醛混合固定后，用环氧树脂包埋，切制半薄与超薄切片，进行光镜与电镜检查。
1.5 免疫学检测 于神经移植后3周，取各组小鼠进行混合淋巴细胞培养与诱导迟发性超敏反应检查。
, 百拇医药
1.5.1 混合淋巴细胞培养 于96孔培养板中加入刺激细胞和反应细胞各100μl，刺激细胞数为1×10 6 /ml，预先以丝裂霉素C(MMC)37℃处理30min。反应细胞的浓度为1×10 5 /ml，自体移植组的刺激细胞为受体的自体细胞。每个实验组设3个复孔，单独刺激细胞和单独反应细胞作为阴性对照孔，37℃、5%CO 2 培养6天，结束前18h掺入 3 H-TDR，每孔加入0.5μCi，继续培养至结束。用细胞收集器将细胞收集在49型玻璃纤维滤纸上，滤纸干燥后放入装有闪烁液的闪瓶中，用液闪仪计数cpm值。
1.5.2 诱导迟发性超敏反应 取供体鼠的脾脏配制新鲜脾细胞悬液，细胞浓度为1×10 7/ml，对受体组的小鼠后肢左侧足垫皮内注射供体鼠的脾细胞悬液100μl，对照侧注射Hanks液100μl，24h后测量足垫厚度，计算两侧足垫的厚度差。
, http://www.100md.com 1.6 统计学方法 计量数据以均数±标准差(ˉx±s)表示，采用t检验。
2 结果
2.1 电生理学检查结果 各组运动神经传导速度的测定结果，A组优于C组、D组，C组与D组优于B组，且C组与D组间差异有非常显著性(P<0.01)，见表1。
表1 各组的运动神经传导速度 m/s
2.2 组织学检查结果 A组可见神经纤维走行正常，神经纤维间可见血管增生，束膜周围可见淋巴细胞浸润。B组可见神经纤维束膜水肿明显，周围可见大量淋巴细胞浸润，神经纤维数量减少，排列紊乱。C组可见神经纤维排列紊乱，有少量炎性细胞浸润。D组可见神经纤维数量增加，排列稍紊乱，神经纤维束之间水肿轻，可见淋巴细胞浸润。
2.3 电镜检查结果 A组可见神经纤维内有大量的再生髓鞘与轴突，许旺氏细胞功能活跃，内质网发达，游离核蛋白体丰富，新生轴突内微丝密集排列，线粒体较大，轴膜清晰可见。B组可见大部分神经纤维脱髓鞘崩解，轴突消失，未见有再生的神经纤维。C组可见部分神经纤维脱髓鞘，呈葱皮样改变，有较多的再生神经纤维。D组可见新生的神经纤维和许旺氏细胞明显多于崩解的神经纤维。
, http://www.100md.com
2.4 免疫学检查结果
2.4.1 混合淋巴细胞培养 B组对供体小鼠淋巴细胞的刺激呈正常反应，C组与D组对供体小鼠淋巴细胞的刺激反应性减弱，并且两者之间的差异有非常显著性(P<0.01)。见表2。
表2 各组的混合淋巴细胞培养 cpm略组
2.4.2 受体对供体鼠的迟发性超敏反应 B组对供体小鼠的淋巴细胞呈良好的迟发性超敏反应，而C组、D组对供 体小鼠的淋巴细胞的迟发性超敏反应性降低，并且两者之间差异有非常显著性(P<0.01)，见表3。
表3 各组的迟发性超敏反应 cpm略
3 讨论
自1878年Albert首次进行人类异体神经移植报道以来，国内外学者主要集中在解决异体神经移植的免疫排斥反应问题上 [1，2] 。目前多数研究认为降低或减弱异体周围神经移植的免疫排斥反应的方法有两大类 [3] ，一类是抑制受体的免疫机能，可防止机体对异体神经移植排斥反应;另一类是降低异体神经移植物免疫抗原性，如冷冻预变性处理。但冷冻法与免疫抑制剂法哪种效果为最佳，国内尚未见报道。本项研究受体组与供体组分别采用不同基因型的小鼠，移植后电生理学检查结果A组为42.250m/s，优于B组、C组、D组，且D组略优于C组，说明从运动神经传导速度来看，冷冻组与应用免疫抑制剂组相近。组织学及电镜检查结果显示C组与D组均可见再生神经纤维。受体对供体鼠的迟发性超敏反应B组为(1.325±0.086)cpm，对供体小鼠的淋巴细胞呈良好的迟发性超敏反应，C组为(0.854±0.105)cpm、D组为(1.127±0.057)cpm，对供体小鼠的淋巴细胞迟发性超敏反应性降低，而且两组之间差异有非常显著性(P<0.01)，即C组优于D组。各组的混合淋巴细胞培养结果B组为(4312.311±534.156)cpm，对供体小鼠淋巴细胞刺激呈正常反应，C组为(2839.327±520.582)cpm、D组为(3101.316±429.342)cpm对供体小鼠淋巴细胞刺激反应性减弱，而且两组之间差异有非常显著性(P<0.01)，即冷冻组优于应用免疫抑制剂组。
, 百拇医药
异体神经移植后，一般在移植术后2周发生免疫排斥反应 [4，5] ，受体的淋巴细胞和巨噬细胞向神经移植体内侵入，使轴突破坏、神经管断裂，导致异体神经移植体逐渐被纤维结缔组织增生而代替，最后阻断再生神经纤维通过移植体 [6，7] 。本项研究组织学检查结果显示C组移植体内有少量淋巴细胞、巨噬细胞浸润，与A组相接近，经冷冻预处理后的移植体能成活，我们认为是冷冻能降低许旺氏细胞的活性或灭活移植体内大部分许旺氏细胞，但由于基膜管未被破坏尚保存完好，因而降低了其抗原性，有利于受体神经的许旺氏细胞分裂向此基膜管内增殖并形成许旺氏细胞素，为再生轴突创造了一个通过移植体的附着面，从而使神经再生获得成功。
参考文献
1 Singh R.Experiment with allografts in the surgery of peripheral nerve.Acta Neurochir，1976，34:236.
, http://www.100md.com
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4 高新生.同种异体神经移植.创伤骨科学报，1996，25(3):202.
5 Lassner MF.Preservation of peripheral nerve grafts:a comparison of norˉmal saline HTK orgin preservation solution and schwan cell culture medˉical.J Recoustr Microsurg，1995，11:72.
, 百拇医药
6 Gulatic AK.Nerve graft immunogenecity as a factor determining axonal regeneration in the rat.J Neuro Sug，1990，72:114.
7 石强.深低温冷冻处理异体周围神经移植的研究进展.中国实用手外科杂志，2000，14(3):174-177.
基金项目:本课题为黑龙江省自然科学基金资助(2000-2002)
作者单位:1 150001哈尔滨医科大学附属第一医院创伤外科
2 黑龙江省哈尔滨市第一医院
(收稿日期:2003-08-21)
(编辑 刘娜), http://www.100md.com(孟庆刚)