动态监测SARS病人一氧化氮自由基浓度及其意义
【摘要】 目的 动态监测SARS病人一氧化氮自由基(一氧化氮，NO;诱导型一氧化氮合酶，iNOS)浓度并探讨其意义。方法 采用硝酸还原酶法测定NO、酶联免疫吸附法定量测定iNOS，检测早期、恢复期SARS病人以及出院后SARS随访者，一线未患SARS健康医务人员，健康体检者血清中NO和iNOS含量。结果 SARS早期组NO均值高于其他各组(P<0.05)，SARS恢复期组、SARS随访组均值均与急诊等一线未患SARS组和健康对照组差异有非常显著性(P<0.001)。SARS早期组iNOS均值高于其他各组(P<0.001)，恢复期组与急诊等一线未患SARS组有统计学意义(P=0.016)。结论 SARS的发病机制中病理损伤与一氧化氮自由基有关。
关键词 严重急性呼吸综合征 一氧化氮 诱导型一氧化氮合酶
【文献标识码】 A 【文章编号】 1726-7587(2003)08-0676-02
, 百拇医药 Dynamic observation on NO free radicals of
patients with severe acute respiratory syndrome
Zhou Qiang，Lin Li，Huang Xianzhang，et al.
Clinical Laboratory，Ersha Island Branch，Guangdong Provincial Hospital of TCM，Guangzhou510105.
【Abstract】 Objective Dynamic observation on NO Free radicals(NO and iNOS)of patients with Severe Acute Respiratory Syndrome(SARS)and to explore its significance.Methods NO and iNOS were determined in SARS paˉtients during the first，recovery and follow-up stage，the front health doctors and nurses and health p
, 百拇医药
eople.Results The mean of NO during the first stage was higher than that of other groups and the means of recovery stage，follow-up stage were higher than that of the front health doctors and nurses and health people group(P<0.001)，respectively.The mean of iNOS during the first stage was higher than that of other stages(P<0.001)and the mean of recovery stage was higher than that of the front health doctors and nurses(P=0.016).Conclusion The pathological injury in pathogenesis of SARS is related to free radicals.
, http://www.100md.com
Key words SARS NO iNOS
严重急性呼吸综合征(Severe Acute Respiratory Syndrone，SARS)是一种新发现的急性呼吸道传染病，2003年3月，WHO首次发出全球疫情警报，并将该病命名为SARS。由10个国家13个网络实验室研究人员和各国科学家的空前合作取得了重大突破，WHO于2003年4月16日正式宣布引起SARS疾病的病原体是冠状病毒(coronavirus，CoV)的一个变种，并命名为SARS病毒，它满足Koch法则 [1～3] 。病毒的致病机制分两类，一是直接损伤靶细胞，如杀细胞效应、细胞膜改变、细胞转化、病毒抗原的改变等;二是抗病毒反应，通过对体液免疫、细胞免疫、循环免疫复合物的损害作用导致宿主细胞损伤。到目前为止，SARS的致病机制还不十分清楚，因此在该病的治疗方面，还没有针对性的药物和治疗措施。
流感病毒、单纯疱疹病毒、呼吸道合胞病毒和仙台病毒等在造成炎症时，有一些共同发病机制，即在病毒与渗透到肺组织里的免疫细胞的相互作用过程中，宿主免疫细胞(巨噬细胞、中性粒细胞等)过度产生自由基类分子(free radiˉcals)，如氧自由基(O 2 ·- )、一氧化氮自由基(NO)及其衍生物(ROS)等，对受感染机体的细胞及组织造成损伤。
, 百拇医药
为了探讨NO自由基类分子在SARS致病过程中发挥 的作用，我们检测了我院2003年2～4月收治的SARS早期和恢复期病人分别为39例和36例;在我院治愈的SARS随访者55例，在我院急诊科等科室工作未患SARS的高危医护人员39例，健康体检者35例血清中一氧化氮(NO)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的含量。
1 材料和方法
1.1 研究对象 SARS早期组:39例，男17例，女22例，平均年龄(34.5±13.5)岁。入院1～6天，平均(3.55±1.50)天。SARS恢复期组:出院前1～3天患者36例，男15例，女21例，平均年龄(32.5±12.9)岁。SARS随访组:出院后1～2个月随访者(采血时间5月15日～17日)55例，男20例，女35例，平均年龄(33.2±13.8)岁。急诊等一线未患SARS组:我院急诊科等一线未患SARS健康医护人员(采血时间5月15日～5月31日)39例，男14例，女25例，平均年龄(33.5±10.5)岁。健康对照组:健康体检者(采血时间5月25日)35例，男15例，女20例，平均年龄(35.2±12.6)岁。分别抽无抗凝全血2.5ml，离心分离血清-80℃储存备用。
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1.2 SARS诊断标准 参照中华人民共和国卫生部颁布的《传染性非典型肺炎临床诊断标准》 [4] 。
1.3 试剂 NO检测试剂盒由南京聚力生物医学工程研究所提供，批号为20030510;iNOS购自美国R&D公司，批号为213354。
1.4 测试仪器设备 酶标仪、751分光光度计、恒温水浴箱、离心机等。
1.5 实验方法 NO测定采用硝酸还原酶法，酶联免疫吸附法定量测定iNOS，操作详见说明书。
1.6 统计学方法 5组人群的检测结果录入计算机构建数据库，组间均数比较采用方差分析及两两比较，α=0.05。数据库及统计分析均在SPSS10.0软件上实现。
2 结果
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2.1 5组人群NO水平的变化 5组人群NO均值水平总体比较差异有非常显著性(P<0.001)，结果见表1。SARS早期组NO均值高于其他各组(P<0.05)。SARS恢复期组、SARS随访组均值均与急诊等一线健康组和健康对照组有统计学差异(P<0.001)。急诊等一线健康组和健康对照组间均值比较差异无显著性(P>0.05)。NO是主要自由基之一，上述结果提示SARS发病早期机体已经产生过量的NO自由基，随访时NO自由基水平仍然较高，说明在SARS的发病机制中病理损伤与NO自由基有关。
2.2 5组人群iNOS水平的变化 5组人群iNOS均值水平总体比较差异有非常显著性(P<0.001)，结果见表1。SARS早期组iNOS均值高于其他各组(P<0.001)。SARS恢复期组与急诊等一线健康组差异有统计学意义(P=0.016)，但与SARS随访组和健康对照组间均值比较差异无显著性(P>0.05)。SARS随访组、急诊等一线健康组和健康对照组均值比较差异无统计学意义(P>0.05)。iNOS与NO对细胞发挥细胞毒作用直接相关，上述结果支持在SARS的发病机制中病理损伤与NO自由基有关的观点。表1 不同人群NO和iNOS的检测结果 (ˉx±s) 分组 nNO(μmol/L) iNOS(U/ml)SARS早期组 39 53.62±13.63 3.28±0.62 SARS恢复期组36 47.70±7.87 2.43±0.16 SARS随访组 55 45.07±11.19 2.51±0.26 急诊等一线健康组 39 34.35±11.51 2.63±0.21 健康对照组 35 34.86±14.24 2.55±0.16 F值 18.97 39.95 P <0.001 <0.001
, 百拇医药
3 讨论
一氧化氮(NO)是一种新型的生物信息传递体，受到国内外医学科学工作者的高度重视。NO是一种反应性极强的自由基，它兼有第二信使和神经递质作用，介导和调节多种病理生理过程，包括血小板粘附与抑制，基础血压的维持，肺泡血液灌流和通气的匹配，长期突触抑制，阴茎海绵体舒张，肾和骨髓的微循环，杀灭病原菌和攻击肿瘤细胞等细胞毒性效应以及免疫调节等多种病理、生理过程。NO与糖尿病、肝病、肾病、休克、缺氧、感染、肿瘤、心血管疾病、消化道溃疡、器官移植排斥反应、免疫系统疾病等 [5] 有关。NO导致损伤作用的机制可能有3个途径。在NO合成过程中，伴有超氧阴离子O 2 ·- 产生，合成过
氧化亚硝酸盐(OONO)，一旦质子化迅速蜕变为OH·及NO 2 ，具有很强的生物氧化物，可造成组织损伤。NO是机体抵抗细胞内微生物及其他致病因子的第一道防线，能直接作用于微生物，也可用于启动免疫防御系统，若作用过强则造成自身正常组织损伤。L-精氨酸通过NO介导细胞内传递、降低靶细胞 内cAMP/cGMP比例，可激活NK、LAK细胞，直接增加两种细胞毒性;若作用过甚，势必造成正常组织损伤。SARS早期组NO均值高于其他各组(P<0.05)，SARS恢复期组、SARS随访组均值均与急诊等一线未患SARS组和健康对照组差异有非常显著性(P<0.001)，说明在SARS发病早期机体已经产生过量NO自由基，SARS的发病机制中病理损伤与NO自由基有关。NO在SARS的发病机制中是否有抗损伤的一面，值得进一步研究。
, 百拇医药
iNOS在正常生理情况下不表达，主要在巨噬细胞，中性粒细胞和免疫细胞等受到细胞因子(如IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-1等)，或细菌脂多糖(LPS)作用时被激活而产生，先表达iNOS的mRNA，再生成iNOS，从而诱导产生持续时间长且大量的NO。高水平的NO对细胞主要发挥细胞毒作用 [6，7] 。虽然吸入NO被誉为急性呼吸综合征(ARDS)治疗的重要进展，但内源性NO在ARDS肺损伤发病机制中的作用不容忽视。Schutte等 [8] 报道，LPS致急性肺损伤时，肺组织内皮型一氧化氮合酶(cNOS)mRNA表达水平降低，说明由于cNOS下调，导致血管张力增加，对白细胞粘附的抑制作用减弱，从而加重肺损伤;同时也发现，iNOS mRNA表达增强，认为iNOS mRNA的转录过程是呈突然启动，继而持续性的过程。其大量生成的NO可与氧自由基一起生成过氧化亚硝基阴离子(ONOO - )，从而对肺组织有损伤作用。分析我们检测iNOS的结果，完全支持SARS的发病机制中病理损伤与NO自由基有关的观点。表明NO与iNOS在肺损伤发病机制中可能具有重要作用。
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NO生物学的研究可加深对疾病本质的认识，iNOS是合成对细胞主要发挥细胞毒作用的高水平NO的关键酶。NO自由基是病毒对受感染机体的细胞及组织造成损伤的重要自由基。我们初步了解到SARS的发病机制中病理损伤与NO自由基有关，但NO自由基类分子与SARS的病理损伤机制需进一步研究。
参考文献
1 WHO:WHO Multicentre Collaborative Network for Severe Acute Respiˉratory Syndrome(SARS)diagnosis.Weekly Epidemiological Record，2003，78:121-122.
2 Peiris J，Lai S，Poon L，et al.Coronavirus as a possible cause of Severe Acute Respiratory Syndrome.Lancet，2003，361:1319-1325.
, 百拇医药
3 Ksiazek TG，Erdman D，Goldsmith CS，et al.A novel coronavirus associˉatedwith severe acute respiratory syndrome.N Engl J Med，2003，348(20):1953-1966.
4 中华人民共和国卫生部办公厅.传染性非典型肺炎临床诊断标准.中华人民共和国卫生部，2003，5，3.
5 Laroux FS，Lefer DJ，Kawachi S，et al.Role of nitric oxide in the regulaˉtion of acute and chronic inflammation.Antioxid Redox Signal，2000，2(3):391-396.
6 莫红缨，郑劲平，钟南山.NF-κB及iNOS与肺部疾病.国外医学·呼吸系统分册，2000，20(3):160-162.
, http://www.100md.com
7 Moncada S，Palmer RM，Higgs EA.Nitric oxide:physiology，pathophysiˉology，and pharmacology.Pharmacol Rev，1991，43(2):109-142.
8 Schutte H，Mayer K，GesslerT，et al.Nitric oxide biosynthesis in an exoˉtoxin-induced septic lung model:role of cNOS and impact on pulˉmonary hemodynamics.Am J Respir Crit Care Med，1998，157:498-504.
基金项目:国家中医药管理局中医药科技非典专项资助(08号)
作者单位:510105广东省中医院二沙岛分院
(收稿日期:2003-08-20) (编辑 刘娜), 百拇医药(周强)
关键词 严重急性呼吸综合征 一氧化氮 诱导型一氧化氮合酶
【文献标识码】 A 【文章编号】 1726-7587(2003)08-0676-02
, 百拇医药 Dynamic observation on NO free radicals of
patients with severe acute respiratory syndrome
Zhou Qiang，Lin Li，Huang Xianzhang，et al.
Clinical Laboratory，Ersha Island Branch，Guangdong Provincial Hospital of TCM，Guangzhou510105.
【Abstract】 Objective Dynamic observation on NO Free radicals(NO and iNOS)of patients with Severe Acute Respiratory Syndrome(SARS)and to explore its significance.Methods NO and iNOS were determined in SARS paˉtients during the first，recovery and follow-up stage，the front health doctors and nurses and health p
, 百拇医药
eople.Results The mean of NO during the first stage was higher than that of other groups and the means of recovery stage，follow-up stage were higher than that of the front health doctors and nurses and health people group(P<0.001)，respectively.The mean of iNOS during the first stage was higher than that of other stages(P<0.001)and the mean of recovery stage was higher than that of the front health doctors and nurses(P=0.016).Conclusion The pathological injury in pathogenesis of SARS is related to free radicals.
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Key words SARS NO iNOS
严重急性呼吸综合征(Severe Acute Respiratory Syndrone，SARS)是一种新发现的急性呼吸道传染病，2003年3月，WHO首次发出全球疫情警报，并将该病命名为SARS。由10个国家13个网络实验室研究人员和各国科学家的空前合作取得了重大突破，WHO于2003年4月16日正式宣布引起SARS疾病的病原体是冠状病毒(coronavirus，CoV)的一个变种，并命名为SARS病毒，它满足Koch法则 [1～3] 。病毒的致病机制分两类，一是直接损伤靶细胞，如杀细胞效应、细胞膜改变、细胞转化、病毒抗原的改变等;二是抗病毒反应，通过对体液免疫、细胞免疫、循环免疫复合物的损害作用导致宿主细胞损伤。到目前为止，SARS的致病机制还不十分清楚，因此在该病的治疗方面，还没有针对性的药物和治疗措施。
流感病毒、单纯疱疹病毒、呼吸道合胞病毒和仙台病毒等在造成炎症时，有一些共同发病机制，即在病毒与渗透到肺组织里的免疫细胞的相互作用过程中，宿主免疫细胞(巨噬细胞、中性粒细胞等)过度产生自由基类分子(free radiˉcals)，如氧自由基(O 2 ·- )、一氧化氮自由基(NO)及其衍生物(ROS)等，对受感染机体的细胞及组织造成损伤。
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为了探讨NO自由基类分子在SARS致病过程中发挥 的作用，我们检测了我院2003年2～4月收治的SARS早期和恢复期病人分别为39例和36例;在我院治愈的SARS随访者55例，在我院急诊科等科室工作未患SARS的高危医护人员39例，健康体检者35例血清中一氧化氮(NO)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的含量。
1 材料和方法
1.1 研究对象 SARS早期组:39例，男17例，女22例，平均年龄(34.5±13.5)岁。入院1～6天，平均(3.55±1.50)天。SARS恢复期组:出院前1～3天患者36例，男15例，女21例，平均年龄(32.5±12.9)岁。SARS随访组:出院后1～2个月随访者(采血时间5月15日～17日)55例，男20例，女35例，平均年龄(33.2±13.8)岁。急诊等一线未患SARS组:我院急诊科等一线未患SARS健康医护人员(采血时间5月15日～5月31日)39例，男14例，女25例，平均年龄(33.5±10.5)岁。健康对照组:健康体检者(采血时间5月25日)35例，男15例，女20例，平均年龄(35.2±12.6)岁。分别抽无抗凝全血2.5ml，离心分离血清-80℃储存备用。
, http://www.100md.com
1.2 SARS诊断标准 参照中华人民共和国卫生部颁布的《传染性非典型肺炎临床诊断标准》 [4] 。
1.3 试剂 NO检测试剂盒由南京聚力生物医学工程研究所提供，批号为20030510;iNOS购自美国R&D公司，批号为213354。
1.4 测试仪器设备 酶标仪、751分光光度计、恒温水浴箱、离心机等。
1.5 实验方法 NO测定采用硝酸还原酶法，酶联免疫吸附法定量测定iNOS，操作详见说明书。
1.6 统计学方法 5组人群的检测结果录入计算机构建数据库，组间均数比较采用方差分析及两两比较，α=0.05。数据库及统计分析均在SPSS10.0软件上实现。
2 结果
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2.1 5组人群NO水平的变化 5组人群NO均值水平总体比较差异有非常显著性(P<0.001)，结果见表1。SARS早期组NO均值高于其他各组(P<0.05)。SARS恢复期组、SARS随访组均值均与急诊等一线健康组和健康对照组有统计学差异(P<0.001)。急诊等一线健康组和健康对照组间均值比较差异无显著性(P>0.05)。NO是主要自由基之一，上述结果提示SARS发病早期机体已经产生过量的NO自由基，随访时NO自由基水平仍然较高，说明在SARS的发病机制中病理损伤与NO自由基有关。
2.2 5组人群iNOS水平的变化 5组人群iNOS均值水平总体比较差异有非常显著性(P<0.001)，结果见表1。SARS早期组iNOS均值高于其他各组(P<0.001)。SARS恢复期组与急诊等一线健康组差异有统计学意义(P=0.016)，但与SARS随访组和健康对照组间均值比较差异无显著性(P>0.05)。SARS随访组、急诊等一线健康组和健康对照组均值比较差异无统计学意义(P>0.05)。iNOS与NO对细胞发挥细胞毒作用直接相关，上述结果支持在SARS的发病机制中病理损伤与NO自由基有关的观点。表1 不同人群NO和iNOS的检测结果 (ˉx±s) 分组 nNO(μmol/L) iNOS(U/ml)SARS早期组 39 53.62±13.63 3.28±0.62 SARS恢复期组36 47.70±7.87 2.43±0.16 SARS随访组 55 45.07±11.19 2.51±0.26 急诊等一线健康组 39 34.35±11.51 2.63±0.21 健康对照组 35 34.86±14.24 2.55±0.16 F值 18.97 39.95 P <0.001 <0.001
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3 讨论
一氧化氮(NO)是一种新型的生物信息传递体，受到国内外医学科学工作者的高度重视。NO是一种反应性极强的自由基，它兼有第二信使和神经递质作用，介导和调节多种病理生理过程，包括血小板粘附与抑制，基础血压的维持，肺泡血液灌流和通气的匹配，长期突触抑制，阴茎海绵体舒张，肾和骨髓的微循环，杀灭病原菌和攻击肿瘤细胞等细胞毒性效应以及免疫调节等多种病理、生理过程。NO与糖尿病、肝病、肾病、休克、缺氧、感染、肿瘤、心血管疾病、消化道溃疡、器官移植排斥反应、免疫系统疾病等 [5] 有关。NO导致损伤作用的机制可能有3个途径。在NO合成过程中，伴有超氧阴离子O 2 ·- 产生，合成过
氧化亚硝酸盐(OONO)，一旦质子化迅速蜕变为OH·及NO 2 ，具有很强的生物氧化物，可造成组织损伤。NO是机体抵抗细胞内微生物及其他致病因子的第一道防线，能直接作用于微生物，也可用于启动免疫防御系统，若作用过强则造成自身正常组织损伤。L-精氨酸通过NO介导细胞内传递、降低靶细胞 内cAMP/cGMP比例，可激活NK、LAK细胞，直接增加两种细胞毒性;若作用过甚，势必造成正常组织损伤。SARS早期组NO均值高于其他各组(P<0.05)，SARS恢复期组、SARS随访组均值均与急诊等一线未患SARS组和健康对照组差异有非常显著性(P<0.001)，说明在SARS发病早期机体已经产生过量NO自由基，SARS的发病机制中病理损伤与NO自由基有关。NO在SARS的发病机制中是否有抗损伤的一面，值得进一步研究。
, 百拇医药
iNOS在正常生理情况下不表达，主要在巨噬细胞，中性粒细胞和免疫细胞等受到细胞因子(如IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-1等)，或细菌脂多糖(LPS)作用时被激活而产生，先表达iNOS的mRNA，再生成iNOS，从而诱导产生持续时间长且大量的NO。高水平的NO对细胞主要发挥细胞毒作用 [6，7] 。虽然吸入NO被誉为急性呼吸综合征(ARDS)治疗的重要进展，但内源性NO在ARDS肺损伤发病机制中的作用不容忽视。Schutte等 [8] 报道，LPS致急性肺损伤时，肺组织内皮型一氧化氮合酶(cNOS)mRNA表达水平降低，说明由于cNOS下调，导致血管张力增加，对白细胞粘附的抑制作用减弱，从而加重肺损伤;同时也发现，iNOS mRNA表达增强，认为iNOS mRNA的转录过程是呈突然启动，继而持续性的过程。其大量生成的NO可与氧自由基一起生成过氧化亚硝基阴离子(ONOO - )，从而对肺组织有损伤作用。分析我们检测iNOS的结果，完全支持SARS的发病机制中病理损伤与NO自由基有关的观点。表明NO与iNOS在肺损伤发病机制中可能具有重要作用。
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NO生物学的研究可加深对疾病本质的认识，iNOS是合成对细胞主要发挥细胞毒作用的高水平NO的关键酶。NO自由基是病毒对受感染机体的细胞及组织造成损伤的重要自由基。我们初步了解到SARS的发病机制中病理损伤与NO自由基有关，但NO自由基类分子与SARS的病理损伤机制需进一步研究。
参考文献
1 WHO:WHO Multicentre Collaborative Network for Severe Acute Respiˉratory Syndrome(SARS)diagnosis.Weekly Epidemiological Record，2003，78:121-122.
2 Peiris J，Lai S，Poon L，et al.Coronavirus as a possible cause of Severe Acute Respiratory Syndrome.Lancet，2003，361:1319-1325.
, 百拇医药
3 Ksiazek TG，Erdman D，Goldsmith CS，et al.A novel coronavirus associˉatedwith severe acute respiratory syndrome.N Engl J Med，2003，348(20):1953-1966.
4 中华人民共和国卫生部办公厅.传染性非典型肺炎临床诊断标准.中华人民共和国卫生部，2003，5，3.
5 Laroux FS，Lefer DJ，Kawachi S，et al.Role of nitric oxide in the regulaˉtion of acute and chronic inflammation.Antioxid Redox Signal，2000，2(3):391-396.
6 莫红缨，郑劲平，钟南山.NF-κB及iNOS与肺部疾病.国外医学·呼吸系统分册，2000，20(3):160-162.
, http://www.100md.com
7 Moncada S，Palmer RM，Higgs EA.Nitric oxide:physiology，pathophysiˉology，and pharmacology.Pharmacol Rev，1991，43(2):109-142.
8 Schutte H，Mayer K，GesslerT，et al.Nitric oxide biosynthesis in an exoˉtoxin-induced septic lung model:role of cNOS and impact on pulˉmonary hemodynamics.Am J Respir Crit Care Med，1998，157:498-504.
基金项目:国家中医药管理局中医药科技非典专项资助(08号)
作者单位:510105广东省中医院二沙岛分院
(收稿日期:2003-08-20) (编辑 刘娜), 百拇医药(周强)