蛴螬提取物体外对人MGC-803胃癌细胞株的血清药理学实验研究 ˇ
http://www.100md.com
中华中西医杂志 2003年5月 第4卷 第10期
·【摘要】 目的 探讨蛴螬提取物体外对人MGC-803胃癌细胞株的抗肿瘤作用。方法 应用血清药理学实验检测蛴螬提取物对MGC-803胃癌细胞的抗增殖作用及药物敏感性。结果 血清药理学实验结果表明，灌服蛴螬的含药血清组对MGC-803胃癌细胞株生长抑制率达28.93%，与阴性对照组相比差异有非常显著性(P<0.01)。结论 蛴螬提取物在体外对人MGC-803胃癌细胞株有显著抗增殖作用。
关键词 蛴螬 MGC-803胃癌细胞株 血清药理学实验
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)10-1441-02
Studies on sero-pharmacological experiment of the
grub extract for MGC-803human gastric cancer cell line in vitro
, 百拇医药
Jin Zhe，Sun Shu，Li Jijun，et al.
Tumor Research Center of Yanbian University，Yanji Jilin133000.
【Abstract】 Objective To investigate the anti-cancer of the grub extract for MGC-803gastric cancer cell line in vitro.Methods Using sero-pharmacological experiment，the inhibition of cell’s growth and the sensitivity of the grub extract for MGC-803gastric cancer cells was examined.Results The grub extract significantly inhibited the proliferation of gastric cancer cells in vitro and the inhibitive effects were depended on the medicine concentration and treating times.Conclusion The grub extract has significant inhibition of proliferation of gastric cancer cell line.
, 百拇医药
Key words grub extract MGC-803gastric cancer cell line sero-pharmacological experiment
蛴螬是金龟子的幼虫，产于长白山地区。
蛴螬载于中药大辞典中民间用于治疗破伤风，文献记载我国唐代已有食用蛴螬的资料。近年来一些学者用之与其它中草药配伍治疗各种腹腔肿瘤、急、慢性粒细胞白血病、喉癌、子宫癌、卵巢癌等的报道。但蛴螬单味制剂有效成分的分离、生物活性部位抗肿瘤作用方面的研究国内、外尚未见报道。本实验以人体MGC-803胃癌细胞株为供试体，采用血清药理学方法，探讨蛴螬提取物在体外对MGC-803胃癌细胞株的抗增殖作用。旨在进一步阐明蛴螬的抗肿瘤作用及其作用机制，为长白山天然药物蛴螬的开发提供理论和实验依据。
1 材料与方法
1.1 细胞株 MGC-803细胞株是人胃腺癌细胞株，由中国医科大学肿瘤研究所提供，我室传代培养。
, 百拇医药
1.2 药物及试剂 (1)蛴螬提取物:蛴螬5号，由延边大学肿瘤研究中心提供。(2)细胞培养液配制:RPMI Medium1640:GIBCO公司产品。(3)新生小牛血清(Newborn calf Serum):杭州四季青生物工程公司产品。经56℃水浴30min灭活，-20℃冰柜冻存。(4)MTT(噻唑兰):USB公司产品。(5)胰蛋白酶(Tripsin):DIFCO公司产品。
1.3 方法
1.3.1 蛴螬的抗肿瘤作用的血清药理学实验 为了探讨 ˇ 基金项目:教育部科学技术研究重点项目资助课题(教技司03033号)蛴螬在体内是否存在抗肿瘤作用，我们采用了血清药理学方法。分给药组和阴性对照组。给药组分成人剂量的10倍(2.7g/kg)和20倍(5.4g/kg)两组，大鼠蛴螬灌胃，阴性对照组给等量生理盐水，2次/日，连续2日，于第4次灌胃后1h，下腔静脉采血，无菌分离血清，经56℃、30min灭活后，-20℃保存备用。将此含蛴螬的血清用MTT法测体外对细胞的毒性作用。
, 百拇医药
1.3.2 蛴螬提取物对MGC-803胃癌细胞的细胞毒作用(MTT比值法) 取对数生长期胃癌细胞调整至10×10 4 个/ml细胞悬液，接种于96孔细胞培养板上，每孔加0.2ml细胞悬液，置于37℃、5%CO 2 细胞培养箱中培养，第2天待大部分细胞贴壁后，其实验分:加蛴螬血清组、生理盐水血清组、等量生理盐水组及终浓度为25μg/ml的5-Fu阳性对照组等4组，24h后，每孔加MTT溶液20μl(浓度为5mg/ml)，置于37℃、5%CO 2 细胞培养箱中培养，连续培养4h后小心吸尽上清液，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)160μl，放入酶标仪，中速振荡5min后，在492nm波长下测定每孔的吸光度(A)值。
细胞生长抑制率的计算:抑制率(%)=(对照孔A值-实验孔A值)/对照孔A值 ×100%
1.3.3 统计学处理 使用SPSS10.0统计软件。完全随机分组实验所得数据的计量资料采用t检验。安全随机分组实验所得数据的计数资料和率的比较采用χ 2 检验。
, 百拇医药
2 结果含药血清
对胃癌细胞体外生长的抑制作用见表1。
表1 含药血清对MGC-803
胃癌细胞体外生长的抑制作用(略)
从上表可以看出灌服蛴螬的两组含药血清组与终浓度为25μg/ml的5-Fu阳性对照组相似，其抑制分别为28.93%和29.03%，与上两个阴性对照组相比差异有非常显著性(P<0.01);灌服NaCl血清与无血清NaCl相比无统计学意义，两组含药血清组相比差异也无显著性。
3 讨论
在世界范围内，抗癌药物的研究已逐渐转向天然动植物，我国传统的中医中药越来越受到人们的青睐，中医中药治疗肿瘤已成为肿瘤治疗领域的一大特色 [1] 。蛴螬在临床上治疗各种腹腔肿瘤、急、慢性粒细胞白血病、喉癌、子宫癌、卵巢癌等已有报道。关于蛴螬单味制剂有效成分的分离、生物活性部位抗癌作用机制方面的研究国内外尚未见报道。本实验用血清药理学方法 [2] 研究该药的抗肿瘤作用，旨在探讨蛴螬提取物在体外抑制肿瘤细胞增殖，抗肿瘤方式及其机制。
, 百拇医药
近年来，已发现有部分中药提取物能诱导细胞凋亡，如紫杉醇、榄香烯乳、氧化砷、槲皮素等，但均为药物在体外与细胞直接作用 [3，4] 。由于中药粗制剂的杂质成分、各种电解质或鞣质成分及不同酸碱度的干扰等，都会对培养细胞的生理活性造成一定的影响，其结果不能完全说明中药服用后在体内的复杂作用，更不能等同于中药复方的复杂作用。1988年，田代真一 [5] 正式提出了“中药血清药理学”这一新概念，血清药理学研究方法就是将试验动物灌服中药后，在一定时间内采集其血清液，将含药血清代替中药进行体外药理实验的方法。这使中药的药理学实验能较客观地反映药物进入机体后，经过消化、吸收、代谢等而发挥药物效应的过程，排除了传统的中药粗提取物在体外实验中各种干扰因素的影响，能较清楚地认识中药药理实验中发挥 作用的主要有效成分及活性部位，也为中医药研究与现代分子生物学等现代科学技术的结合奠定了可行的基础，提高了中药体外实验的可信性、可靠性。中药血清药理学是一种新的研究方法体系，它模拟了药物与机体相互作用的过程，在一定程度上克服了原体外实验方法中所存在的诸多不足之处，具有中药粗提取物直接体外实验不具有的优势，它能较为客观真实地阐明中药的药效和作用机理，并能在一定程度上揭示中药在胃肠代谢过程中活性成分的转化和改变，有助于中药真正有效活性部位和有效成分的发现 [6] 。该实验设想把血清药理学方法用于中药抗肿瘤作用离体试验，因此得到的实验结果其可信度更高。
, 百拇医药
本实验取两组含药血清在体外用MTT法测试结果其吸光度值与阴性对照组相比差异有非常显著性(P<0.01)，但两组药物吸光度之间差异无显著性(P>0.05)。这一结果证明含药血清也有抗MGC-803细胞增殖作用，这可能是含药血清中含有所服药物有效成分或其活性代谢产物，也可能含有在药物作用下产生的内源性活性物质，并因此而产生药理作用。这一结果有力证明该药在体内也有可能引起抗肿瘤作用。
本实验还有待于深入研究，究竟是蛴螬中的何种成分有诱导凋亡的作用，蛴螬与其它抗肿瘤中药单味制剂或化疗药物联合使用时，是否有增强凋亡效果。另外还要进一步研究凋亡调控基因表达开始的时相、凋亡不同阶段对表达的影响以及其他凋亡相关基因表达的数量与种类等有待于进一步探讨。
参考文献
1 杨凤昆.中药阻断肿瘤生长，诱导癌细胞凋亡研究概况.中草药，2000，11(31):7-8.
, 百拇医药
2 曹俊.中药血清药理学研究概况.中国中医药信息杂志，2002，1(9):80-82.
3 杨勤建，雷良蔚.中药复方香龙散(含药血清)诱导人胃癌细胞凋亡的研究.湖北中医学院学报，1999，1(1):43-45.
4 Ikeda M，Shomori K，Eudo K，et al.Frequent occurrence of apoptosis is an early event in the oncogenesis of human gastric carcionma.Virchouws Arch，1998，432:43-47.
5 田代真一.“血清药理学”と“血清药化学”-汉方の药理学か始きっ药物血中浓度测定の新しい世界.TDM研究，1998，54(5):11.
6 林志彬.灵芝的抗肿瘤作用机制.基础医学与临床，2000，20(5):391-393.
作者单位:133000吉林延吉延边大学肿瘤研究中心
(编辑 维兰), 百拇医药(金哲)
关键词 蛴螬 MGC-803胃癌细胞株 血清药理学实验
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)10-1441-02
Studies on sero-pharmacological experiment of the
grub extract for MGC-803human gastric cancer cell line in vitro
, 百拇医药
Jin Zhe，Sun Shu，Li Jijun，et al.
Tumor Research Center of Yanbian University，Yanji Jilin133000.
【Abstract】 Objective To investigate the anti-cancer of the grub extract for MGC-803gastric cancer cell line in vitro.Methods Using sero-pharmacological experiment，the inhibition of cell’s growth and the sensitivity of the grub extract for MGC-803gastric cancer cells was examined.Results The grub extract significantly inhibited the proliferation of gastric cancer cells in vitro and the inhibitive effects were depended on the medicine concentration and treating times.Conclusion The grub extract has significant inhibition of proliferation of gastric cancer cell line.
, 百拇医药
Key words grub extract MGC-803gastric cancer cell line sero-pharmacological experiment
蛴螬是金龟子的幼虫，产于长白山地区。
蛴螬载于中药大辞典中民间用于治疗破伤风，文献记载我国唐代已有食用蛴螬的资料。近年来一些学者用之与其它中草药配伍治疗各种腹腔肿瘤、急、慢性粒细胞白血病、喉癌、子宫癌、卵巢癌等的报道。但蛴螬单味制剂有效成分的分离、生物活性部位抗肿瘤作用方面的研究国内、外尚未见报道。本实验以人体MGC-803胃癌细胞株为供试体，采用血清药理学方法，探讨蛴螬提取物在体外对MGC-803胃癌细胞株的抗增殖作用。旨在进一步阐明蛴螬的抗肿瘤作用及其作用机制，为长白山天然药物蛴螬的开发提供理论和实验依据。
1 材料与方法
1.1 细胞株 MGC-803细胞株是人胃腺癌细胞株，由中国医科大学肿瘤研究所提供，我室传代培养。
, 百拇医药
1.2 药物及试剂 (1)蛴螬提取物:蛴螬5号，由延边大学肿瘤研究中心提供。(2)细胞培养液配制:RPMI Medium1640:GIBCO公司产品。(3)新生小牛血清(Newborn calf Serum):杭州四季青生物工程公司产品。经56℃水浴30min灭活，-20℃冰柜冻存。(4)MTT(噻唑兰):USB公司产品。(5)胰蛋白酶(Tripsin):DIFCO公司产品。
1.3 方法
1.3.1 蛴螬的抗肿瘤作用的血清药理学实验 为了探讨 ˇ 基金项目:教育部科学技术研究重点项目资助课题(教技司03033号)蛴螬在体内是否存在抗肿瘤作用，我们采用了血清药理学方法。分给药组和阴性对照组。给药组分成人剂量的10倍(2.7g/kg)和20倍(5.4g/kg)两组，大鼠蛴螬灌胃，阴性对照组给等量生理盐水，2次/日，连续2日，于第4次灌胃后1h，下腔静脉采血，无菌分离血清，经56℃、30min灭活后，-20℃保存备用。将此含蛴螬的血清用MTT法测体外对细胞的毒性作用。
, 百拇医药
1.3.2 蛴螬提取物对MGC-803胃癌细胞的细胞毒作用(MTT比值法) 取对数生长期胃癌细胞调整至10×10 4 个/ml细胞悬液，接种于96孔细胞培养板上，每孔加0.2ml细胞悬液，置于37℃、5%CO 2 细胞培养箱中培养，第2天待大部分细胞贴壁后，其实验分:加蛴螬血清组、生理盐水血清组、等量生理盐水组及终浓度为25μg/ml的5-Fu阳性对照组等4组，24h后，每孔加MTT溶液20μl(浓度为5mg/ml)，置于37℃、5%CO 2 细胞培养箱中培养，连续培养4h后小心吸尽上清液，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)160μl，放入酶标仪，中速振荡5min后，在492nm波长下测定每孔的吸光度(A)值。
细胞生长抑制率的计算:抑制率(%)=(对照孔A值-实验孔A值)/对照孔A值 ×100%
1.3.3 统计学处理 使用SPSS10.0统计软件。完全随机分组实验所得数据的计量资料采用t检验。安全随机分组实验所得数据的计数资料和率的比较采用χ 2 检验。
, 百拇医药
2 结果含药血清
对胃癌细胞体外生长的抑制作用见表1。
表1 含药血清对MGC-803
胃癌细胞体外生长的抑制作用(略)
从上表可以看出灌服蛴螬的两组含药血清组与终浓度为25μg/ml的5-Fu阳性对照组相似，其抑制分别为28.93%和29.03%，与上两个阴性对照组相比差异有非常显著性(P<0.01);灌服NaCl血清与无血清NaCl相比无统计学意义，两组含药血清组相比差异也无显著性。
3 讨论
在世界范围内，抗癌药物的研究已逐渐转向天然动植物，我国传统的中医中药越来越受到人们的青睐，中医中药治疗肿瘤已成为肿瘤治疗领域的一大特色 [1] 。蛴螬在临床上治疗各种腹腔肿瘤、急、慢性粒细胞白血病、喉癌、子宫癌、卵巢癌等已有报道。关于蛴螬单味制剂有效成分的分离、生物活性部位抗癌作用机制方面的研究国内外尚未见报道。本实验用血清药理学方法 [2] 研究该药的抗肿瘤作用，旨在探讨蛴螬提取物在体外抑制肿瘤细胞增殖，抗肿瘤方式及其机制。
, 百拇医药
近年来，已发现有部分中药提取物能诱导细胞凋亡，如紫杉醇、榄香烯乳、氧化砷、槲皮素等，但均为药物在体外与细胞直接作用 [3，4] 。由于中药粗制剂的杂质成分、各种电解质或鞣质成分及不同酸碱度的干扰等，都会对培养细胞的生理活性造成一定的影响，其结果不能完全说明中药服用后在体内的复杂作用，更不能等同于中药复方的复杂作用。1988年，田代真一 [5] 正式提出了“中药血清药理学”这一新概念，血清药理学研究方法就是将试验动物灌服中药后，在一定时间内采集其血清液，将含药血清代替中药进行体外药理实验的方法。这使中药的药理学实验能较客观地反映药物进入机体后，经过消化、吸收、代谢等而发挥药物效应的过程，排除了传统的中药粗提取物在体外实验中各种干扰因素的影响，能较清楚地认识中药药理实验中发挥 作用的主要有效成分及活性部位，也为中医药研究与现代分子生物学等现代科学技术的结合奠定了可行的基础，提高了中药体外实验的可信性、可靠性。中药血清药理学是一种新的研究方法体系，它模拟了药物与机体相互作用的过程，在一定程度上克服了原体外实验方法中所存在的诸多不足之处，具有中药粗提取物直接体外实验不具有的优势，它能较为客观真实地阐明中药的药效和作用机理，并能在一定程度上揭示中药在胃肠代谢过程中活性成分的转化和改变，有助于中药真正有效活性部位和有效成分的发现 [6] 。该实验设想把血清药理学方法用于中药抗肿瘤作用离体试验，因此得到的实验结果其可信度更高。
, 百拇医药
本实验取两组含药血清在体外用MTT法测试结果其吸光度值与阴性对照组相比差异有非常显著性(P<0.01)，但两组药物吸光度之间差异无显著性(P>0.05)。这一结果证明含药血清也有抗MGC-803细胞增殖作用，这可能是含药血清中含有所服药物有效成分或其活性代谢产物，也可能含有在药物作用下产生的内源性活性物质，并因此而产生药理作用。这一结果有力证明该药在体内也有可能引起抗肿瘤作用。
本实验还有待于深入研究，究竟是蛴螬中的何种成分有诱导凋亡的作用，蛴螬与其它抗肿瘤中药单味制剂或化疗药物联合使用时，是否有增强凋亡效果。另外还要进一步研究凋亡调控基因表达开始的时相、凋亡不同阶段对表达的影响以及其他凋亡相关基因表达的数量与种类等有待于进一步探讨。
参考文献
1 杨凤昆.中药阻断肿瘤生长，诱导癌细胞凋亡研究概况.中草药，2000，11(31):7-8.
, 百拇医药
2 曹俊.中药血清药理学研究概况.中国中医药信息杂志，2002，1(9):80-82.
3 杨勤建，雷良蔚.中药复方香龙散(含药血清)诱导人胃癌细胞凋亡的研究.湖北中医学院学报，1999，1(1):43-45.
4 Ikeda M，Shomori K，Eudo K，et al.Frequent occurrence of apoptosis is an early event in the oncogenesis of human gastric carcionma.Virchouws Arch，1998，432:43-47.
5 田代真一.“血清药理学”と“血清药化学”-汉方の药理学か始きっ药物血中浓度测定の新しい世界.TDM研究，1998，54(5):11.
6 林志彬.灵芝的抗肿瘤作用机制.基础医学与临床，2000，20(5):391-393.
作者单位:133000吉林延吉延边大学肿瘤研究中心
(编辑 维兰), 百拇医药(金哲)