NF-κB的诱骗性寡核苷酸对内皮粘附分子VCAM-1表达的影响
【摘要】 目的 探讨在人脐静脉内皮细胞中，NF-κB的诱骗性寡核苷酸对肿瘤坏死因子TNF-α诱导的粘附分子VCAM-1表达的影响。方法 采用培养的人脐静脉内皮细胞株ECV-304，脂质体介导法转染寡核苷酸，流式细胞仪检测转染效率，电泳迁移率转换试验检测诱骗性寡核苷酸与NF-κB转录因子的亲和力及特异性，并用逆转录-聚合酶链反应和流式细胞仪测定其对TNF-α诱导的粘附分子VCAM-1表达的影响。结果 诱骗性寡核苷酸能与NF-κB特异结合，并可显著下调TNF-α诱导的人脐静脉内皮细胞粘附分子VCAM-1的表达。结论 NF-κB的诱骗性寡核苷酸可显著下调NF-κB调控的与动脉粥样硬化相关的粘附分子的表达，为核酸药物防治动脉粥样硬化的临床应用提供了一些前期资料。
关键词 核因子kappaB 诱骗性寡核苷酸 细胞间粘附分子 动脉粥样硬化
, 百拇医药
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-077X(2003)12-1057-03
The effect of decoy oligonucleotides of nuclear
factor-κB on VCAM-1expression in HUVECs
Chen Zhenyue，Lu Guoping
Department of Cardiology，Ruijin Hospital，Shanghai Second Medical University，Shanghai200025.
【Abstract】 Objective To investigate the effects of decoy oligonucleotides(ODNs)of NF-κB on expression of adhesion molecules induced by TNF-αin vitro.Methods Affinity and specificity of decoy ODNs of NF-κB to transcription factor NF-κB were detected by electrophoretic mobility shift assay(EMSA).Intracellular uptake of FITC-labeled oligonucleotides was detected by fluorescence active cell sort(FACS);Adhesion molecules expression was presented by RT-PCR at RNA level，FACS at protein level.The data showed that decoy ODNs of NF-κB can bind totranscription factor NF-κB and has strong affinity and specificity.Results The decoy ODNs can downregulated the expression of VCAM-1stimulated by TNF-αin humanvascular endothelial cells(HUVECs).Conclusion Those observation wre demonstrated that the decoy oligonucleotides of NF-κB can inhibit NF-κB mediated activites and downregulate expression of some gene product as vascular cell adhesion molecule-1(VCAM-1)involving in atherosclerosis.
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Key words NF-κB decoy ODNs VCAM-1 atherosclerosis
有研究发现，在动脉粥样硬化早期出现的单核细胞的聚集，同增加的粘附分子的表达是一致的。细胞间粘附分子(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)是最重要的粘附分子之一，能在动脉粥样硬化过程中调节细胞的粘附及穿越内皮的游移。核因子kappaB(nuclear factor kappaB，NF-κB)是一种能调节多种炎症和免疫基因的重要的转录因子，可与VCAM-1上的κB序列结合，上调其表达，促进单核细胞趋化并粘附于血管壁。诱骗性寡核苷酸可通过与NF-κB的下游基因竞争结合位点，诱骗NF-κB与之结合，从而下调NF-κB所调控的基因的表达(如粘附分子等) [1，2] 。本研究观察诱骗性寡核苷酸与NF-κB结合的亲和力和特异性及NF-κB所调控的粘附分子的表达，阐明作用机制并评价其效果。类似研究在国内外报道甚少，我们对此进行研究，旨在为以核酸为新兴药物防治动脉粥样硬化等疾病做一些前期探索。
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1 材料与方法
1.1 材料 RPMI-1640培养基购自美国GIBCO公司;小牛血清(BSA)购自杭州四季青公司;重组人TNF-α购自BD公司;Lipofectamine、opti-MEMI购自GIBCO公司;丙烯酰胺购自Sigma公司;醋酸胺购自Fisher ScientificLtd.;[γ- 32 P] ATP购自北京亚辉生物医学工程公司;T4寡核苷酸激酶购自Promega;NF-κB p65(C-20)购自SANTA CRUZ Biotechˉnology Inc;琼脂糖购自美国AMRESCO公司;Trizol和DEPC购自美国GIBCO公司;M-MLV逆转录酶、随机引物、dNTP由美国Promega公司生产;RNA酶抑制剂(Rnasin)购自上海华美生物技术公司;Taq酶购自加拿大Biostar公司;mouse anti-human VCAM-1购自R&D公司;人脐静脉内皮细胞株ECV-304购自中科院细胞所。
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1.2 方法
1.2.1 细胞培养及刺激 将ECV-304细胞种于6孔板中，用含10%小牛血清的RPMI-1640培养基在37℃、5%CO 2 条件下培养24～48h。显微镜下发现细胞贴壁生长，并有50%～80%融合。TNF-α(10ng/ml)刺激前，细胞先于血清培养数小时。
1.2.2 电泳迁移率转换试验 核提取物的制备:采用碱性低渗液裂解细胞核、低温高速离心法。含核蛋白的上清液-70℃冻存备用，Bradford法测蛋白浓度。电泳迁移率转换试验:核提取物分别与标记探针(γ- 32 P标记的寡核苷酸)和突变振针(γ- 32 P标记的突变寡核苷酸)在结合缓冲液中充分结合后，行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳;干燥后-70℃放射自显影过夜;用特异性竞争试验(加入50倍未标记探针)和抗体超迁移试验(加入抗p65多克隆抗体)鉴定标记探针和NF-κB结合的特异性。
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1.2.3 寡核苷酸的转染和摄取情况的检测 NF-κB的诱骗性寡核苷酸及突变体序列 [1]经国际互联网查阅文献获得，具体序列如下:诱骗性寡核苷酸:5’AGAGTGGGAATTTCˉCACTCA3’;突变对照寡核苷酸:5’AGAGTGGTCCTTTCˉCACTCA3’;全硫代修饰及FITC标记，由上海生物工程有限公司合成。
分组:阳性对照组(Control);NF-κB的诱骗性寡核苷酸组(decoy ODNs);NF-κB突变寡核苷酸组(decoy-mut ODNs)。
脂质体介导的短暂转染:将各组DNA2μg分别加入Opti-MEMI并与脂质体混匀后室温孵育45min，形成脂质体-DNA复合体后加入种有(1～3)×10 5 的ECV-304细胞的6孔板中，37℃、5%CO 2 孵育6h后，用含10%BSA的1640培养液及无血清培养液替换培养18h后，用10ng/ml的TNF-α作用30min。
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细胞对寡核苷酸摄取情况的检测:FITC标记的和未标记的寡核苷酸转染细胞，24h后收集，用PBS清洗并重悬;流式细胞仪检测，Cell Quest软件分析，计算荧光强度。
1.2.4 逆转录-聚合酶链反应检测VCAM-1mRNA的表达 采用逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polyˉmerase chain reacation，RT-PCR)检测VCAM-1mRNA的表达。转染后收集细胞，Trizol抽提RNA。引物根据国外文 献 [3] 及国际互联网cDNA文库检索、设计，由上海生物工程公司合成。VCAM-1(194bp):5’CCAGATAGACAGCCˉCTCTGA(上游)，5’CCACCACTCATCTCGATTTC3’(下游);条件:起始:94℃，5min;变性:94℃，30s，循环30次;退火:62℃，30s;延伸:72℃，1min。β-actin(532bp):5’AAGGATTCˉCTATGTGGGC3’(上游)，5’CATCTCTTGCTCGAAGTC3’(下游)。2%琼脂糖凝胶电泳后，生物图像分析仪检测密度。
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1.2.5 流式细胞仪检测粘附分子VCAM-1的表达 转染后收集细胞，每管加入10μl FITC标记的单抗(mouse anti-human VCAM-1)，4℃孵育30min后，洗去未结合抗体，用200μl PBS重悬，流式细胞仪检测，Cell Quest软件分析，计算细胞阳性率。
1.3 统计学分析 各次实验的结果用平均值±标准差作为统计资料。统计分析用t检验或
单因素方差分析，P<0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 诱骗性寡核苷酸与NF-κB结合情况的检测 电泳迁移率转换试验和特异性竞争试验及抗体超迁移试验结果显示:NF-κB的诱骗性寡核苷酸能有效和特异地与NF-κB结合，突变寡核苷酸无此效用(见图1)。
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2.2 细胞对寡核苷酸的摄取情况 流式细胞仪检测显示:脂质体介导法能有效地将寡核苷酸转染内皮细胞，其绝对荧光强度较基线明显升高，有统计学差异(P<0.01)。
2.3 NF-κB的诱骗性寡核苷酸对人血管内皮细胞粘附分子VCAM-1表达的影响
2.3.1 转染后，VCAM-1mRNA的表达情况 RT-PCR结果显示:转染诱骗性寡核苷酸的人血管内皮细胞中，VCAM-1mRNA的表达显著下降，分别较阳性对照组和突变寡核苷酸组降低30.31%和22.6%，均有统计学差异)P<0.05)。见图2。
图1 诱骗性寡核苷酸与NF-kB的亲和力和特异性的检测图2 VCAM-1mRNA的表达略
2.3.2 转染后VCAM-1在细胞表面的表达 用直接抗体 荧光标记流式细胞仪检测各组VCAM-1的表达发现:NF-κB的诱骗性寡核苷酸能使人血管内皮细胞表面的VCAM-1表达显著降低，分别较阳性对照组和突变寡核苷酸组降低47.81%和44.73%，有统计学差异(P<0.05)。见图3。
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图3 VCAM-1在细胞表面的表达略
3 讨论
NF-κB作为一种调节炎症和免疫相关基因的转录因子，在动脉粥样硬化的早期和再狭窄中发挥至关重要的作用 [4，5] 。NF-κB的诱骗性双链寡核苷酸是一种顺式作用元件，与转录因子DNA结合位点的序列相同或相似，在与转录因子结合的基因启动子的调控区域中与内源的顺式DNA序列元件竞争 [6] ，诱骗转录因子与它结合，下调NF-κB所调控的基因表达。本研究以诱骗性寡核苷酸为干预手段，系统地研究其机制和效用，目前报道甚少。
为了明确诱骗性双链寡核苷酸与转录因子NF-κB的结合情况及特异性，我们进行了电泳迁移率转换试验。由于NF-κB的活化需要经历从胞质移位至胞核的过程，故我们用 32 P标记的诱骗性寡核苷酸序列DNA探针，检测核提取物中与转录因子NF-κB的结合情况。活化的NF-κB与标记探针结合后，探针在电泳中的迁移率变慢，形成滞后的电泳条带，特异竞争试验和抗体超迁移试验表明，在TNF-α的刺激的人血管内皮细胞核中，存在着能与诱骗性寡核苷酸序列特异结合的核蛋白，且此种核蛋白为含p65亚基的NF-κB。而诱骗性寡核苷酸的突变对照探针，由于DNA序列的差异而不能与核提取物结合。特异竞争试验和抗体超迁移试验进一步证明了上述结论，这从另一侧面反映了诱骗性寡核苷酸与含有NF-κB的核蛋白结合的特异性。鉴于检测方法的特异性和可靠性，我们可以推断，NF-κB的诱骗性双链寡核苷酸能与内源的顺式DNA序列元件竞争，诱骗转录因子与它结合。
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本研究采用脂质体介导的转染法是基于其已被批准为临床体内直接基因导入的方法，而本研究又是临床研究的前期探索课题。为了监测脂质体介导的短暂转染的效率，即细胞对寡核苷酸的摄取率，我们运用了流式细胞仪对FITC标记的寡核苷酸的细胞内摄取情况进行了评估。据文献 [7] 报道人脐静脉内皮细胞对寡核苷酸的摄取开始于转染后1h，在8h达到高峰并持续24h。本研究在转染后24h测定寡核苷酸在细胞内的摄取情况。结果表明:细胞能摄取脂质体介导的寡核苷酸，且较基线水平明显增加，该结果与国外文献报道 [8，9] 一致，故可认为此法是有效和可靠的。
动脉粥样硬化的炎症学说认为内皮细胞受损可能是动 脉粥样硬化发生的始动步骤。血循环中单核细胞和血管壁内皮细胞间的粘附性的改变具有重要的病理意义，而其中粘附分子的作用极为关键。我们观察NF-κB的诱骗性寡核苷酸对粘附分子VCAM-1mRNA的表达和蛋白质合成的影响，对评价诱骗性寡核苷酸干预的效应和其临床应用价值均有帮助。本研究从mRNA水平、蛋白质水平观察所得结果均提示:在人血管内皮细胞中，NF-κB的诱骗性寡核苷酸能显著抑制TNF-α诱导的血管内皮细胞的VCAM-1的表达，其相应的突变体无此效应。这与文献报道[5，7，10] 的结果一致。
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本研究结果表明，诱骗性寡核苷酸能特异、有效地阻断NF-κB的作用，下调与动脉粥样硬化相关的基因表达，阻碍或延缓病理过程的发生发展。由于NF-κB的诱骗性寡核苷酸能作用于多种基因的转录途径，而不限于某种特异途径的阻断 [2] ，因而此类核酸干预治疗有望成为一种新的“smart bomb”，而不仅仅是“shot gun”。
参考文献
1 Martin RD，HoethM，Warbinek RH，et al.The transcription factor NK-κB andthe regulation of vascular cell function.Arerioscler Thromb Vasc Biol，2000，20，83-88.
2 Meinrad G，Franz JN，Timm D，et al.Activated platelets Induce Monoˉcyte Chemotactic Protein-1Secretion and Surface Expression of Interˉcellular AdhesionMolecule-1on Endothelial Cells.Circulation，1998，98:1164-1171.
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3 Laura M，Danuta M，Katherine S.Measurement of mRNA for E-seˉlectin，VCAM-1and VCAM-1by reverse transcription and the polyˉmerase chain reaction.Journal of Immunological Methods，1994，175:237-246.
4 Defillipi P，Silango L，Tarone G.Regulation of adhesion receptor expresˉsion in endothelial cells.Curr Top Microbiol Immunol，1993，184:87-98.
5 Barath P，Fishbein MC，Cao J，et al.Tumor necrosis factor gene expresˉsion in human vascular intimal smooth muscle cells detected by in situ hybridization.Am J Pathol，1990，137:503-9.6.
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6 Buttery LDK，Springall DR，Chester AH，et al.Inductible nitric promotes the formation and activity of peroxynitrite.Lab Invest，1996，75:77-85.7.
7 Frostegard J，Ulfgren AK，Nyberg P，et al.Cytokine expression in adˉvanced human atherosclerotic plaques:dominance of proinflammatory(Th1)and macrophage-stimulating cytokines.Atherosclerosis，1999，145:33-43.
8 Voisard R，Huber N，Baru R.Different effects of antisense RelA P65and NF-kappaB1P50oligonucleotides on the nuclear factor-kappaB meˉdiated expression of VCAM-1in human coronary endothelial and smooth muscle.BMC Mol Biol，2001，2(1):
, http://www.100md.com
7.9.
9 David C，Hess E，Charles C.Hypertonic.Mannitol Loading of NF-kapˉpaB Transcription Factor Decoy in Huamn BrainMicrovascular Endotheˉlial Cells BlocksUp
regulation of VCAM-1.Stroke，2000，31:1179.10.
10 Christian K，Helmut H，Axel G.Tumor Necrosis Factor-alpha Conˉtributes to Ischemia-and Reperfusion-Induced Endothelial Activiaˉtion in Isolated Heart.Cire Res，1999，84:392-400.
(收稿日期:2003-07-26)
(编辑 罗彬)
作者单位:200025上海第二医科大学附属瑞金医院心内科, http://www.100md.com(陈桢)
关键词 核因子kappaB 诱骗性寡核苷酸 细胞间粘附分子 动脉粥样硬化
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【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-077X(2003)12-1057-03
The effect of decoy oligonucleotides of nuclear
factor-κB on VCAM-1expression in HUVECs
Chen Zhenyue，Lu Guoping
Department of Cardiology，Ruijin Hospital，Shanghai Second Medical University，Shanghai200025.
【Abstract】 Objective To investigate the effects of decoy oligonucleotides(ODNs)of NF-κB on expression of adhesion molecules induced by TNF-αin vitro.Methods Affinity and specificity of decoy ODNs of NF-κB to transcription factor NF-κB were detected by electrophoretic mobility shift assay(EMSA).Intracellular uptake of FITC-labeled oligonucleotides was detected by fluorescence active cell sort(FACS);Adhesion molecules expression was presented by RT-PCR at RNA level，FACS at protein level.The data showed that decoy ODNs of NF-κB can bind totranscription factor NF-κB and has strong affinity and specificity.Results The decoy ODNs can downregulated the expression of VCAM-1stimulated by TNF-αin humanvascular endothelial cells(HUVECs).Conclusion Those observation wre demonstrated that the decoy oligonucleotides of NF-κB can inhibit NF-κB mediated activites and downregulate expression of some gene product as vascular cell adhesion molecule-1(VCAM-1)involving in atherosclerosis.
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Key words NF-κB decoy ODNs VCAM-1 atherosclerosis
有研究发现，在动脉粥样硬化早期出现的单核细胞的聚集，同增加的粘附分子的表达是一致的。细胞间粘附分子(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)是最重要的粘附分子之一，能在动脉粥样硬化过程中调节细胞的粘附及穿越内皮的游移。核因子kappaB(nuclear factor kappaB，NF-κB)是一种能调节多种炎症和免疫基因的重要的转录因子，可与VCAM-1上的κB序列结合，上调其表达，促进单核细胞趋化并粘附于血管壁。诱骗性寡核苷酸可通过与NF-κB的下游基因竞争结合位点，诱骗NF-κB与之结合，从而下调NF-κB所调控的基因的表达(如粘附分子等) [1，2] 。本研究观察诱骗性寡核苷酸与NF-κB结合的亲和力和特异性及NF-κB所调控的粘附分子的表达，阐明作用机制并评价其效果。类似研究在国内外报道甚少，我们对此进行研究，旨在为以核酸为新兴药物防治动脉粥样硬化等疾病做一些前期探索。
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1 材料与方法
1.1 材料 RPMI-1640培养基购自美国GIBCO公司;小牛血清(BSA)购自杭州四季青公司;重组人TNF-α购自BD公司;Lipofectamine、opti-MEMI购自GIBCO公司;丙烯酰胺购自Sigma公司;醋酸胺购自Fisher ScientificLtd.;[γ- 32 P] ATP购自北京亚辉生物医学工程公司;T4寡核苷酸激酶购自Promega;NF-κB p65(C-20)购自SANTA CRUZ Biotechˉnology Inc;琼脂糖购自美国AMRESCO公司;Trizol和DEPC购自美国GIBCO公司;M-MLV逆转录酶、随机引物、dNTP由美国Promega公司生产;RNA酶抑制剂(Rnasin)购自上海华美生物技术公司;Taq酶购自加拿大Biostar公司;mouse anti-human VCAM-1购自R&D公司;人脐静脉内皮细胞株ECV-304购自中科院细胞所。
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1.2 方法
1.2.1 细胞培养及刺激 将ECV-304细胞种于6孔板中，用含10%小牛血清的RPMI-1640培养基在37℃、5%CO 2 条件下培养24～48h。显微镜下发现细胞贴壁生长，并有50%～80%融合。TNF-α(10ng/ml)刺激前，细胞先于血清培养数小时。
1.2.2 电泳迁移率转换试验 核提取物的制备:采用碱性低渗液裂解细胞核、低温高速离心法。含核蛋白的上清液-70℃冻存备用，Bradford法测蛋白浓度。电泳迁移率转换试验:核提取物分别与标记探针(γ- 32 P标记的寡核苷酸)和突变振针(γ- 32 P标记的突变寡核苷酸)在结合缓冲液中充分结合后，行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳;干燥后-70℃放射自显影过夜;用特异性竞争试验(加入50倍未标记探针)和抗体超迁移试验(加入抗p65多克隆抗体)鉴定标记探针和NF-κB结合的特异性。
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1.2.3 寡核苷酸的转染和摄取情况的检测 NF-κB的诱骗性寡核苷酸及突变体序列 [1]经国际互联网查阅文献获得，具体序列如下:诱骗性寡核苷酸:5’AGAGTGGGAATTTCˉCACTCA3’;突变对照寡核苷酸:5’AGAGTGGTCCTTTCˉCACTCA3’;全硫代修饰及FITC标记，由上海生物工程有限公司合成。
分组:阳性对照组(Control);NF-κB的诱骗性寡核苷酸组(decoy ODNs);NF-κB突变寡核苷酸组(decoy-mut ODNs)。
脂质体介导的短暂转染:将各组DNA2μg分别加入Opti-MEMI并与脂质体混匀后室温孵育45min，形成脂质体-DNA复合体后加入种有(1～3)×10 5 的ECV-304细胞的6孔板中，37℃、5%CO 2 孵育6h后，用含10%BSA的1640培养液及无血清培养液替换培养18h后，用10ng/ml的TNF-α作用30min。
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细胞对寡核苷酸摄取情况的检测:FITC标记的和未标记的寡核苷酸转染细胞，24h后收集，用PBS清洗并重悬;流式细胞仪检测，Cell Quest软件分析，计算荧光强度。
1.2.4 逆转录-聚合酶链反应检测VCAM-1mRNA的表达 采用逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polyˉmerase chain reacation，RT-PCR)检测VCAM-1mRNA的表达。转染后收集细胞，Trizol抽提RNA。引物根据国外文 献 [3] 及国际互联网cDNA文库检索、设计，由上海生物工程公司合成。VCAM-1(194bp):5’CCAGATAGACAGCCˉCTCTGA(上游)，5’CCACCACTCATCTCGATTTC3’(下游);条件:起始:94℃，5min;变性:94℃，30s，循环30次;退火:62℃，30s;延伸:72℃，1min。β-actin(532bp):5’AAGGATTCˉCTATGTGGGC3’(上游)，5’CATCTCTTGCTCGAAGTC3’(下游)。2%琼脂糖凝胶电泳后，生物图像分析仪检测密度。
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1.2.5 流式细胞仪检测粘附分子VCAM-1的表达 转染后收集细胞，每管加入10μl FITC标记的单抗(mouse anti-human VCAM-1)，4℃孵育30min后，洗去未结合抗体，用200μl PBS重悬，流式细胞仪检测，Cell Quest软件分析，计算细胞阳性率。
1.3 统计学分析 各次实验的结果用平均值±标准差作为统计资料。统计分析用t检验或
单因素方差分析，P<0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 诱骗性寡核苷酸与NF-κB结合情况的检测 电泳迁移率转换试验和特异性竞争试验及抗体超迁移试验结果显示:NF-κB的诱骗性寡核苷酸能有效和特异地与NF-κB结合，突变寡核苷酸无此效用(见图1)。
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2.2 细胞对寡核苷酸的摄取情况 流式细胞仪检测显示:脂质体介导法能有效地将寡核苷酸转染内皮细胞，其绝对荧光强度较基线明显升高，有统计学差异(P<0.01)。
2.3 NF-κB的诱骗性寡核苷酸对人血管内皮细胞粘附分子VCAM-1表达的影响
2.3.1 转染后，VCAM-1mRNA的表达情况 RT-PCR结果显示:转染诱骗性寡核苷酸的人血管内皮细胞中，VCAM-1mRNA的表达显著下降，分别较阳性对照组和突变寡核苷酸组降低30.31%和22.6%，均有统计学差异)P<0.05)。见图2。
图1 诱骗性寡核苷酸与NF-kB的亲和力和特异性的检测图2 VCAM-1mRNA的表达略
2.3.2 转染后VCAM-1在细胞表面的表达 用直接抗体 荧光标记流式细胞仪检测各组VCAM-1的表达发现:NF-κB的诱骗性寡核苷酸能使人血管内皮细胞表面的VCAM-1表达显著降低，分别较阳性对照组和突变寡核苷酸组降低47.81%和44.73%，有统计学差异(P<0.05)。见图3。
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图3 VCAM-1在细胞表面的表达略
3 讨论
NF-κB作为一种调节炎症和免疫相关基因的转录因子，在动脉粥样硬化的早期和再狭窄中发挥至关重要的作用 [4，5] 。NF-κB的诱骗性双链寡核苷酸是一种顺式作用元件，与转录因子DNA结合位点的序列相同或相似，在与转录因子结合的基因启动子的调控区域中与内源的顺式DNA序列元件竞争 [6] ，诱骗转录因子与它结合，下调NF-κB所调控的基因表达。本研究以诱骗性寡核苷酸为干预手段，系统地研究其机制和效用，目前报道甚少。
为了明确诱骗性双链寡核苷酸与转录因子NF-κB的结合情况及特异性，我们进行了电泳迁移率转换试验。由于NF-κB的活化需要经历从胞质移位至胞核的过程，故我们用 32 P标记的诱骗性寡核苷酸序列DNA探针，检测核提取物中与转录因子NF-κB的结合情况。活化的NF-κB与标记探针结合后，探针在电泳中的迁移率变慢，形成滞后的电泳条带，特异竞争试验和抗体超迁移试验表明，在TNF-α的刺激的人血管内皮细胞核中，存在着能与诱骗性寡核苷酸序列特异结合的核蛋白，且此种核蛋白为含p65亚基的NF-κB。而诱骗性寡核苷酸的突变对照探针，由于DNA序列的差异而不能与核提取物结合。特异竞争试验和抗体超迁移试验进一步证明了上述结论，这从另一侧面反映了诱骗性寡核苷酸与含有NF-κB的核蛋白结合的特异性。鉴于检测方法的特异性和可靠性，我们可以推断，NF-κB的诱骗性双链寡核苷酸能与内源的顺式DNA序列元件竞争，诱骗转录因子与它结合。
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本研究采用脂质体介导的转染法是基于其已被批准为临床体内直接基因导入的方法，而本研究又是临床研究的前期探索课题。为了监测脂质体介导的短暂转染的效率，即细胞对寡核苷酸的摄取率，我们运用了流式细胞仪对FITC标记的寡核苷酸的细胞内摄取情况进行了评估。据文献 [7] 报道人脐静脉内皮细胞对寡核苷酸的摄取开始于转染后1h，在8h达到高峰并持续24h。本研究在转染后24h测定寡核苷酸在细胞内的摄取情况。结果表明:细胞能摄取脂质体介导的寡核苷酸，且较基线水平明显增加，该结果与国外文献报道 [8，9] 一致，故可认为此法是有效和可靠的。
动脉粥样硬化的炎症学说认为内皮细胞受损可能是动 脉粥样硬化发生的始动步骤。血循环中单核细胞和血管壁内皮细胞间的粘附性的改变具有重要的病理意义，而其中粘附分子的作用极为关键。我们观察NF-κB的诱骗性寡核苷酸对粘附分子VCAM-1mRNA的表达和蛋白质合成的影响，对评价诱骗性寡核苷酸干预的效应和其临床应用价值均有帮助。本研究从mRNA水平、蛋白质水平观察所得结果均提示:在人血管内皮细胞中，NF-κB的诱骗性寡核苷酸能显著抑制TNF-α诱导的血管内皮细胞的VCAM-1的表达，其相应的突变体无此效应。这与文献报道[5，7，10] 的结果一致。
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本研究结果表明，诱骗性寡核苷酸能特异、有效地阻断NF-κB的作用，下调与动脉粥样硬化相关的基因表达，阻碍或延缓病理过程的发生发展。由于NF-κB的诱骗性寡核苷酸能作用于多种基因的转录途径，而不限于某种特异途径的阻断 [2] ，因而此类核酸干预治疗有望成为一种新的“smart bomb”，而不仅仅是“shot gun”。
参考文献
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(收稿日期:2003-07-26)
(编辑 罗彬)
作者单位:200025上海第二医科大学附属瑞金医院心内科, http://www.100md.com(陈桢)