移植器官缺血再灌注损伤与细胞凋亡
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-6115(2003)11-0996-03
缺血再灌注损伤是移植器官早期无功能的最重要原因，近年来的研究表明细胞凋亡是缺血再灌注损伤早期细胞死亡的主要方式，造成移植物失功的重要原因。现将移植器官缺血再灌注损伤时细胞凋亡及其调控机制的研究进展综述如下。
1 细胞凋亡的概念及特点
细胞凋亡(apoptosis)是一种具有独特的形态学和生化改变的与坏死截然不同的另一种死亡方式，是一种经基因严密调控的需能量参与的过程。1972年，病理学家Kerr首次提出了细胞凋亡这一概念。它只涉及单个细胞的死亡，其典型的形态改变[1] 是细胞缩小、胞质凝缩，内质网疏松并与胞膜融合;核糖体等聚集，但无结构破坏，染色质固缩，密度增高并集聚于核膜周边，嗜碱性增强，核仁裂解，继而细胞膜出泡、内陷，将细胞自行分割成多个具有膜包裹的凋亡小体(apoptosis body)。凋亡小体可迅速被周围具有吞噬功能的细胞如巨噬细胞、上皮细胞等吞噬、降解，整个过程无细胞质漏出，故而无炎症反应。在凋亡过程中激活核酸内切酶 [2] 在组蛋白八聚体之间的连接区切开DNA，使其成为180～200bp整数倍的DNA片段。而细胞死亡的另一种方式为坏死，其特点为细胞胀大，细胞器肿胀、破坏、辨认不清，晚期有胞核破碎，染色质断裂成许多不规则的小凝块，胞膜破裂，细胞内容物外逸，诱发周围细胞的炎症反应。因此坏死一般是成片发生的，在形态上易与凋亡相区别。根据细胞凋亡独特的形态学和生化改变，其常用的检测方法有琼脂糖凝胶电泳、原位末端标记、流式细胞仪及电镜等。
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2 细胞凋亡的基因调控
2.1 Bcl-2家族 Bcl-2(即B细胞淋巴瘤/白血病-2基因)是1985年首先在B细胞滤泡性淋巴瘤中发现的。Bcl家族是目前备受关注的与细胞凋亡关系密切的基因之一，它包括Bcl-2，Bax，Bal-x L ，Bab等 [3] 。其中Bcl-2及Bcl-x L 主要抑制细胞凋亡，而Bax则促进凋亡 [4] 。Bcl-2家族成员中可发生相互作用即彼此之间的同源或异源聚合共同调节细胞凋亡。其中Bcl-2/Bax的比例可决定细胞的命运，其比例增高，细胞不易发生凋亡，而比例降低则导致细胞凋亡。Bcl-2阻碍细胞凋亡的机制[5] 为:Bax诱导细胞色素C的释放，激活Caspase-3(Caspase-3是含有半胱氨酸天冬氨酸特异的蛋白酶-3)，引起膜泡形成，核碎裂和细胞死亡。而Bcl-2可能与凋亡促进基因Bax拮抗，抑制细胞色素C自线粒体释放至胞质，阻止胞质细胞色素C对Caspase蛋白酶的激活。Bcl-2还能促进谷胱甘肽进入细胞核，从而改变核内氧化还原反应，阻止Caspase蛋白酶的激活和其他核改变，抑制细胞凋亡。
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2.2 P53 P53基因是一种重要的抗癌基因。近年来人们发现P53与细胞凋亡有密切关系 [6] 。P53基因正常时分为野生型与突变型两种，目前认为只有野生型P53才具有诱导细胞凋亡的作用，而突变型P53则抑制细胞凋亡。野生型P53诱导细胞凋亡的机制可能是:(1)P53是一种核内的磷酸蛋白，能对复杂的DNA损伤系统进行调控，起转录因子的作用。DNA损害使P53表达增强，P53产物则激活其下游的WAF/GiP1基因。WAF/GiP1基因编码P21蛋白，P21能抑制细胞周期素依赖性激酶(cyclin dependent kinase，CDK)的活性，从而抑制细胞周期进程。在细胞DNA损伤时，P53转译水平将升高，从而促进P21表达，使细胞停滞在G 1 ～S期之间，抑制细胞分裂，为细胞赢得修复DNA损伤的时间。(2)P53基因降低内源性Bcl-2蛋白表达和抑制其功能。(3)P53可作为Bax基因转录直接激动剂，提高细胞内Bax蛋白的表达，使Bcl-2/Bax蛋白比例改变而促进细胞凋亡。(4)P53基因增强CD 95 、CD 95 L基因表达，从而激活敏感的CD 95 信号传递途径。在此途径中，FADD(Fas-Associated Death Domain，Fas相关死亡区)和其同系物FLICE(ICE/CED-3家族的最新成员)结合，形成细胞内CD 95 相关的诱导死亡信号复合物(DISC)。DISC形成后，通过ICE样蛋白酶传递凋亡信号，催化相应反应导致细胞凋亡。
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2.3 c-myc 近年研究发现c-myc基因具有刺激细胞增生和凋亡的双重调节作用。作为转录因子，c-myc蛋白一方面激活那些介导细胞增生的基因，另一方面也激活介导凋亡的基因，使细胞增生或凋亡。若同时接受了其他附加存活因素，如生长因子存在、Bcl-2表达等，则增生占优势;反之发生细胞凋亡。Bcl-2能够阻断c-myc诱导凋亡的作用，但不影响其增生作用。
2.4 Fas Fas又称Apo-1，属于肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor，TNF)受体/生长因子受体超家族，与Fas配体结合是引起细胞凋亡的主要途径之一 [7] 。Fas L与Fas结合后，首先使Fas形成能传递信号的活性形式—三聚体，其中与Fas发生反应的蛋白是Fas死亡结构域相关蛋白，此蛋白的C末端有一个与Fas同源的DD，并通过此DD形成二聚体而相互作用。FADD的N末端称为死亡效应结构域(Death Effector Domain，DED或称MORT1结构域)，该结构负责将凋亡信号传递至凋亡蛋白酶Caspase8，从而引起Caspase家族的一系列酶联反应 [8] ，激活的Caspase作用于不同的底物产生不同的效应，导致表达Fas的细胞发生凋亡。由于表达Fas的细胞较为多见，而表达Fas L的细胞不多，因此组织细胞是否发生凋亡很大程度上取决于组织中是否有Fas L的表达。
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3 移植器官缺血再灌注损伤时细胞凋亡
缺血再灌注损伤是移植器官早期无功能的最重要原因，近年来的研究表明细胞凋亡是缺血再灌注损伤早期细胞死亡的主要方式，是造成移植物失功的重要原因。Borghi等 [9] 观察了16例临床肝移植术后细胞凋亡情况发现整个切片肝细胞凋亡指数为18.7%，而且肝细胞凋亡指数与冷缺血时间无关，与术后天门冬氨酰转氨酶水平呈正相关，与血清V因子水平呈负相关。因此认为肝移植术后较多的凋亡细胞与肝缺血再灌注损伤有关。Gao等 [10] 研究发现单纯冷保存肝16h，未发现凋亡细胞，而保存8h及16h后分别予以含氧再灌注1h则肝窦内皮细胞的凋亡细胞数显著增加，故认为肝窦内皮细胞的凋亡是肝移植缺血再灌注损伤造成移植肝失功的主要原因。张浩等 [11] 的研究表明大鼠冷灌注保存及再灌注后肝脏均有肝细胞凋亡发生，且呈阶段性。在冷灌注保存肝组织中可检测到bax及Fas，未检测到Bcl-2，肝移植再灌注后肝组织中可检测到bax、Fas及Bcl-2。Rentsch等 [12] 研究也证实随着冷灌注保存及再灌注时间的延长大鼠移植肝细胞凋亡数显著增加，而且bax表达增强而caspase-3表达降低，Stammberger等 [13] 的研究证实大鼠移植肺的凋亡指数与冷保存时间无关，与移植缺血再灌注损伤有关，且移植物含氧再灌注2h肺细胞凋亡达到高峰，其后逐渐降低。Fischer等 [14] 研究发现大鼠肺冷保存20min、6h及12h后细胞死亡率<2%，而保存18h及24h后细胞死亡率则分别为11%及27%，细胞死亡方式主要为坏死。以上时间段冷保存的肺移植后再灌注2h，细胞死亡方式则发生变化，6h及12h组约有30%细胞凋亡，仅有2%的细胞坏死。而18h及24h组分别有30%及29%的细胞坏死，仅有1%细胞凋亡。而移植后肺功能检测的结果表明其与保存时间及坏死细胞百分比负相关。因此认为细胞凋亡是移植肺缺血再灌注损伤早期细胞死亡的主要方式之一，对肺功能的影响远较细胞坏死低。Burns等 [15] 通过对11例接受活体供肾及25例接受尸肾的肾移植患者的研究发现尸肾移植后凋亡细胞数明显高于活体供肾，而且尸肾冷保存30h移植后凋亡细胞数明显高于冷保存24h以内。因此认为肾移植术后的凋亡细胞与肾缺血再灌注损伤有关。Shah等 [16] 比较平衡盐与UW液冷保存后再移植小肠后发现UW液冷保存移植小肠凋亡细胞数明显高于平衡盐保存者。Drognitz等 [17] 分别用UW液及生理盐水灌注保存胰腺6h及18h后移植灌注2h发现生理盐水灌注保存组胰腺腺泡细胞凋亡较多，保存18h比保存6h组细胞凋亡数增多，因此认为缺血再灌注损伤可引起胰腺腺泡细胞凋亡，细胞凋亡与冷保存时间有关，UW液可减轻缺血再灌注损伤。Fujimoto等 [18] 阻断脾动脉建立胰腺缺血再灌注模型，观察热缺血60min再灌注后72h内胰腺变化，2h后即有明显的血管渗出，48h后细胞凋亡数增多。Panizo等 [19] 的研究证实心脏移植术后的凋亡细胞与缺血再灌注损伤有关。
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4 对策及展望
当人们发现缺血再灌注损伤会引起细胞凋亡，而且细胞凋亡及缺血再灌注损伤造成移植物失功的主要原因，细胞凋亡又是由基因调控的。因此又为减轻缺血再灌注对移植物的损伤开辟了新的治疗途径。只要调高抑制凋亡基因的表达，或者阻断凋亡信号的传导途径，则可以减轻甚至消除缺血再灌注对移植物的损伤。Bilbao等 [20] 对供体大鼠转导人Bcl-2基因后可明显减轻移植肝缺血再灌注损伤，提高其存活率。Grunenfelder等 [21] 通过转染TGF-β，调高Bcl-2基因的表达，减轻大鼠移植心脏的缺血再灌注损伤，提高其心脏移植的存活率。Grunenfelder等 [22] 还通过应用caspase-3抑制剂来阻断凋亡信号的传导途径从而减少移植心脏因缺血再灌注损伤而造成的细胞凋亡。近来Coito等 [23] 发现亚铁血红素加氧酶-1基因转导的大鼠进行肝移植后Bcl-2、bag-1等抑制细胞凋亡的基因表达增强，从而减少移植肝脏细胞凋亡，减轻缺血再灌注损伤。总之，随着 对细胞凋亡、细胞凋亡基因调控及凋亡信号传导途径的研究不断深入，人们一定能够发现更多有效的药物及转导基因来减轻甚至消除缺血再灌注对移植物的损伤。
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参考文献
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, 百拇医药 22 Grunenfelder J，Miniati DN，Murata S，et al.Upregulation of Bcl-2through caspase-3inhibition ameliorates ischemia/reperfusion injury in rat cardiac allografts.Circulation，2001，104(12):202-206.
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作者单位: 221004 江苏徐州解放军第97医院普通外科(中心实验室)
(收稿日期:2003-05-31)
(编辑 小川), 百拇医药(张召辉(综述))
缺血再灌注损伤是移植器官早期无功能的最重要原因，近年来的研究表明细胞凋亡是缺血再灌注损伤早期细胞死亡的主要方式，造成移植物失功的重要原因。现将移植器官缺血再灌注损伤时细胞凋亡及其调控机制的研究进展综述如下。
1 细胞凋亡的概念及特点
细胞凋亡(apoptosis)是一种具有独特的形态学和生化改变的与坏死截然不同的另一种死亡方式，是一种经基因严密调控的需能量参与的过程。1972年，病理学家Kerr首次提出了细胞凋亡这一概念。它只涉及单个细胞的死亡，其典型的形态改变[1] 是细胞缩小、胞质凝缩，内质网疏松并与胞膜融合;核糖体等聚集，但无结构破坏，染色质固缩，密度增高并集聚于核膜周边，嗜碱性增强，核仁裂解，继而细胞膜出泡、内陷，将细胞自行分割成多个具有膜包裹的凋亡小体(apoptosis body)。凋亡小体可迅速被周围具有吞噬功能的细胞如巨噬细胞、上皮细胞等吞噬、降解，整个过程无细胞质漏出，故而无炎症反应。在凋亡过程中激活核酸内切酶 [2] 在组蛋白八聚体之间的连接区切开DNA，使其成为180～200bp整数倍的DNA片段。而细胞死亡的另一种方式为坏死，其特点为细胞胀大，细胞器肿胀、破坏、辨认不清，晚期有胞核破碎，染色质断裂成许多不规则的小凝块，胞膜破裂，细胞内容物外逸，诱发周围细胞的炎症反应。因此坏死一般是成片发生的，在形态上易与凋亡相区别。根据细胞凋亡独特的形态学和生化改变，其常用的检测方法有琼脂糖凝胶电泳、原位末端标记、流式细胞仪及电镜等。
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2 细胞凋亡的基因调控
2.1 Bcl-2家族 Bcl-2(即B细胞淋巴瘤/白血病-2基因)是1985年首先在B细胞滤泡性淋巴瘤中发现的。Bcl家族是目前备受关注的与细胞凋亡关系密切的基因之一，它包括Bcl-2，Bax，Bal-x L ，Bab等 [3] 。其中Bcl-2及Bcl-x L 主要抑制细胞凋亡，而Bax则促进凋亡 [4] 。Bcl-2家族成员中可发生相互作用即彼此之间的同源或异源聚合共同调节细胞凋亡。其中Bcl-2/Bax的比例可决定细胞的命运，其比例增高，细胞不易发生凋亡，而比例降低则导致细胞凋亡。Bcl-2阻碍细胞凋亡的机制[5] 为:Bax诱导细胞色素C的释放，激活Caspase-3(Caspase-3是含有半胱氨酸天冬氨酸特异的蛋白酶-3)，引起膜泡形成，核碎裂和细胞死亡。而Bcl-2可能与凋亡促进基因Bax拮抗，抑制细胞色素C自线粒体释放至胞质，阻止胞质细胞色素C对Caspase蛋白酶的激活。Bcl-2还能促进谷胱甘肽进入细胞核，从而改变核内氧化还原反应，阻止Caspase蛋白酶的激活和其他核改变，抑制细胞凋亡。
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2.2 P53 P53基因是一种重要的抗癌基因。近年来人们发现P53与细胞凋亡有密切关系 [6] 。P53基因正常时分为野生型与突变型两种，目前认为只有野生型P53才具有诱导细胞凋亡的作用，而突变型P53则抑制细胞凋亡。野生型P53诱导细胞凋亡的机制可能是:(1)P53是一种核内的磷酸蛋白，能对复杂的DNA损伤系统进行调控，起转录因子的作用。DNA损害使P53表达增强，P53产物则激活其下游的WAF/GiP1基因。WAF/GiP1基因编码P21蛋白，P21能抑制细胞周期素依赖性激酶(cyclin dependent kinase，CDK)的活性，从而抑制细胞周期进程。在细胞DNA损伤时，P53转译水平将升高，从而促进P21表达，使细胞停滞在G 1 ～S期之间，抑制细胞分裂，为细胞赢得修复DNA损伤的时间。(2)P53基因降低内源性Bcl-2蛋白表达和抑制其功能。(3)P53可作为Bax基因转录直接激动剂，提高细胞内Bax蛋白的表达，使Bcl-2/Bax蛋白比例改变而促进细胞凋亡。(4)P53基因增强CD 95 、CD 95 L基因表达，从而激活敏感的CD 95 信号传递途径。在此途径中，FADD(Fas-Associated Death Domain，Fas相关死亡区)和其同系物FLICE(ICE/CED-3家族的最新成员)结合，形成细胞内CD 95 相关的诱导死亡信号复合物(DISC)。DISC形成后，通过ICE样蛋白酶传递凋亡信号，催化相应反应导致细胞凋亡。
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2.3 c-myc 近年研究发现c-myc基因具有刺激细胞增生和凋亡的双重调节作用。作为转录因子，c-myc蛋白一方面激活那些介导细胞增生的基因，另一方面也激活介导凋亡的基因，使细胞增生或凋亡。若同时接受了其他附加存活因素，如生长因子存在、Bcl-2表达等，则增生占优势;反之发生细胞凋亡。Bcl-2能够阻断c-myc诱导凋亡的作用，但不影响其增生作用。
2.4 Fas Fas又称Apo-1，属于肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor，TNF)受体/生长因子受体超家族，与Fas配体结合是引起细胞凋亡的主要途径之一 [7] 。Fas L与Fas结合后，首先使Fas形成能传递信号的活性形式—三聚体，其中与Fas发生反应的蛋白是Fas死亡结构域相关蛋白，此蛋白的C末端有一个与Fas同源的DD，并通过此DD形成二聚体而相互作用。FADD的N末端称为死亡效应结构域(Death Effector Domain，DED或称MORT1结构域)，该结构负责将凋亡信号传递至凋亡蛋白酶Caspase8，从而引起Caspase家族的一系列酶联反应 [8] ，激活的Caspase作用于不同的底物产生不同的效应，导致表达Fas的细胞发生凋亡。由于表达Fas的细胞较为多见，而表达Fas L的细胞不多，因此组织细胞是否发生凋亡很大程度上取决于组织中是否有Fas L的表达。
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3 移植器官缺血再灌注损伤时细胞凋亡
缺血再灌注损伤是移植器官早期无功能的最重要原因，近年来的研究表明细胞凋亡是缺血再灌注损伤早期细胞死亡的主要方式，是造成移植物失功的重要原因。Borghi等 [9] 观察了16例临床肝移植术后细胞凋亡情况发现整个切片肝细胞凋亡指数为18.7%，而且肝细胞凋亡指数与冷缺血时间无关，与术后天门冬氨酰转氨酶水平呈正相关，与血清V因子水平呈负相关。因此认为肝移植术后较多的凋亡细胞与肝缺血再灌注损伤有关。Gao等 [10] 研究发现单纯冷保存肝16h，未发现凋亡细胞，而保存8h及16h后分别予以含氧再灌注1h则肝窦内皮细胞的凋亡细胞数显著增加，故认为肝窦内皮细胞的凋亡是肝移植缺血再灌注损伤造成移植肝失功的主要原因。张浩等 [11] 的研究表明大鼠冷灌注保存及再灌注后肝脏均有肝细胞凋亡发生，且呈阶段性。在冷灌注保存肝组织中可检测到bax及Fas，未检测到Bcl-2，肝移植再灌注后肝组织中可检测到bax、Fas及Bcl-2。Rentsch等 [12] 研究也证实随着冷灌注保存及再灌注时间的延长大鼠移植肝细胞凋亡数显著增加，而且bax表达增强而caspase-3表达降低，Stammberger等 [13] 的研究证实大鼠移植肺的凋亡指数与冷保存时间无关，与移植缺血再灌注损伤有关，且移植物含氧再灌注2h肺细胞凋亡达到高峰，其后逐渐降低。Fischer等 [14] 研究发现大鼠肺冷保存20min、6h及12h后细胞死亡率<2%，而保存18h及24h后细胞死亡率则分别为11%及27%，细胞死亡方式主要为坏死。以上时间段冷保存的肺移植后再灌注2h，细胞死亡方式则发生变化，6h及12h组约有30%细胞凋亡，仅有2%的细胞坏死。而18h及24h组分别有30%及29%的细胞坏死，仅有1%细胞凋亡。而移植后肺功能检测的结果表明其与保存时间及坏死细胞百分比负相关。因此认为细胞凋亡是移植肺缺血再灌注损伤早期细胞死亡的主要方式之一，对肺功能的影响远较细胞坏死低。Burns等 [15] 通过对11例接受活体供肾及25例接受尸肾的肾移植患者的研究发现尸肾移植后凋亡细胞数明显高于活体供肾，而且尸肾冷保存30h移植后凋亡细胞数明显高于冷保存24h以内。因此认为肾移植术后的凋亡细胞与肾缺血再灌注损伤有关。Shah等 [16] 比较平衡盐与UW液冷保存后再移植小肠后发现UW液冷保存移植小肠凋亡细胞数明显高于平衡盐保存者。Drognitz等 [17] 分别用UW液及生理盐水灌注保存胰腺6h及18h后移植灌注2h发现生理盐水灌注保存组胰腺腺泡细胞凋亡较多，保存18h比保存6h组细胞凋亡数增多，因此认为缺血再灌注损伤可引起胰腺腺泡细胞凋亡，细胞凋亡与冷保存时间有关，UW液可减轻缺血再灌注损伤。Fujimoto等 [18] 阻断脾动脉建立胰腺缺血再灌注模型，观察热缺血60min再灌注后72h内胰腺变化，2h后即有明显的血管渗出，48h后细胞凋亡数增多。Panizo等 [19] 的研究证实心脏移植术后的凋亡细胞与缺血再灌注损伤有关。
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4 对策及展望
当人们发现缺血再灌注损伤会引起细胞凋亡，而且细胞凋亡及缺血再灌注损伤造成移植物失功的主要原因，细胞凋亡又是由基因调控的。因此又为减轻缺血再灌注对移植物的损伤开辟了新的治疗途径。只要调高抑制凋亡基因的表达，或者阻断凋亡信号的传导途径，则可以减轻甚至消除缺血再灌注对移植物的损伤。Bilbao等 [20] 对供体大鼠转导人Bcl-2基因后可明显减轻移植肝缺血再灌注损伤，提高其存活率。Grunenfelder等 [21] 通过转染TGF-β，调高Bcl-2基因的表达，减轻大鼠移植心脏的缺血再灌注损伤，提高其心脏移植的存活率。Grunenfelder等 [22] 还通过应用caspase-3抑制剂来阻断凋亡信号的传导途径从而减少移植心脏因缺血再灌注损伤而造成的细胞凋亡。近来Coito等 [23] 发现亚铁血红素加氧酶-1基因转导的大鼠进行肝移植后Bcl-2、bag-1等抑制细胞凋亡的基因表达增强，从而减少移植肝脏细胞凋亡，减轻缺血再灌注损伤。总之，随着 对细胞凋亡、细胞凋亡基因调控及凋亡信号传导途径的研究不断深入，人们一定能够发现更多有效的药物及转导基因来减轻甚至消除缺血再灌注对移植物的损伤。
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作者单位: 221004 江苏徐州解放军第97医院普通外科(中心实验室)
(收稿日期:2003-05-31)
(编辑 小川), 百拇医药(张召辉(综述))