细胞周期蛋白D1在食管癌中的表达和意义
【摘要】 目的 研究人食管癌中原癌基因CCND1蛋白产物cyclin D1的表达和临床意义。方法 用免疫组织化学方法(SP)检测了45例食管鳞癌，15例癌旁组织和15例正常粘膜组织中cyclin D1蛋白的表达。结果 45例食管鳞癌cyclin D1蛋白表达阳性率57.8%，明显高于癌旁组织(20%)和食管粘膜组织(13.3%)，侵犯粘膜与侵及外膜组相比，有淋巴结转移组与无淋巴结转移组相比差异均有显著性(P<0.05)。结论 cyclin D1蛋白表达可以预测食管癌的预后，有可能作为食管癌临床分期的参考指标。
关键词 细胞周期蛋白D1 基因表达 食管肿瘤
【文献标识码】 A 【文章编号】 1726-7587(2003)10-0870-02
Expression and significance of cyclin D1 protein
, http://www.100md.com
in the squamous carcinoma of esophagus
Yang Weidong，Sun Yaochang，Hu Liwei
Department of Thoracic Surgery，the First Hospital of Yichang，Yichang443000.
【Abstract】 Objective To study the expression and significance of cyclin D1protein in human squamous carˉcinoma of esophagus.Methods Using sterptavidin peroxidase(SP)method，we detected the expression of cyclin D1protein in 45 squamous carcinoma of esophagus.15Adjacent non-tumorous esophageal specimens and15normal squamous tissues.Results The positive rate of cyclin D1protein in squamous carcinoma of esophagus was57.8%(26/45)，much greater than20%(3/15)in adjacent non-tumorous esophageal specimens and13.3%(2/15)in normal squamous mucosa.There was a significant difference of cyclin D1protein between the invasioning mucosa groups and the invasioning advenitia groups，also it correlated with lymph node metastases(P<0.05).Conclusion The expression of cyclin D1protein would be play an important role in the development of human esophageal cancers，so could suggest the prognostic for cancer of esophagus.
, 百拇医药
Key words cyclin D1protein expression carcinoma of esophagus
细胞周期素D(cyclin D)是近几年才被确定的原癌基因，它通过促进G 1 →S期的转变而促进细胞周期，起到调节组织细胞增殖的作用，已经发现cyclin D1基因在多种肿瘤细胞中存在扩增和过度表达，我们应用S-P免疫组织化学方法研究细胞周期蛋白D1在45例人食管鳞状细胞癌组织中的表达，并与癌旁食管组织及正常食管粘膜组织对比，探讨细胞周期蛋白D1在肿瘤发生中的作用。
1 材料与方法
1.1 材料 45例食管癌组织和15例癌旁食管组织(距离肿瘤超过5cm)均取自第二军医大学附属长征医院胸心外科经手术切除的食管标本，15例正常食管组织取自湖北省宜昌市第一人民医院胃镜室纤维胃镜活检标本。45例食管癌中，肿瘤浸润粘膜层7例，浸润肌层27例，侵犯全层11例，有淋巴结转移26例。男女之比4.6:1，年龄41～80岁，平均57.6岁。
, 百拇医药
1.2 方法 标本常规石蜡包埋，4μm切片。采用免疫组织化学SP法检测。鼠抗人细胞周期蛋白D1单克隆抗体(DCS/6)及加强型SP试剂盒购自福州迈新生物技术公司，染色步骤按说明书进行，以PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照。
1.3 免疫组化结果判定 cyclin D1染色阳性为细胞核和(或)细胞质呈不均匀棕黄色细颗粒状或棕褐色团块状。按染色强弱分为-(阴性)、±(弱阳性)、+(阳性)、++(强阳性)。
1.4 统计学方法 采用χ 2 检验。
2 结果
2.1 cyclin D1蛋白的表达 45例食管鳞癌cyclin D1蛋白阳性表达为26例，阳性表达率为57.8%;15例癌旁组织cyˉclin D1蛋白阳性表达为3例，阳性表达率为20%;15例正常粘膜cyclin D1蛋白阳性表达为2例，阳性表达率为13.3%。食管鳞癌cyclin D1蛋白的表达明显高于癌旁组织和正常食管组织，差异有显著性(P<0.05)，染色强度食管鳞癌细胞高于正常组织和癌旁组织。正常粘膜与食管鳞癌相比，χ 2 =8.93，P<0.01;癌旁组织与食管鳞癌相比，χ 2=6.43，P<0.05。
, 百拇医药
2.2 cyclin D1蛋白的表达和肿瘤侵犯深度的关系 45例食管鳞癌按肿瘤侵犯的深度分为粘膜层7例，肌层27例，外膜层(全层)11例，cyclin D1蛋白的阳性表达率分别为28.6%、55.6%、81.2%，cyclin D1蛋白在肿瘤侵犯粘膜层中的阳性表达率明显低于侵犯全层组，差异有显著性(P<0.05)。肿瘤侵犯外膜与粘膜层相比，χ 2 =5.1，P<0.05。
2.3 cyclin D1蛋白和淋巴结转移状况的关系 45例食管鳞癌按淋巴结转移状况分为有淋巴结转移26例，无淋巴结转移19例，cyclin D1蛋白的阳性表达率分别为69.2%，31.6%，cyclin D1蛋白在淋巴结转移组中的阳性表达率高于无淋巴结转移组，差异有显著性(P<0.05)。有淋巴结转移与无淋巴转移相比，χ 2 =6.25，P<0.05。
3 讨论
细胞周期蛋白D1是由位于人类第11号染色体短臂11q13上的CCND1基因编码，由292个氨基酸组成，分子量为34kD，其中56-114位氨基酸序列为其结构的主要部分，称为周期素盒子(cyclin box)。Sicinski [1] 的研究认为cyclin D1是大多数组织增殖所必需的。其作用机理目前认为与肿瘤抑制性蛋白Rb蛋白有关。cyclin D1与细胞周期依赖性激酶结合后可以使Rb蛋白磷酸化，导致转录因子E 2 F解离发挥效应，从而促进细胞周期。
, http://www.100md.com
目前的研究发现在食管癌发生、演变过程中存在着一系列的遗传改变。Jiang [2] 在20%的人食管鳞癌中发现了cyclin D1和hst-1基因的联合扩增，这个发现第一次提供了cyclin D1基因在人类食管癌中扩增的依据。随后Tahara [3] 、kiriu [4] 等也证实了cyclin D1基因在人食管癌中的扩增，同时伴随着cyclin D1蛋白的过度表达。这些都揭示了cyclin D1基因的扩增和过度表达是人类恶性食管癌的一个好的生物学标记，cyclin D1蛋白的检测可以作为食管癌的辅助诊断。关于cyclin D1与食管癌预后的关系Tahara的研究认为cyclin D1基因的扩增与食管癌的发生、发展，肿瘤的侵犯深度和远处的转移密切相关;国内祝淑钗[5] 等的研究也指出cyclin D1蛋白的表达和不表达相比，生存率差异有显著性。这些结果提示cyclin D1蛋白的表达可以预测食管癌的预后，有可能作为食管癌临床分期的参考指标。
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我们通过单克隆抗体免疫组织化学方法研究结果表明，在食管鳞癌组织中cyclin D1蛋白的阳性表达为57.8%，明显高于正常食管粘膜组织(13.3%)，表明人类食管癌的发生与细胞周期蛋白D1的存在密切相关，亦说明细胞周期蛋白D1可以作为食管癌诊断的一个分子标记物。食管癌旁组织中cyclin D1蛋白阳性表达率为20%，明显低于食 管癌组织(57.8%)，但与正常食管粘膜组织(13.3%)相比差异无显著性，说明距离肿瘤5cm以上的食管癌旁组织可以看作正常食管粘膜组织，这与肿瘤手术切除原则是相吻合的。本研究中正常食管粘膜组织和癌旁组织中有3例出现细胞周期蛋白D1的弱阳性，2例阳性，可能原因:(1)在正常组织的上皮增殖区存在着极低水平的细胞周期蛋白D1;(2)炎性因子的刺激可能使细胞周期蛋白D1的表达略有增高;(3)抗原的修复也可能造成一定的假阳性。
临床资料分析发现，食管癌侵犯全层组中cyclin D1蛋白的阳性表达率为81.2%，明显高于肿瘤侵犯粘膜组(28.6%);有淋巴结转移组cyclin D1蛋白阳性表达率为69.2%，明显高于无淋巴结转移组(31.2%)，这些结果均提示晚期食管癌细胞周期蛋白D1的表达明显高于早期食管癌，因此，细胞周期蛋白D1是食管癌预后的重要标志物。
, 百拇医药
近几年的研究充分显示细胞周期与细胞癌变不是相互独立的事件。在人类食管癌中发现，细胞周期各个阶段的调节因子都有不同程度的异常，cyclin D1基因(CCND1)就是这样一个已明确的原癌基因。由于细胞癌变是基因连续突变结果，因此细胞周期相关癌基因(如cyclin D1、P16、Rb)与细胞增殖相关基因(如ras、c-myc、c-fos)在食管癌中是否存在协同作用，其确切机制如何有待进一步的研究。
参考文献
1 Sicinsdki P，Joana A，Liu D，et al.cell，1995，82:621-630.
2 Jiang W，Scott M，Tomita N，et al.Amplification and Expression of the human cyclinD Gene in esophageal Cancer.Cancer Res，1992，52:2980-2983.
, http://www.100md.com
3 Thara-E.Genetic alterations in human gastrointestinal cancers.Canˉcer，1995，75(6):1410-1417.
4 Kriu H，Yokozaki H，Yasui W，et al.Microsatellite instability associated with primary head and neck cancers and second esophageal cancers.Jpn-J-Clin-Oncol，1998，28(12):733-739.
5 祝淑钗，翟福山，殷蔚伯，等.周期素D1蛋白对食管癌预后的影响.中华肿瘤杂志，1998，20(2):129-131.
作者单位:1 443000湖北省宜昌市第一人民医院胸外科
2 上海长征医院胸外科
(收稿日期:2003-09-30)
(编辑 刘娜), 百拇医药(杨卫东)
关键词 细胞周期蛋白D1 基因表达 食管肿瘤
【文献标识码】 A 【文章编号】 1726-7587(2003)10-0870-02
Expression and significance of cyclin D1 protein
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in the squamous carcinoma of esophagus
Yang Weidong，Sun Yaochang，Hu Liwei
Department of Thoracic Surgery，the First Hospital of Yichang，Yichang443000.
【Abstract】 Objective To study the expression and significance of cyclin D1protein in human squamous carˉcinoma of esophagus.Methods Using sterptavidin peroxidase(SP)method，we detected the expression of cyclin D1protein in 45 squamous carcinoma of esophagus.15Adjacent non-tumorous esophageal specimens and15normal squamous tissues.Results The positive rate of cyclin D1protein in squamous carcinoma of esophagus was57.8%(26/45)，much greater than20%(3/15)in adjacent non-tumorous esophageal specimens and13.3%(2/15)in normal squamous mucosa.There was a significant difference of cyclin D1protein between the invasioning mucosa groups and the invasioning advenitia groups，also it correlated with lymph node metastases(P<0.05).Conclusion The expression of cyclin D1protein would be play an important role in the development of human esophageal cancers，so could suggest the prognostic for cancer of esophagus.
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Key words cyclin D1protein expression carcinoma of esophagus
细胞周期素D(cyclin D)是近几年才被确定的原癌基因，它通过促进G 1 →S期的转变而促进细胞周期，起到调节组织细胞增殖的作用，已经发现cyclin D1基因在多种肿瘤细胞中存在扩增和过度表达，我们应用S-P免疫组织化学方法研究细胞周期蛋白D1在45例人食管鳞状细胞癌组织中的表达，并与癌旁食管组织及正常食管粘膜组织对比，探讨细胞周期蛋白D1在肿瘤发生中的作用。
1 材料与方法
1.1 材料 45例食管癌组织和15例癌旁食管组织(距离肿瘤超过5cm)均取自第二军医大学附属长征医院胸心外科经手术切除的食管标本，15例正常食管组织取自湖北省宜昌市第一人民医院胃镜室纤维胃镜活检标本。45例食管癌中，肿瘤浸润粘膜层7例，浸润肌层27例，侵犯全层11例，有淋巴结转移26例。男女之比4.6:1，年龄41～80岁，平均57.6岁。
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1.2 方法 标本常规石蜡包埋，4μm切片。采用免疫组织化学SP法检测。鼠抗人细胞周期蛋白D1单克隆抗体(DCS/6)及加强型SP试剂盒购自福州迈新生物技术公司，染色步骤按说明书进行，以PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照。
1.3 免疫组化结果判定 cyclin D1染色阳性为细胞核和(或)细胞质呈不均匀棕黄色细颗粒状或棕褐色团块状。按染色强弱分为-(阴性)、±(弱阳性)、+(阳性)、++(强阳性)。
1.4 统计学方法 采用χ 2 检验。
2 结果
2.1 cyclin D1蛋白的表达 45例食管鳞癌cyclin D1蛋白阳性表达为26例，阳性表达率为57.8%;15例癌旁组织cyˉclin D1蛋白阳性表达为3例，阳性表达率为20%;15例正常粘膜cyclin D1蛋白阳性表达为2例，阳性表达率为13.3%。食管鳞癌cyclin D1蛋白的表达明显高于癌旁组织和正常食管组织，差异有显著性(P<0.05)，染色强度食管鳞癌细胞高于正常组织和癌旁组织。正常粘膜与食管鳞癌相比，χ 2 =8.93，P<0.01;癌旁组织与食管鳞癌相比，χ 2=6.43，P<0.05。
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2.2 cyclin D1蛋白的表达和肿瘤侵犯深度的关系 45例食管鳞癌按肿瘤侵犯的深度分为粘膜层7例，肌层27例，外膜层(全层)11例，cyclin D1蛋白的阳性表达率分别为28.6%、55.6%、81.2%，cyclin D1蛋白在肿瘤侵犯粘膜层中的阳性表达率明显低于侵犯全层组，差异有显著性(P<0.05)。肿瘤侵犯外膜与粘膜层相比，χ 2 =5.1，P<0.05。
2.3 cyclin D1蛋白和淋巴结转移状况的关系 45例食管鳞癌按淋巴结转移状况分为有淋巴结转移26例，无淋巴结转移19例，cyclin D1蛋白的阳性表达率分别为69.2%，31.6%，cyclin D1蛋白在淋巴结转移组中的阳性表达率高于无淋巴结转移组，差异有显著性(P<0.05)。有淋巴结转移与无淋巴转移相比，χ 2 =6.25，P<0.05。
3 讨论
细胞周期蛋白D1是由位于人类第11号染色体短臂11q13上的CCND1基因编码，由292个氨基酸组成，分子量为34kD，其中56-114位氨基酸序列为其结构的主要部分，称为周期素盒子(cyclin box)。Sicinski [1] 的研究认为cyclin D1是大多数组织增殖所必需的。其作用机理目前认为与肿瘤抑制性蛋白Rb蛋白有关。cyclin D1与细胞周期依赖性激酶结合后可以使Rb蛋白磷酸化，导致转录因子E 2 F解离发挥效应，从而促进细胞周期。
, http://www.100md.com
目前的研究发现在食管癌发生、演变过程中存在着一系列的遗传改变。Jiang [2] 在20%的人食管鳞癌中发现了cyclin D1和hst-1基因的联合扩增，这个发现第一次提供了cyclin D1基因在人类食管癌中扩增的依据。随后Tahara [3] 、kiriu [4] 等也证实了cyclin D1基因在人食管癌中的扩增，同时伴随着cyclin D1蛋白的过度表达。这些都揭示了cyclin D1基因的扩增和过度表达是人类恶性食管癌的一个好的生物学标记，cyclin D1蛋白的检测可以作为食管癌的辅助诊断。关于cyclin D1与食管癌预后的关系Tahara的研究认为cyclin D1基因的扩增与食管癌的发生、发展，肿瘤的侵犯深度和远处的转移密切相关;国内祝淑钗[5] 等的研究也指出cyclin D1蛋白的表达和不表达相比，生存率差异有显著性。这些结果提示cyclin D1蛋白的表达可以预测食管癌的预后，有可能作为食管癌临床分期的参考指标。
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我们通过单克隆抗体免疫组织化学方法研究结果表明，在食管鳞癌组织中cyclin D1蛋白的阳性表达为57.8%，明显高于正常食管粘膜组织(13.3%)，表明人类食管癌的发生与细胞周期蛋白D1的存在密切相关，亦说明细胞周期蛋白D1可以作为食管癌诊断的一个分子标记物。食管癌旁组织中cyclin D1蛋白阳性表达率为20%，明显低于食 管癌组织(57.8%)，但与正常食管粘膜组织(13.3%)相比差异无显著性，说明距离肿瘤5cm以上的食管癌旁组织可以看作正常食管粘膜组织，这与肿瘤手术切除原则是相吻合的。本研究中正常食管粘膜组织和癌旁组织中有3例出现细胞周期蛋白D1的弱阳性，2例阳性，可能原因:(1)在正常组织的上皮增殖区存在着极低水平的细胞周期蛋白D1;(2)炎性因子的刺激可能使细胞周期蛋白D1的表达略有增高;(3)抗原的修复也可能造成一定的假阳性。
临床资料分析发现，食管癌侵犯全层组中cyclin D1蛋白的阳性表达率为81.2%，明显高于肿瘤侵犯粘膜组(28.6%);有淋巴结转移组cyclin D1蛋白阳性表达率为69.2%，明显高于无淋巴结转移组(31.2%)，这些结果均提示晚期食管癌细胞周期蛋白D1的表达明显高于早期食管癌，因此，细胞周期蛋白D1是食管癌预后的重要标志物。
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近几年的研究充分显示细胞周期与细胞癌变不是相互独立的事件。在人类食管癌中发现，细胞周期各个阶段的调节因子都有不同程度的异常，cyclin D1基因(CCND1)就是这样一个已明确的原癌基因。由于细胞癌变是基因连续突变结果，因此细胞周期相关癌基因(如cyclin D1、P16、Rb)与细胞增殖相关基因(如ras、c-myc、c-fos)在食管癌中是否存在协同作用，其确切机制如何有待进一步的研究。
参考文献
1 Sicinsdki P，Joana A，Liu D，et al.cell，1995，82:621-630.
2 Jiang W，Scott M，Tomita N，et al.Amplification and Expression of the human cyclinD Gene in esophageal Cancer.Cancer Res，1992，52:2980-2983.
, http://www.100md.com
3 Thara-E.Genetic alterations in human gastrointestinal cancers.Canˉcer，1995，75(6):1410-1417.
4 Kriu H，Yokozaki H，Yasui W，et al.Microsatellite instability associated with primary head and neck cancers and second esophageal cancers.Jpn-J-Clin-Oncol，1998，28(12):733-739.
5 祝淑钗，翟福山，殷蔚伯，等.周期素D1蛋白对食管癌预后的影响.中华肿瘤杂志，1998，20(2):129-131.
作者单位:1 443000湖北省宜昌市第一人民医院胸外科
2 上海长征医院胸外科
(收稿日期:2003-09-30)
(编辑 刘娜), 百拇医药(杨卫东)