SARS患者恢复期血清在早期诊断SARS中的作用
【摘要】 目的 探讨以传染性非典型肺炎(世界卫生组织又称严重急性呼吸综合征，SARS)患者恢复期血清早期诊断SARS的可行性。方法 采用非洲绿猴肾细胞(Vero-E6)培养SARS病毒，间接免疫荧光法检测SARS病毒抗原，并用电镜观察病毒颗粒。结果 散在及灶状Vero-E6细胞浆SARS病毒抗原为阳性反应，呈点状、块状及全浆性分布。电镜示胞质中冠状病毒样颗粒明显，散在分布于胞质中或成群分布于扩张的内质网腔中;细胞受损明显。结论 以SARS患者恢复期血清为一抗的间接免疫荧光法可能是早期诊断SARS的一种方法。
关键词 传染性非典型肺炎 恢复期血清 间接免疫荧光法 电子显微镜 诊断
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-6115(2003)11-0965-02
Effects of serum from patients with SARS in the
, 百拇医药
convalescent phase on early diagnosis of SARS
Le Xiaohua，Deng Xin，Zhou Boping，et al.
Shenzhen East-lake Hospital，Shenzhen518020.
【Abstract】 Objective To investigate the effects of serum from patients with severe acute respiratory syndrome(SARS)in the convalescent phase on early diagnosis of SARS.Methods Vero E6cells were inoculated with the maˉterial from nasopharyngeal swabs of patients with SARS.SARS virus antigen was detected by indirect fluorescence antiˉbody assay.Infected Vero E6cells were observed by electron microscopy.Results Expressions of SARS virus antigen were positive in the cytoplasm of some E6cells.Coronavirus-like particles seen in the ultrathin section of infected Vero E6cells scattered in cytoplasm and were abundant in endoplasmic reticulum.Conclusion It may be a method for the early diagnosis of SARS to use serum from patients with SARS in the convalescent phase as SARS virus antiˉbody.
, 百拇医药
Key words SARS convalescent phase serum indirect fluorescence antibody assay electron microscopy diagnosis
传染性非典型肺炎[世界卫生组织称之为严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome，SARS)]传染性强，病死率较高。SARS的病原体为冠状病毒的一个变种[1，2] ，但至今仍未有理想的早期诊断SARS的方法。为了解SARS患者恢复期血清在早期诊断SARS中的作用，我们采用绿猴肾细胞(Vero-E6)培养病毒，间接免疫荧光法检测SARS病毒抗原，并用电镜观察病毒颗粒，现报告如下。
1 材料和方法
1.1 病例及标本来源 深圳市东湖医院1例60岁男性住院患者，符合传染性非典型肺炎临床诊断标准 [3] 。于患者病程第11天，用吸痰管吸取患者鼻咽分泌物，将鼻咽分泌物混悬于盛有收集液的管内(收集液为Hanks溶液，pH7.0，每毫升含青、链霉素各2000U)，-80℃冻融一次，2000r/min离心20min，上清即为鼻咽分泌物标本。
, http://www.100md.com
1.2 SARS病毒的分离培养 Vero E6细胞接种于24孔培养板，37℃培养至单层。吸弃培养液，每孔细胞加入0.2ml标本液。33℃吸附1.5h，期间每15min轻摇一次，使标本充分吸附于细胞表面。再补充0.8ml2%胎牛血清DMEM维持液，置33℃、5%CO 2 培养箱培养。同时设正常细胞对照。每24h在倒置显微镜下观察细胞形态变化，记录细胞形态 变化。
1.3 间接免疫荧光法 收集病变Vero-E6细胞，细胞悬液滴于涂有APES的载玻片上爬片8h。经4%多聚甲醛固定，TritonX-100渗透，以SARS确诊患者恢复期血清为一抗(经检测SARS病毒IgM和IgG为阳性)，FITC标记的兔抗人IgG(购于中山生物公司)为二抗，伊文氏蓝衬染，缓冲甘油封片。设立阴性对照以正常人血清代替一抗，空白对照以胎牛血清代替一抗，抗原对照为正常的Vero-E6细胞。用荧光显微镜(OLYMPUS BX60)观察。
1.4 电镜标本的制作 上述细胞悬液离心后可见较致密的细胞团，经2.5%新鲜预冷戊二醛4℃固定，送往第一军医大学电镜室制样及观察。
, 百拇医药
2 结果
2.1 培养细胞形态观察 培养24h后细胞形态发生变化，表现为细胞变圆，颗粒增多。约48～72h达到高峰，在此时细胞呈丝状，颗粒增多变圆，聚集形成网状(见图1略)。病变细胞上清液经RT-PCR检测示SARS病毒RNA为阳性。
2.2 荧光显微镜观察 SARS病毒抗原阳性反应呈现黄绿色荧光。阳性反应位于Vero-E6细胞浆，呈点状、块状及全浆性分布。阳性细胞呈散在及灶状分布(见图2略)。阴性对照、空白对照及抗原对照片中未见SARS病毒抗原阳性细胞。
2.3 电镜观察 Vero-E6细胞胞质中可见冠状病毒样颗粒。病毒颗粒呈圆形及椭圆形，其直径约为55nm，周边密度较高，边缘不整，散在分布于胞质中或成群分布于扩张的内质网腔中(见图3略)。细胞受损明显，产生大量的自噬体(细胞质局部病变区被膜包裹形成的球形构，其中多含有衰老的线粒体及内质网等细胞器)。线粒体发生凝聚样改变。
, 百拇医药
3 讨论
传染性非典型肺炎危害较大，我国卫生部已将其列为甲种传染病 [4] 。虽然病原学的研究已公布SARS病毒的核酸序列，且推荐了引物用以RT-PCR法检测SARS病毒，然而临床上一些非常典型的SARS患者，RT-PCR法却检测不出SARS病毒RNA。SARS的诊断仍主要依据临床诊断标准。目前我国尚有间接免疫荧光抗体法(IFA)和酶联免疫吸附法(ELISA)用于SARS患者血清抗体的检测 [5] 。由于病程在11天以后，血清特异性抗体的阳性率才明显增高，所以检测血清SARS病毒抗体无助于SARS的早期诊断。
本研究利用确诊的SARS患者恢复期血清为一抗，并确保一抗中含有SARS病毒的特异性抗体检测SARS病毒抗原，结果可见散在及灶状的阳性细胞。由于SARS是新发生疾病，目前人群普遍易感，故非SARS患者血清中不存在特异性抗体，而SARS患者恢复期血清中绝大多数可检出特异性抗体，以抗体检测抗原有助于早期诊断。设立的 阴性对照、空白对照及抗原对照片中未见SARS病毒抗原阳性细胞，说明该方法可靠。电镜观察示胞质中有冠状病毒样颗粒，病毒颗粒呈圆形及椭圆形，其直径约为55nm，略小于文献 [2] 所报道的，但与一军大电镜室在其他SARS患者肺组织中观察到的相一致。以上说明SARS患者恢复期血清为一抗的间接免疫荧光法可能是早期诊断SARS的一种方法。如果能制备SARS病毒的单克隆抗体，应用于患者的分泌物、排泄物、血液及活检组织的检测，早期诊断SARS将成为可能。
, 百拇医药
参考文献
1 Drosten C，Gunther S，Preiser W.Identification of a novel coronavirus in patients with severe acute respiratory syndrome.N Engl J Med，2003，348:1967-1976.
2 KsiazekTG，Erdman D，Goldsmith C，et al.A novel coronavirus associatˉed with severe acute respiratory syndrome.N Engl J Med，2003，348:1953-1966.
3 中华医学会呼吸病学分会.传染性非典型肺炎临床诊治标准专家共识.中华结核和呼吸杂志，2003，26:323-324.
4 中国疾病预防控制中心.传染性非典型肺炎防治培训教材.北京:中国协和医科大学出版社，2003，4.
5 国家SARS防治紧急科技行动北京组.传染性非典型肺炎的血清学诊断研究.中华结核和呼吸杂志，2003，26:339-342.
作者单位:1 518020广东省深圳市东湖医院
2 广州第一军医大学电镜室
(收稿日期:2003-07-03)
(编辑 李年令), 百拇医药(乐晓华)
关键词 传染性非典型肺炎 恢复期血清 间接免疫荧光法 电子显微镜 诊断
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-6115(2003)11-0965-02
Effects of serum from patients with SARS in the
, 百拇医药
convalescent phase on early diagnosis of SARS
Le Xiaohua，Deng Xin，Zhou Boping，et al.
Shenzhen East-lake Hospital，Shenzhen518020.
【Abstract】 Objective To investigate the effects of serum from patients with severe acute respiratory syndrome(SARS)in the convalescent phase on early diagnosis of SARS.Methods Vero E6cells were inoculated with the maˉterial from nasopharyngeal swabs of patients with SARS.SARS virus antigen was detected by indirect fluorescence antiˉbody assay.Infected Vero E6cells were observed by electron microscopy.Results Expressions of SARS virus antigen were positive in the cytoplasm of some E6cells.Coronavirus-like particles seen in the ultrathin section of infected Vero E6cells scattered in cytoplasm and were abundant in endoplasmic reticulum.Conclusion It may be a method for the early diagnosis of SARS to use serum from patients with SARS in the convalescent phase as SARS virus antiˉbody.
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Key words SARS convalescent phase serum indirect fluorescence antibody assay electron microscopy diagnosis
传染性非典型肺炎[世界卫生组织称之为严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome，SARS)]传染性强，病死率较高。SARS的病原体为冠状病毒的一个变种[1，2] ，但至今仍未有理想的早期诊断SARS的方法。为了解SARS患者恢复期血清在早期诊断SARS中的作用，我们采用绿猴肾细胞(Vero-E6)培养病毒，间接免疫荧光法检测SARS病毒抗原，并用电镜观察病毒颗粒，现报告如下。
1 材料和方法
1.1 病例及标本来源 深圳市东湖医院1例60岁男性住院患者，符合传染性非典型肺炎临床诊断标准 [3] 。于患者病程第11天，用吸痰管吸取患者鼻咽分泌物，将鼻咽分泌物混悬于盛有收集液的管内(收集液为Hanks溶液，pH7.0，每毫升含青、链霉素各2000U)，-80℃冻融一次，2000r/min离心20min，上清即为鼻咽分泌物标本。
, http://www.100md.com
1.2 SARS病毒的分离培养 Vero E6细胞接种于24孔培养板，37℃培养至单层。吸弃培养液，每孔细胞加入0.2ml标本液。33℃吸附1.5h，期间每15min轻摇一次，使标本充分吸附于细胞表面。再补充0.8ml2%胎牛血清DMEM维持液，置33℃、5%CO 2 培养箱培养。同时设正常细胞对照。每24h在倒置显微镜下观察细胞形态变化，记录细胞形态 变化。
1.3 间接免疫荧光法 收集病变Vero-E6细胞，细胞悬液滴于涂有APES的载玻片上爬片8h。经4%多聚甲醛固定，TritonX-100渗透，以SARS确诊患者恢复期血清为一抗(经检测SARS病毒IgM和IgG为阳性)，FITC标记的兔抗人IgG(购于中山生物公司)为二抗，伊文氏蓝衬染，缓冲甘油封片。设立阴性对照以正常人血清代替一抗，空白对照以胎牛血清代替一抗，抗原对照为正常的Vero-E6细胞。用荧光显微镜(OLYMPUS BX60)观察。
1.4 电镜标本的制作 上述细胞悬液离心后可见较致密的细胞团，经2.5%新鲜预冷戊二醛4℃固定，送往第一军医大学电镜室制样及观察。
, 百拇医药
2 结果
2.1 培养细胞形态观察 培养24h后细胞形态发生变化，表现为细胞变圆，颗粒增多。约48～72h达到高峰，在此时细胞呈丝状，颗粒增多变圆，聚集形成网状(见图1略)。病变细胞上清液经RT-PCR检测示SARS病毒RNA为阳性。
2.2 荧光显微镜观察 SARS病毒抗原阳性反应呈现黄绿色荧光。阳性反应位于Vero-E6细胞浆，呈点状、块状及全浆性分布。阳性细胞呈散在及灶状分布(见图2略)。阴性对照、空白对照及抗原对照片中未见SARS病毒抗原阳性细胞。
2.3 电镜观察 Vero-E6细胞胞质中可见冠状病毒样颗粒。病毒颗粒呈圆形及椭圆形，其直径约为55nm，周边密度较高，边缘不整，散在分布于胞质中或成群分布于扩张的内质网腔中(见图3略)。细胞受损明显，产生大量的自噬体(细胞质局部病变区被膜包裹形成的球形构，其中多含有衰老的线粒体及内质网等细胞器)。线粒体发生凝聚样改变。
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3 讨论
传染性非典型肺炎危害较大，我国卫生部已将其列为甲种传染病 [4] 。虽然病原学的研究已公布SARS病毒的核酸序列，且推荐了引物用以RT-PCR法检测SARS病毒，然而临床上一些非常典型的SARS患者，RT-PCR法却检测不出SARS病毒RNA。SARS的诊断仍主要依据临床诊断标准。目前我国尚有间接免疫荧光抗体法(IFA)和酶联免疫吸附法(ELISA)用于SARS患者血清抗体的检测 [5] 。由于病程在11天以后，血清特异性抗体的阳性率才明显增高，所以检测血清SARS病毒抗体无助于SARS的早期诊断。
本研究利用确诊的SARS患者恢复期血清为一抗，并确保一抗中含有SARS病毒的特异性抗体检测SARS病毒抗原，结果可见散在及灶状的阳性细胞。由于SARS是新发生疾病，目前人群普遍易感，故非SARS患者血清中不存在特异性抗体，而SARS患者恢复期血清中绝大多数可检出特异性抗体，以抗体检测抗原有助于早期诊断。设立的 阴性对照、空白对照及抗原对照片中未见SARS病毒抗原阳性细胞，说明该方法可靠。电镜观察示胞质中有冠状病毒样颗粒，病毒颗粒呈圆形及椭圆形，其直径约为55nm，略小于文献 [2] 所报道的，但与一军大电镜室在其他SARS患者肺组织中观察到的相一致。以上说明SARS患者恢复期血清为一抗的间接免疫荧光法可能是早期诊断SARS的一种方法。如果能制备SARS病毒的单克隆抗体，应用于患者的分泌物、排泄物、血液及活检组织的检测，早期诊断SARS将成为可能。
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参考文献
1 Drosten C，Gunther S，Preiser W.Identification of a novel coronavirus in patients with severe acute respiratory syndrome.N Engl J Med，2003，348:1967-1976.
2 KsiazekTG，Erdman D，Goldsmith C，et al.A novel coronavirus associatˉed with severe acute respiratory syndrome.N Engl J Med，2003，348:1953-1966.
3 中华医学会呼吸病学分会.传染性非典型肺炎临床诊治标准专家共识.中华结核和呼吸杂志，2003，26:323-324.
4 中国疾病预防控制中心.传染性非典型肺炎防治培训教材.北京:中国协和医科大学出版社，2003，4.
5 国家SARS防治紧急科技行动北京组.传染性非典型肺炎的血清学诊断研究.中华结核和呼吸杂志，2003，26:339-342.
作者单位:1 518020广东省深圳市东湖医院
2 广州第一军医大学电镜室
(收稿日期:2003-07-03)
(编辑 李年令), 百拇医药(乐晓华)