外周血单个核细胞分离方法探讨
【摘要】 目的 探讨外周血单个核细胞(PBMC)的不同分离方法对分离效果、贴壁能力以及淋巴细胞的增殖活性的影响。方法 取肝素抗凝血，分别用羟乙基淀粉(hydrixyethylstarch，HES)自然沉降法、HES离心沉淀法、Ficoll密度梯度离心法三种方法分离单个核细胞，直接进行贴壁计数及多种细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine-induced killer，CIK)培养。结果 HES自然沉降法、HES离心沉淀法、Ficoll密度梯度离心法分离的PBMC回收率分别为86.4%、86.0%、85.1%。结论 羟乙基淀粉离心沉淀法可有效地分离PBMC。
关键词 羟乙基淀粉 淋巴细胞分离液 单核细胞
【文献标识码】 A 【文章编号】 1726-7587(2003)09-0780-02
Study on the methods of separating peripheral blood mononuclear cells
, 百拇医药
HanYaping，Liu Yuan，Zhang Lili，et al.
Deparment of Infectious Diseases，The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University，Nanjing210029.
【Abstract】 Objective To investigate the difference among three protocols of isolating peripheral blood mononuclear cells(PBMCs)through observing the recovery rate，the adherent ability and lymphocytes proliferation acˉtivity of the isolated PBMCs.Methods Use three different isolation protocols，HES(hydrixye
, 百拇医药
thylstarch)sedimentation method，HES centrifugation method and Ficoll density gradient centrifugation，to isolate PBMCs from healthy donors.Then compare these isolation protocols through observing the recovery rate of PBMCs，the number of p
lastic-adherent cells and the cytokine-induced killer cells proliferation.Results The recovery rate of PBMCs is86.4%by HES sedimentation method，83.7%by HES centrifugation and sedimentation method and85.1%by Ficoll density gradient centrifugation[method] separately.Conclusion Our observation provide evidence that HEScentrifugation method could efficiently isolate PBMCs from human peripheral blood.
, 百拇医药
Key words hetastarch ficoll monocyte
外周血单个核细胞分离效果直接影响细胞培养结果，经典的Ficoll密度梯度常用于少量血液分离，而在血液较多时则须分成许多离心管，重复地开放操作增加了污染机会。为此，我们用HES离心沉淀法代替Ficoll密度梯度离心法分离PBMC，对不同方法获取PBMC的贴壁能力和CIK细胞增殖活性等作一较为系统的探讨。
1 材料和方法
1.1 材料 外周血:健康成人外周血10份。Ficoll:上海试剂二厂，分子量400000。6%HES:DUPONT公司生产，分子量480000。
1.2 方法
1.2.1 外周血单个核细胞的分离 HES自然沉降法 [1] :即肝素抗凝血与6%HES按5:1混合，自然沉降60min，取上层液400×g离心10min，以RPMI1640洗两遍备用。
, 百拇医药
HES离心沉淀法:分别将抗凝血与HES12:1、7:1、6:1、5:1、3:1、2:1，使HES终浓度为0.5%、0.85%、1.0%、1.2%、2.0%和3.0%条件下20℃60×g离心10min，取上层液400×g离心10min，以RPMI1640洗两次备用。
Ficoll密度梯度离心法 [2] :肝素抗凝血先与RPMI1640培养液1:1混合，再加等量淋巴细胞分离液600×g离心20min，小心吸取单个核细胞层，以RPMI1640洗两遍备用。
1.2.2 PBMC的处理 将不同分离方法获取的PBMC计数后重悬于完全培养基中，分别加入24孔培养板，每孔4×10 6 细胞，37℃，5%CO 2 培养2h后吸取培养上清，用RPMI1640轻轻洗涤培养孔3次以去除非贴壁细胞。收集贴壁细胞计数并用荧光素标记的单克隆抗体通过荧光激活细胞分离器(FACS Vantage SE)鉴定。悬浮细胞用完全培养基调整细胞浓度至1×10 6 /ml，补充适量的CD3单抗、rh-IFN、IL-2等，共同培养多种细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)，每3天换液1次并计数，第10天收获细胞，计算增殖倍数，同时以荧光素标记的单克隆抗体鉴定细胞类型。
, 百拇医药
1.2.3 统计学方法 应用SAS6.12统计软件进行方差分析、t检验。数值以平均数±标准差表示。
2 结果
2.1 不同分离方法PBMC回收率 HES终浓度在0.5%、0.85%、1.0%、1.2%、2.0%和3.0%条件下进行离心沉淀和自然沉降，结果显示HES终浓度≥1.0%时PBMC回收率最高，为此我们确定HES终浓度1.2%为最后实验浓度。用HES离心沉淀法和自然沉降法分离的PBMC总数相近，与传统的Ficoll密度梯度离心法比较也无统计学差异(P>0.05)，结果见表1。
2.2 不同分离方法PBMC贴壁能力 HES自然沉降法、HES离心沉淀法、Ficoll分离法其CD14 + 细胞FACS检测平均百分率分别为38.69%、68.70%、64.54%，HES自然沉降法明显低于后两法(P<0.01)，HES自然沉降法中含有较多的CD3、CD19、CD56细胞见图1。
, 百拇医药
2.3 不同分离方法PBMC增殖活性 HES自然沉降法、HES离心沉淀法和Ficoll分离法所获得PBMC，其CIK细胞增殖能力接近，第10天略有差别但无统计学差异(P>0.05)。见图2。
图1 不同分离方法PBMC的贴壁能力略
图2 不同分离方法CIK细胞增殖能力的比较略
表1 不同分离方法PBMC回收率略
3 讨论
分离PBMC是一项常规工作，传统的是采用Ficoll密度梯度离心法，Ficoll是一种粘性强的液体，其比重为1.077，在一定离心力的作用下，比重大于淋巴细胞的红细胞及多核粒细胞等沉淀于分离液的底层，单个核细胞在分离液的界面上。操作时需将抗凝血作适当稀释，比较适用于少量血液的分离，在血量较多时要分成数管进行离心，十分不便，而且重复多次地开放性操作也增加了污染机会。
, 百拇医药
HES是一种血浆代用品 [3] ，原料来自于天然绿色植物玉米，由高分子量支链淀粉经降解、羟乙基化并进一步加工处理后制成。HES与红细胞膜上的负电荷结合，使红细胞彼此以凹面相贴，重叠在一起的红细胞下沉阻力减少，红细胞与血浆及单个核细胞形成清晰的界面。抗凝血与终浓度为1%～2%的HES混合后经低速离心可加快红细胞的下沉，便于吸取含单核细胞的血浆层，使PBMC的分离过程简单化，有利缩短工作时间，提高工作效率。此外，用HES分离PBMC也可在封闭系统中即血袋中进行 [1] ，非开放性操作可减少污染机会。与Ficoll法相比HES离心沉淀法除简化了操作外，也减少了耗材，降低了试验成本 [4] 。
Denning [5] 等用HES沉降法分离脐血单个核细胞发现，脐血单个核细胞的回收率可受分离前脐血放置时间和温度的影响。我们将新鲜采集的血液与HES混匀后常温(22℃～25℃)静置60min获取的PBMC，其细胞活率及贴壁能力都低于HES离心沉淀法，不规则细胞形态增加，是否与细胞在相对高浓度的HES中浸泡时间过长有关，还有待于观察。将肝素抗凝血与HES在离心管中按最适比例混匀后 直接60×g离心10min，所得到的细胞数量与其他方法相近(见表1)，无统计学差异，而形态学和贴壁能力明显好于HES自然沉降法(P<0.01)。HES有高、中、低三种分子量，不同的分子量其分离效果各有差异 [6]。因此，选择合适的HES浓度和分子量可以确保分离效果。
, 百拇医药
总之，在获取PBMC时应根据血量多少和实验室的条件来选择不同的分离方法。本实验室用6%HES离心沉淀法分离的外周血单个核细胞回收率为86.0%，活细胞在97%以上。在综合细胞纯度、细胞回收率、细胞活力以及操作的难易程度等因素，笔者认为HES离心沉淀法不失为分离PBMC首选的方法之一。
参考文献
1 Rubinsten P，Taylor PE，Scaradavou A，et al.Unrelated placental blood for
bone marrow reconstitution:organization of the placental blood proˉgram.Blood Cells，1994，20:587-600.
2 北京医学院微生物学教研组编.实验免疫学.北京:人民卫生出版社，1980，435-436.
, 百拇医药
3 Forster H.Physical and chemical properties of hydroxyethylstarch.Plasˉma Volume Expansion，1992，105-121.
4 Rubinstein P，Dobrila L，Rosenfield RE，et al.Processing and cryopˉreservation of placental/umbilical cord blood for unrelated bone marrow reconstitution.Proc Natl Acad Sci，1995，92:10119-10122.
5 Denning-kendall P，Donaldson C，Nicol A，et al.Optimal processing of human
umbilical cord blood for clinical banking.Exp Hematol，1996，24:1394-1401.
6 Kenichi S，Mikitomo Y，Ryo S，et al.Cell processing for placental/umˉbilical cord blood banking.Jpn J Transfusion Med，1998，44:12-19.
作者单位:210029南京医科大学第一附属医院感染病科
(收稿日期:2003-09-20)
(编辑 刘娜), 百拇医药(韩亚萍)
关键词 羟乙基淀粉 淋巴细胞分离液 单核细胞
【文献标识码】 A 【文章编号】 1726-7587(2003)09-0780-02
Study on the methods of separating peripheral blood mononuclear cells
, 百拇医药
HanYaping，Liu Yuan，Zhang Lili，et al.
Deparment of Infectious Diseases，The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University，Nanjing210029.
【Abstract】 Objective To investigate the difference among three protocols of isolating peripheral blood mononuclear cells(PBMCs)through observing the recovery rate，the adherent ability and lymphocytes proliferation acˉtivity of the isolated PBMCs.Methods Use three different isolation protocols，HES(hydrixye
, 百拇医药
thylstarch)sedimentation method，HES centrifugation method and Ficoll density gradient centrifugation，to isolate PBMCs from healthy donors.Then compare these isolation protocols through observing the recovery rate of PBMCs，the number of p
lastic-adherent cells and the cytokine-induced killer cells proliferation.Results The recovery rate of PBMCs is86.4%by HES sedimentation method，83.7%by HES centrifugation and sedimentation method and85.1%by Ficoll density gradient centrifugation[method] separately.Conclusion Our observation provide evidence that HEScentrifugation method could efficiently isolate PBMCs from human peripheral blood.
, 百拇医药
Key words hetastarch ficoll monocyte
外周血单个核细胞分离效果直接影响细胞培养结果，经典的Ficoll密度梯度常用于少量血液分离，而在血液较多时则须分成许多离心管，重复地开放操作增加了污染机会。为此，我们用HES离心沉淀法代替Ficoll密度梯度离心法分离PBMC，对不同方法获取PBMC的贴壁能力和CIK细胞增殖活性等作一较为系统的探讨。
1 材料和方法
1.1 材料 外周血:健康成人外周血10份。Ficoll:上海试剂二厂，分子量400000。6%HES:DUPONT公司生产，分子量480000。
1.2 方法
1.2.1 外周血单个核细胞的分离 HES自然沉降法 [1] :即肝素抗凝血与6%HES按5:1混合，自然沉降60min，取上层液400×g离心10min，以RPMI1640洗两遍备用。
, 百拇医药
HES离心沉淀法:分别将抗凝血与HES12:1、7:1、6:1、5:1、3:1、2:1，使HES终浓度为0.5%、0.85%、1.0%、1.2%、2.0%和3.0%条件下20℃60×g离心10min，取上层液400×g离心10min，以RPMI1640洗两次备用。
Ficoll密度梯度离心法 [2] :肝素抗凝血先与RPMI1640培养液1:1混合，再加等量淋巴细胞分离液600×g离心20min，小心吸取单个核细胞层，以RPMI1640洗两遍备用。
1.2.2 PBMC的处理 将不同分离方法获取的PBMC计数后重悬于完全培养基中，分别加入24孔培养板，每孔4×10 6 细胞，37℃，5%CO 2 培养2h后吸取培养上清，用RPMI1640轻轻洗涤培养孔3次以去除非贴壁细胞。收集贴壁细胞计数并用荧光素标记的单克隆抗体通过荧光激活细胞分离器(FACS Vantage SE)鉴定。悬浮细胞用完全培养基调整细胞浓度至1×10 6 /ml，补充适量的CD3单抗、rh-IFN、IL-2等，共同培养多种细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)，每3天换液1次并计数，第10天收获细胞，计算增殖倍数，同时以荧光素标记的单克隆抗体鉴定细胞类型。
, 百拇医药
1.2.3 统计学方法 应用SAS6.12统计软件进行方差分析、t检验。数值以平均数±标准差表示。
2 结果
2.1 不同分离方法PBMC回收率 HES终浓度在0.5%、0.85%、1.0%、1.2%、2.0%和3.0%条件下进行离心沉淀和自然沉降，结果显示HES终浓度≥1.0%时PBMC回收率最高，为此我们确定HES终浓度1.2%为最后实验浓度。用HES离心沉淀法和自然沉降法分离的PBMC总数相近，与传统的Ficoll密度梯度离心法比较也无统计学差异(P>0.05)，结果见表1。
2.2 不同分离方法PBMC贴壁能力 HES自然沉降法、HES离心沉淀法、Ficoll分离法其CD14 + 细胞FACS检测平均百分率分别为38.69%、68.70%、64.54%，HES自然沉降法明显低于后两法(P<0.01)，HES自然沉降法中含有较多的CD3、CD19、CD56细胞见图1。
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2.3 不同分离方法PBMC增殖活性 HES自然沉降法、HES离心沉淀法和Ficoll分离法所获得PBMC，其CIK细胞增殖能力接近，第10天略有差别但无统计学差异(P>0.05)。见图2。
图1 不同分离方法PBMC的贴壁能力略
图2 不同分离方法CIK细胞增殖能力的比较略
表1 不同分离方法PBMC回收率略
3 讨论
分离PBMC是一项常规工作，传统的是采用Ficoll密度梯度离心法，Ficoll是一种粘性强的液体，其比重为1.077，在一定离心力的作用下，比重大于淋巴细胞的红细胞及多核粒细胞等沉淀于分离液的底层，单个核细胞在分离液的界面上。操作时需将抗凝血作适当稀释，比较适用于少量血液的分离，在血量较多时要分成数管进行离心，十分不便，而且重复多次地开放性操作也增加了污染机会。
, 百拇医药
HES是一种血浆代用品 [3] ，原料来自于天然绿色植物玉米，由高分子量支链淀粉经降解、羟乙基化并进一步加工处理后制成。HES与红细胞膜上的负电荷结合，使红细胞彼此以凹面相贴，重叠在一起的红细胞下沉阻力减少，红细胞与血浆及单个核细胞形成清晰的界面。抗凝血与终浓度为1%～2%的HES混合后经低速离心可加快红细胞的下沉，便于吸取含单核细胞的血浆层，使PBMC的分离过程简单化，有利缩短工作时间，提高工作效率。此外，用HES分离PBMC也可在封闭系统中即血袋中进行 [1] ，非开放性操作可减少污染机会。与Ficoll法相比HES离心沉淀法除简化了操作外，也减少了耗材，降低了试验成本 [4] 。
Denning [5] 等用HES沉降法分离脐血单个核细胞发现，脐血单个核细胞的回收率可受分离前脐血放置时间和温度的影响。我们将新鲜采集的血液与HES混匀后常温(22℃～25℃)静置60min获取的PBMC，其细胞活率及贴壁能力都低于HES离心沉淀法，不规则细胞形态增加，是否与细胞在相对高浓度的HES中浸泡时间过长有关，还有待于观察。将肝素抗凝血与HES在离心管中按最适比例混匀后 直接60×g离心10min，所得到的细胞数量与其他方法相近(见表1)，无统计学差异，而形态学和贴壁能力明显好于HES自然沉降法(P<0.01)。HES有高、中、低三种分子量，不同的分子量其分离效果各有差异 [6]。因此，选择合适的HES浓度和分子量可以确保分离效果。
, 百拇医药
总之，在获取PBMC时应根据血量多少和实验室的条件来选择不同的分离方法。本实验室用6%HES离心沉淀法分离的外周血单个核细胞回收率为86.0%，活细胞在97%以上。在综合细胞纯度、细胞回收率、细胞活力以及操作的难易程度等因素，笔者认为HES离心沉淀法不失为分离PBMC首选的方法之一。
参考文献
1 Rubinsten P，Taylor PE，Scaradavou A，et al.Unrelated placental blood for
bone marrow reconstitution:organization of the placental blood proˉgram.Blood Cells，1994，20:587-600.
2 北京医学院微生物学教研组编.实验免疫学.北京:人民卫生出版社，1980，435-436.
, 百拇医药
3 Forster H.Physical and chemical properties of hydroxyethylstarch.Plasˉma Volume Expansion，1992，105-121.
4 Rubinstein P，Dobrila L，Rosenfield RE，et al.Processing and cryopˉreservation of placental/umbilical cord blood for unrelated bone marrow reconstitution.Proc Natl Acad Sci，1995，92:10119-10122.
5 Denning-kendall P，Donaldson C，Nicol A，et al.Optimal processing of human
umbilical cord blood for clinical banking.Exp Hematol，1996，24:1394-1401.
6 Kenichi S，Mikitomo Y，Ryo S，et al.Cell processing for placental/umˉbilical cord blood banking.Jpn J Transfusion Med，1998，44:12-19.
作者单位:210029南京医科大学第一附属医院感染病科
(收稿日期:2003-09-20)
(编辑 刘娜), 百拇医药(韩亚萍)