重组人成骨蛋白-1载体材料筛选实验研究
【摘要】 目的 通过不同材料作为重组人成骨蛋白-1(rhOP-1)载体的异位骨诱导活性的比较研究，筛选一种较为理想的载体材料。方法 将rhOP-1分别与无活性脱钙骨基质(DBM)、羟基磷灰石(HA)、三种α-聚脂类(PLA、PLA-PEG、PLGA)复合，植入小鼠股部内侧肌间隙，3周后取材，比较5种载体对rhOP-1骨诱导活性的影响，通过组织学检查、碱性磷酸酶(ALP)及钙含量的测定进行比较。结果 rhOP-1/DBM组、单独植入rhOP-1组和真核表达OP-1注入组均有骨组织生成。A组可见大量骨小梁、骨髓腔和板层骨，血管和骨髓丰富;F组出现编织骨;对照组Ⅵ见成熟的致密骨组织;其余4组复合组可见间充质细胞增生，未见骨组织;载体部分吸收。ALP水平和Ca含量，单独植入rhOP-1F组与对照组Ⅵ差异无显著性(P>0.05);各复合组与对照组相比、A组与其他复合组相比，差异均有显著性(P<0.05);除rhOP-1/DBM组以外，其他各复合组与F组之间差异均无显著性(P>0.05)。结论 (1)DBM为rhOP-1的良好载体;(2)DBM/rhOP-1对临床上促进骨缺损的修复是十分有利的。
, 百拇医药
关键词 重组人成骨蛋白-1 载体 骨诱导
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-6115(2003)11-0961-03
The experimental studies on screening biomaterials as rhop-1carriers
WangMin，Han Jinxiang
Key Laboratory for Medical Molecular Biology of Shandong Province，
Key Laboratory for Biotech-Drugs Ministry of Health，Jinan250062.
【Abstract】 Objective To obtain an optimal carrier，several biomaterials have been tested as candidate carriˉers for recombinant human osteogenic protein-1(rhOP-1).Methods The biomaterials included inactive decalcified bone matrix(DBM)，hydroxyapatite(HA)，polylactic acid(PLA)，polylactic acid-polyethylene glycol copolymers(PLA-PEG)and polylactic glycolic acid(PLGA)，mixed with rhOP-1respectively，and implanted into the thigh muscles of mice for3weeks to evaluate their capacity to elicit bone formation.Osteoinduction was assessed by histological methods，quantitative measurement of alkaline phosphatase(ALP)level and calcium content of the ectopic new bone.Results Three weeks after implantation，DBM/rhOP-1，rhOP-1and controlⅥall showed new bone formation.Massive bone trabeculae，medullary cavity of bone，and lamellar bone was observed in group A，the blood vessel and hematopoietic marrow were plenty;fibrous bone was present in group F;and compact bone of high maturity was obˉserved in controlⅥ.Mesenchymal celluar proliferation was observed in the rest complex groups，they did not show new bone formation.The materials were partially absorbed.ALP level and calciumcontent were significant high in every complexed group than control group respectively，group Awas higher than group B，C，D and E(P<0.05);No signifiˉcant difference between group F and controlⅥ(P>0.05).There was no significant difference in group B，C，D，E and F respectively(P>0.05)except for group A.Conclusion (1)DBMwas effective carrier for rhOP-1;(2)DBM/rhOP-1is useful to accelerate bone defect repair clinically.
, 百拇医药
Key words recombinant human osteogenic protein-1 carriers bone-inducing
骨形态发生蛋白(BMP)是一类特殊的骨生长因子，具有扩散性，能在体内外诱导未分化的间质细胞、骨髓中的髓母细胞、诱导软骨和骨的形成。但单纯BMP在体内易被蛋白酶所降解，在有效时间内无法作用于更多的靶细胞，其诱导活性也难以得到充分发挥，而且，对于较大的骨缺损，BMP不能发挥支架和填充作用。因此，在获得了高纯度、高活性的BMP后，适宜载体的选择对于BMP发挥最大骨诱导活性至关重要 [1] 。目前用作BMP载体的材料大体可分为天然有机高分子材料，人工合成高分子有机物和无机材料三类。本研究将rhBMP-7(rhOP-1)分别与无活性脱钙骨基质(DBM)、羟基磷灰石(HA)、3种α-聚脂类(PLA、PLA-PEG、PLGA)复合，比较其骨诱导活性，旨在筛选一种较为理想的rhOP-1载体，为临床应用提供依据。
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1 材料与方法
1.1 材料制备
1.1.1 重组人成骨蛋白-1(rhOP-1) 为本中心生产，经两步SP-FF纯化后，保存备用。
1.1.2 无活性脱钙骨基质(DBM) [2] 取健康狗的四肢长骨约2kg，去除骨膜、骨髓及软组织后砸成碎片，制成3mm×3mm×3mm大小的骨粒，流水冲洗4～5h，室温下用0.5M/L盐酸脱钙4h以上，直至检测不到钙为止(1g骨粒:50ml盐酸)。脱钙后用流水冲洗3h，300ml/L过氧化氢脱蛋白24h后浸泡于5倍于骨粒体积的无水乙醇脱水6h、乙醚脱脂1h后再行脱水，置通风处干燥过夜，环氧乙烷消毒后置于密闭容器内保存备用。
1.1.3 rhOP-1与载体的复合 精确称取rhOP-14mg8份，分别溶于适量4M盐酸胍中，然后加入DBM30mg，将液体与固体成分充分混匀，抽真空30min，对40倍蒸馏水透析48h，每12h更换透析液一次，置于冷冻干燥机内冻干，制成含rhOP-14mg、DBM30mg的复合物，以同样方法制备另外几种复合物。取部分样品扫描电镜下观察载体结构和蛋白的复合情况(图1)，另备单纯载体30mg和rhOP-14mg各8份，全部环氧乙烷熏蒸消毒，4℃保存备用。
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1.2 实验动物分组 取昆明种小鼠96只(由山东大学实验动物中心提供)，均为雄性，体重18～22g，适应动物房环境2周。将小鼠随机分为12组(如表1):A、B、C、D、E、F6个实验组，设对照Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ组。手术时以安氟醚吸入麻醉小鼠，在无菌条件下切开小鼠股部前内侧皮肤，剪开深筋膜，暴露内侧肌群，将经过处理的植入物植入内侧肌间隙，逐层缝合，无菌消毒。第Ⅵ组注入真核表达OP-12ml，作为rhOP-1诱导实验的对照。将小鼠放在经过消毒的饲养笼内分笼饲养，正常饮食，均在3周离断颈椎处死，先行大体观察，取材后每份标本平均分为两份，分别用于组织学和生化检测。
表1 实验分组及处理 略
1.3 实验检测
1.3.1 标本大体观察 取材后大体观察植入物的颜色及与周围软组织的连接情况。
1.3.2 组织学检测 取材后将标本置于10%的中性甲醛中固定24h以上，然后依次脱钙、水洗、脱水、石蜡包埋，制成切片，HE染色，光镜下观察。
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1.3.3 定量标本的处理 在文献报道的已有方法基础 [3] 之上，加以改进。取材后，彻底消除标准表面的软组织，称重，置玻璃匀浆器内加入冰预冷的生理盐水2ml，匀浆，10000rpm离心10min，上清用于碱性磷酸酶(ALP)检测，沉淀 用于Ca含量检测。
1.3.4 ALP测定 取上清100μl，加PNPP50μl，37℃孵育10min，加1M NaOH50μl终止反应，紫外分光光度仪在410nm处比色，测定OD值，以标本湿重为除数，计算ALP的单位U/mg组织(湿重)。
1.3.5 Ca含量测定 取上述离心后沉淀加0.5M HCl2.5ml溶解，将HCl浓度调为1%(其中含10%硝酸锶2.5ml)，原子吸收分光光度仪测钙含量，也以标本湿重为除数，计算Ca含量μg/mg组织(湿重)。因HA本身含有一定的钙，B组和对照组Ⅱ不作Ca含量测定。
1.4 统计学处理 图片资料以图片显示结果，实验数据采用安全随机设计的多样本均数比较的单因素方差分析(ANOVA)，P<0.05认为差异有显著性。
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2 结果
2.1 SEM结果 各组蛋白均复合良好，吸附均匀。DBM为疏松的孔隙结构，孔径400～800μm，相互串联，孔隙率为35.28%;HA呈致密型脉络状;三种α-聚脂类均为珊瑚样微孔结构。
2.2 标本大体观察 所有植入物均被周围纤维组织包裹，呈灰白色，rhOP-1/DBM相结合紧密，可见半透明状较硬韧的骨样组织。
2.3 组织学检测 术后21天，镜下可见各组均无炎细胞浸润，周围肌组织正常，rhOP-1/DBM组、单独植入rhOP-1组和真核表达OP-1注入组均有骨组织生成。A组:可见大量骨小梁、骨髓腔和板层骨，血管和骨髓丰富，成骨率8/8(图2);F组:间充质细胞增殖明显，可见软骨岛，并有少量编织骨形成，成骨率6/8(图3);对照组Ⅵ:可见分化成熟的致密骨组织，成骨率8/8(图4);其余四组复合组可见间充质细胞增生，未见骨组织;各组载体部分吸收。其余各单独载体植入组未见任何骨诱导发生。
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2.4 ALP和Ca含量测定结果 见表2。术后21天，ALP水平和Ca含量，单独植入rhOP-1F组与真核表达OP-1注入组差异无显著性(P>0.05);各复合组与不含rhOP-1的对照组相比、A组与其他复合组相比，差异均有显著性(P<0.05);B、C、D、E四组复合组与F组之间差异均无显著性(P>0.05)，但rhOP-1/DBM组均高于F组(P<0.01)。
表2 标本中的ALP水平和Ca含量测定结果 略
3 讨论
3.1 rhOP-1与异位骨诱导 rhOP-1是骨细胞分化和成骨作用有效的调节器，大量的临床应用研究充分证实了这些生物活性分子的独特作用 [4] 。本实验将rhOP-1单独植入，术后21天，组织学观察，有编织骨形成，但成骨量与新骨的成熟度远不及rhOP-1与DBM的复合组。这可能是因为单独植入rhOP-1组，易被蛋白酶所降解，扩散太快，在有效时间内无法作用于更多的靶细胞，其诱导活性也难以得到充分发挥，而载体可以起到缓慢释放作用，使BMP维持在植入位点并促使其释放浓度最佳化，而使BMP成骨效应达到最大化 [5] 。另外，合适的载体可作为成骨细胞的诱导矩阵，在骨形成时期保持一定的空间和体积，最终分化为骨组织，这充分说明了合适载体对于rhOP-1诱骨活性的重要性 [6] 。
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3.2 DBM载体 本实验自行制备的DBM，其中的非胶原成分被全部去除或是减少到最大限度，其多孔状结构有利于蛋白的吸附和细胞、血管的长入，DBM作为rhOP-1的良好载体，可起到缓慢释放作用，加速了异位骨诱导过程。DBM在rhOP-1/DBM复合植入后21天，组织学观察可见大量骨小梁和板层骨生成，血管和骨髓丰富，定量指标也明显高于单独植入组和其他的复合组，这充分证实DBM作为rhOP-1的载体的重要性，但DBM制备过程中的孔径大小问题可能会影响活性的发挥。有研究认为，DBM孔径<100μm会使新骨的长入受限，孔径只有在>250μm时才会有骨长入，植入物的含孔率以30%～50%时最为合适 [7] 。本实验应用的DBM骨粒，较多区域存在400～800μm的不规则孔隙，孔隙率为35.28%，这完全符合要求，在植入体内后有利于新骨组织的长入，作为骨缺损修复的支架材料，是十分有用的。
3.3 HA和α-聚脂类载体 HA是生物活性陶瓷的一种，具有缓慢吸收和随意控制结构等特点。大量的动物实验表明，HA对组织无不良反应，与植入部位的软硬组织均有极好的生物相容性 [8] 。但HA孔径大小是研究过程中值得注意的问题，这有可能是rhOP-1/HA实验组无骨组织形成的原因。
, 百拇医药
α-聚脂是一类人工合成的生物降解材料，已有研究表明作为极有潜力的BMPs载体，α-聚脂在牙齿和整形外科中有较高的应用价值 [9] 。但聚合物比重大小是此载体作用 的决定因素，也可能是造成α-聚脂/rhOP-1的复合物植入体内后无新骨形成的原因。
但以HA和α-聚脂类作为rhOP-1的载体植入小鼠体内三周后，发现有间充质细胞的增生，这提示有可能骨诱导发生的时间比较晚，而且从ALP水平和Ca含量的测定结果来看，HA和α-聚脂类对rhOP-1的作用远不及DBM。 通过本实验研究证实:(1)DBM为rhOP-1的良好载体;(2)DBM具有一定的力学强度，且具有良好的孔隙率，与rhOP-1复合后加速了异位骨诱导的过程，加大了成骨量，对临床上骨缺损的修复是十分有利的。
参考文献
1 Seeherman H.The influence of delivery vehicles and their properties on the repair of segmental defects and fractures with osteogenic factors.J-Bone-Joint-Surg，2001，83-A(S1):79-81.
, 百拇医药
2 刘玉清，胡蕴玉，陆裕朴.重组合异种骨的研究-牛松质骨和BMP的再结合.骨与关节损伤杂志，1990，6:180-183.
3 Reddi AH，Sullivan NE.Matrix-induced endochodral bone differentiaˉtion:influence of hyprophysectomy，growth hormone，and thyroid stimuˉlating hormone.Encrinology，1980，107(5):1291-1296.
4 Cook SD，Salkeld SL，Patron LP，et al.Healing course of primate ulna segmental defects treated with osteogenic protein-1.J Ivest surg，2002，15(2):69-79.
, 百拇医药 5 King GN.The importance of drug delivery to optimize the effects of bone morphogenetic proteins during periodontal regeneration.Curr Pharn Biotechnol，2001，2(2):131-142.
6 Weber FE，Eyrich G，Gratz KW，et al.Slow and continuous application of human recombinant bone morphogenetic protein via biodegradable poly(lactide-co-glycolide)foam spheres.Int J Oral Maxillofac Surg，2002，31(1):60-65.
7 Klawitter J，Hullbert S.Application of porous ceramics for the attachment of load bearing orthopedic application.J Biomed Master Res，1971，2:161-165.
, http://www.100md.com
8 Thomas ME，Richter PW，Crooks J，et al.Macroporous synthetic hydroxˉyapatite bioceramics for bone substitute applications.S Afr J Sci，1999，95:359-362.
9 Bessho K，Carnes DL，Cavin R，et al.Experimental studies on bone inˉduction using low-molecular-weight poly(DL-lactied-co-glycolˉide)as a carrier for recombinant human bone morphogenetic protein-2.J Biomed Mater Res，2002，61(1):61-65.
基金项目:国家科技部基金项目(编号:981154506)
作者单位: 250062 山东省医药生物技术研究中心、卫生部生物技术药物重点实验室
(收稿日期:2003-08-19)
(编辑 李年令), 百拇医药(王敏)
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关键词 重组人成骨蛋白-1 载体 骨诱导
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-6115(2003)11-0961-03
The experimental studies on screening biomaterials as rhop-1carriers
WangMin，Han Jinxiang
Key Laboratory for Medical Molecular Biology of Shandong Province，
Key Laboratory for Biotech-Drugs Ministry of Health，Jinan250062.
【Abstract】 Objective To obtain an optimal carrier，several biomaterials have been tested as candidate carriˉers for recombinant human osteogenic protein-1(rhOP-1).Methods The biomaterials included inactive decalcified bone matrix(DBM)，hydroxyapatite(HA)，polylactic acid(PLA)，polylactic acid-polyethylene glycol copolymers(PLA-PEG)and polylactic glycolic acid(PLGA)，mixed with rhOP-1respectively，and implanted into the thigh muscles of mice for3weeks to evaluate their capacity to elicit bone formation.Osteoinduction was assessed by histological methods，quantitative measurement of alkaline phosphatase(ALP)level and calcium content of the ectopic new bone.Results Three weeks after implantation，DBM/rhOP-1，rhOP-1and controlⅥall showed new bone formation.Massive bone trabeculae，medullary cavity of bone，and lamellar bone was observed in group A，the blood vessel and hematopoietic marrow were plenty;fibrous bone was present in group F;and compact bone of high maturity was obˉserved in controlⅥ.Mesenchymal celluar proliferation was observed in the rest complex groups，they did not show new bone formation.The materials were partially absorbed.ALP level and calciumcontent were significant high in every complexed group than control group respectively，group Awas higher than group B，C，D and E(P<0.05);No signifiˉcant difference between group F and controlⅥ(P>0.05).There was no significant difference in group B，C，D，E and F respectively(P>0.05)except for group A.Conclusion (1)DBMwas effective carrier for rhOP-1;(2)DBM/rhOP-1is useful to accelerate bone defect repair clinically.
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Key words recombinant human osteogenic protein-1 carriers bone-inducing
骨形态发生蛋白(BMP)是一类特殊的骨生长因子，具有扩散性，能在体内外诱导未分化的间质细胞、骨髓中的髓母细胞、诱导软骨和骨的形成。但单纯BMP在体内易被蛋白酶所降解，在有效时间内无法作用于更多的靶细胞，其诱导活性也难以得到充分发挥，而且，对于较大的骨缺损，BMP不能发挥支架和填充作用。因此，在获得了高纯度、高活性的BMP后，适宜载体的选择对于BMP发挥最大骨诱导活性至关重要 [1] 。目前用作BMP载体的材料大体可分为天然有机高分子材料，人工合成高分子有机物和无机材料三类。本研究将rhBMP-7(rhOP-1)分别与无活性脱钙骨基质(DBM)、羟基磷灰石(HA)、3种α-聚脂类(PLA、PLA-PEG、PLGA)复合，比较其骨诱导活性，旨在筛选一种较为理想的rhOP-1载体，为临床应用提供依据。
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1 材料与方法
1.1 材料制备
1.1.1 重组人成骨蛋白-1(rhOP-1) 为本中心生产，经两步SP-FF纯化后，保存备用。
1.1.2 无活性脱钙骨基质(DBM) [2] 取健康狗的四肢长骨约2kg，去除骨膜、骨髓及软组织后砸成碎片，制成3mm×3mm×3mm大小的骨粒，流水冲洗4～5h，室温下用0.5M/L盐酸脱钙4h以上，直至检测不到钙为止(1g骨粒:50ml盐酸)。脱钙后用流水冲洗3h，300ml/L过氧化氢脱蛋白24h后浸泡于5倍于骨粒体积的无水乙醇脱水6h、乙醚脱脂1h后再行脱水，置通风处干燥过夜，环氧乙烷消毒后置于密闭容器内保存备用。
1.1.3 rhOP-1与载体的复合 精确称取rhOP-14mg8份，分别溶于适量4M盐酸胍中，然后加入DBM30mg，将液体与固体成分充分混匀，抽真空30min，对40倍蒸馏水透析48h，每12h更换透析液一次，置于冷冻干燥机内冻干，制成含rhOP-14mg、DBM30mg的复合物，以同样方法制备另外几种复合物。取部分样品扫描电镜下观察载体结构和蛋白的复合情况(图1)，另备单纯载体30mg和rhOP-14mg各8份，全部环氧乙烷熏蒸消毒，4℃保存备用。
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1.2 实验动物分组 取昆明种小鼠96只(由山东大学实验动物中心提供)，均为雄性，体重18～22g，适应动物房环境2周。将小鼠随机分为12组(如表1):A、B、C、D、E、F6个实验组，设对照Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ组。手术时以安氟醚吸入麻醉小鼠，在无菌条件下切开小鼠股部前内侧皮肤，剪开深筋膜，暴露内侧肌群，将经过处理的植入物植入内侧肌间隙，逐层缝合，无菌消毒。第Ⅵ组注入真核表达OP-12ml，作为rhOP-1诱导实验的对照。将小鼠放在经过消毒的饲养笼内分笼饲养，正常饮食，均在3周离断颈椎处死，先行大体观察，取材后每份标本平均分为两份，分别用于组织学和生化检测。
表1 实验分组及处理 略
1.3 实验检测
1.3.1 标本大体观察 取材后大体观察植入物的颜色及与周围软组织的连接情况。
1.3.2 组织学检测 取材后将标本置于10%的中性甲醛中固定24h以上，然后依次脱钙、水洗、脱水、石蜡包埋，制成切片，HE染色，光镜下观察。
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1.3.3 定量标本的处理 在文献报道的已有方法基础 [3] 之上，加以改进。取材后，彻底消除标准表面的软组织，称重，置玻璃匀浆器内加入冰预冷的生理盐水2ml，匀浆，10000rpm离心10min，上清用于碱性磷酸酶(ALP)检测，沉淀 用于Ca含量检测。
1.3.4 ALP测定 取上清100μl，加PNPP50μl，37℃孵育10min，加1M NaOH50μl终止反应，紫外分光光度仪在410nm处比色，测定OD值，以标本湿重为除数，计算ALP的单位U/mg组织(湿重)。
1.3.5 Ca含量测定 取上述离心后沉淀加0.5M HCl2.5ml溶解，将HCl浓度调为1%(其中含10%硝酸锶2.5ml)，原子吸收分光光度仪测钙含量，也以标本湿重为除数，计算Ca含量μg/mg组织(湿重)。因HA本身含有一定的钙，B组和对照组Ⅱ不作Ca含量测定。
1.4 统计学处理 图片资料以图片显示结果，实验数据采用安全随机设计的多样本均数比较的单因素方差分析(ANOVA)，P<0.05认为差异有显著性。
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2 结果
2.1 SEM结果 各组蛋白均复合良好，吸附均匀。DBM为疏松的孔隙结构，孔径400～800μm，相互串联，孔隙率为35.28%;HA呈致密型脉络状;三种α-聚脂类均为珊瑚样微孔结构。
2.2 标本大体观察 所有植入物均被周围纤维组织包裹，呈灰白色，rhOP-1/DBM相结合紧密，可见半透明状较硬韧的骨样组织。
2.3 组织学检测 术后21天，镜下可见各组均无炎细胞浸润，周围肌组织正常，rhOP-1/DBM组、单独植入rhOP-1组和真核表达OP-1注入组均有骨组织生成。A组:可见大量骨小梁、骨髓腔和板层骨，血管和骨髓丰富，成骨率8/8(图2);F组:间充质细胞增殖明显，可见软骨岛，并有少量编织骨形成，成骨率6/8(图3);对照组Ⅵ:可见分化成熟的致密骨组织，成骨率8/8(图4);其余四组复合组可见间充质细胞增生，未见骨组织;各组载体部分吸收。其余各单独载体植入组未见任何骨诱导发生。
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2.4 ALP和Ca含量测定结果 见表2。术后21天，ALP水平和Ca含量，单独植入rhOP-1F组与真核表达OP-1注入组差异无显著性(P>0.05);各复合组与不含rhOP-1的对照组相比、A组与其他复合组相比，差异均有显著性(P<0.05);B、C、D、E四组复合组与F组之间差异均无显著性(P>0.05)，但rhOP-1/DBM组均高于F组(P<0.01)。
表2 标本中的ALP水平和Ca含量测定结果 略
3 讨论
3.1 rhOP-1与异位骨诱导 rhOP-1是骨细胞分化和成骨作用有效的调节器，大量的临床应用研究充分证实了这些生物活性分子的独特作用 [4] 。本实验将rhOP-1单独植入，术后21天，组织学观察，有编织骨形成，但成骨量与新骨的成熟度远不及rhOP-1与DBM的复合组。这可能是因为单独植入rhOP-1组，易被蛋白酶所降解，扩散太快，在有效时间内无法作用于更多的靶细胞，其诱导活性也难以得到充分发挥，而载体可以起到缓慢释放作用，使BMP维持在植入位点并促使其释放浓度最佳化，而使BMP成骨效应达到最大化 [5] 。另外，合适的载体可作为成骨细胞的诱导矩阵，在骨形成时期保持一定的空间和体积，最终分化为骨组织，这充分说明了合适载体对于rhOP-1诱骨活性的重要性 [6] 。
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3.2 DBM载体 本实验自行制备的DBM，其中的非胶原成分被全部去除或是减少到最大限度，其多孔状结构有利于蛋白的吸附和细胞、血管的长入，DBM作为rhOP-1的良好载体，可起到缓慢释放作用，加速了异位骨诱导过程。DBM在rhOP-1/DBM复合植入后21天，组织学观察可见大量骨小梁和板层骨生成，血管和骨髓丰富，定量指标也明显高于单独植入组和其他的复合组，这充分证实DBM作为rhOP-1的载体的重要性，但DBM制备过程中的孔径大小问题可能会影响活性的发挥。有研究认为，DBM孔径<100μm会使新骨的长入受限，孔径只有在>250μm时才会有骨长入，植入物的含孔率以30%～50%时最为合适 [7] 。本实验应用的DBM骨粒，较多区域存在400～800μm的不规则孔隙，孔隙率为35.28%，这完全符合要求，在植入体内后有利于新骨组织的长入，作为骨缺损修复的支架材料，是十分有用的。
3.3 HA和α-聚脂类载体 HA是生物活性陶瓷的一种，具有缓慢吸收和随意控制结构等特点。大量的动物实验表明，HA对组织无不良反应，与植入部位的软硬组织均有极好的生物相容性 [8] 。但HA孔径大小是研究过程中值得注意的问题，这有可能是rhOP-1/HA实验组无骨组织形成的原因。
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α-聚脂是一类人工合成的生物降解材料，已有研究表明作为极有潜力的BMPs载体，α-聚脂在牙齿和整形外科中有较高的应用价值 [9] 。但聚合物比重大小是此载体作用 的决定因素，也可能是造成α-聚脂/rhOP-1的复合物植入体内后无新骨形成的原因。
但以HA和α-聚脂类作为rhOP-1的载体植入小鼠体内三周后，发现有间充质细胞的增生，这提示有可能骨诱导发生的时间比较晚，而且从ALP水平和Ca含量的测定结果来看，HA和α-聚脂类对rhOP-1的作用远不及DBM。 通过本实验研究证实:(1)DBM为rhOP-1的良好载体;(2)DBM具有一定的力学强度，且具有良好的孔隙率，与rhOP-1复合后加速了异位骨诱导的过程，加大了成骨量，对临床上骨缺损的修复是十分有利的。
参考文献
1 Seeherman H.The influence of delivery vehicles and their properties on the repair of segmental defects and fractures with osteogenic factors.J-Bone-Joint-Surg，2001，83-A(S1):79-81.
, 百拇医药
2 刘玉清，胡蕴玉，陆裕朴.重组合异种骨的研究-牛松质骨和BMP的再结合.骨与关节损伤杂志，1990，6:180-183.
3 Reddi AH，Sullivan NE.Matrix-induced endochodral bone differentiaˉtion:influence of hyprophysectomy，growth hormone，and thyroid stimuˉlating hormone.Encrinology，1980，107(5):1291-1296.
4 Cook SD，Salkeld SL，Patron LP，et al.Healing course of primate ulna segmental defects treated with osteogenic protein-1.J Ivest surg，2002，15(2):69-79.
, 百拇医药 5 King GN.The importance of drug delivery to optimize the effects of bone morphogenetic proteins during periodontal regeneration.Curr Pharn Biotechnol，2001，2(2):131-142.
6 Weber FE，Eyrich G，Gratz KW，et al.Slow and continuous application of human recombinant bone morphogenetic protein via biodegradable poly(lactide-co-glycolide)foam spheres.Int J Oral Maxillofac Surg，2002，31(1):60-65.
7 Klawitter J，Hullbert S.Application of porous ceramics for the attachment of load bearing orthopedic application.J Biomed Master Res，1971，2:161-165.
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基金项目:国家科技部基金项目(编号:981154506)
作者单位: 250062 山东省医药生物技术研究中心、卫生部生物技术药物重点实验室
(收稿日期:2003-08-19)
(编辑 李年令), 百拇医药(王敏)