TT病毒感染病人肝组织中TT病毒分布特点研究
【摘要】 目的 探讨TT病毒感染病人肝组织中TT病毒分布特点。方法 建立改良原位PCR技术，用以检测血清TT病毒阳性病人的肝组织标本，观察TT病毒在肝组织中分布特点。结果 在肝细胞、肝癌细胞及内皮细胞中，TT病毒主要分布在细胞核。结论 TT病毒是一种嗜肝性病毒，肝细胞、肝癌细胞及内皮细胞的细胞核是其复制场所。
关键词 原位PCR 肝组织 TT病毒
【文献标识码】 A 【文章编号】 1726-7587(2003)11-0970-02
Distribution of TT virus in liver tissue in patients infected with TT virus
Deng Chuanzhen，Li Yinpeng，Jiang Lingmei，et al.
, 百拇医药
Department of Gastroenterology，Shenzhen People’s Hospital，Shenzhen518020.
【Abstract】 Objective To explore distribution of TT virus in liver tissue
in patients infected with TT virus.Methods A modified in situ PCR for TTvirus was established.Hepatic specimens of patients with positive test for TT virus was examined to observe distribution of TT virus in liver tissue.Results TT virus was distributed in the nucleus of hepatocytes，hepatic carcinoma cells and endoth eliocytes in liver.Conclusion TTV is hepatotropic virus and the duplication is mainly in the nucleus of target cells.
, 百拇医药
Key words in situ PCR liver tissue TT virus
TT病毒是一种单链环状DNA病毒 [1，2] ，TT病毒感染者肝脏中病毒的分布及其意义目前尚不清楚。我们建立了改良原位PCR法并检查血清TT病毒DNA阳性病人的肝组织标本80例，以观察TT病毒感染病人肝组织中TT病毒的分布特点，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 病人 血清TT病毒DNA阳性病人80例，男64例，女16例，年龄为21～78岁，平均年龄56.2岁。80例患者中慢性肝炎30例，肝硬化22例，肝癌18例，外伤性肝破裂10例。
1.1.2 肝组织标本 经巢式PCR法检测血清中TT病毒DNA阳性病人，通过肝穿或手术切除获得肝脏标本，用10%中性福尔马林固定，常规石蜡包埋切片，厚4μm。
, 百拇医药
1.1.3 TTV引物合成 根据Okamoto等 [3] 报道的TTV基因序列，采用Goldkey软件，在TTV开放读码框1(ORF1)的高度保守区设计两对套式引物，委托上海Sangon生物工程公司合成。
1.1.4 原位PCR引物 以套式引物的T 3 、T 4 为引物，T 2 的5′-端以地高辛标记，委托上海sangon生物工程公司合成。
1.2 方法
1.2.1 肝脏TTV改良原位PCR检测
1.2.1.1 肝脏石蜡切片处理 常规脱蜡，蛋白酶K37℃消化，用PBS漂洗，多聚甲醛后固定，贴基因框。
1.2.1.2 PCR扩增 PCR缓冲液6μl，25mM MgCl 2 10.8μl，dNTPs4.8μl，T 2 、T 3 各1.2μl，BSA2.4μl，水加至60μl。94℃变性3min，按下列参数循环:94℃1.5min，56℃2min。
, 百拇医药
1.2.1.3 扩增后处理 去基因框，洗片，羊血清封闭，1∶100Anti-Dig-AP亲和，NBT及BCIP显色，显色满意后水洗 中止反应，脱水，透明，封闭，在显微镜下检查。
1.2.1.4 结果判定 细胞内出现紫兰色颗粒为阳性。
1.2.1.5 对照 分别用无引物、无Taq酶及DNaseⅠ预处理等条件作为对照。
1.2.2 统计学方法 肝组织检查结果用χ 2 检验。
2 结果
TT病毒在肝组织中的分布特点见表1。肝炎、肝硬化和外伤性肝破裂病人的肝脏中，TT病毒主要分布在肝细胞核内与内皮细胞核内，极少数位于肝细胞浆内。肝炎标本中，TT病毒呈散在分布，汇管区周围稍密集，肝硬化标本假小叶内TT病毒呈散在分布。肝癌细胞中TT病毒位于肝癌细胞核内，癌组织周围肝细胞内TT病毒散在分布。
, 百拇医药
表1 不同肝病肝脏标本中TT病毒分布特点 (略)
3 讨论
巢式PCR技术是诊断血清中存在TT病毒的主要方法 [4] 。然而血清TT病毒检测结果并不能反映TT病毒感染后在肝组织中的定位与分布。我们应用改良原位PCR技术对病人血清TT病毒阳性病人的肝脏标本检测结果表明，TT病毒感染肝细胞、肝癌细胞及内皮细胞后，主要分布特点是在细胞核内，极少数分布在细胞浆。这种分布特点从形态学上提示TT病毒具有嗜肝性，其复制场所主要在其靶细胞核。在肝细胞癌标本中，可见TT病毒分布于肝癌细胞核内及肝癌组织周围，这种分布特点是否能提示TT病毒与肝细胞癌之间的关系，尚待进一步研究。
本研究对原位PCR法进行了改进，检测效果较好。长期以来，人们用直接原位PCR法通常用放射性同位素、地高辛或生物素标记dUTP。但实验证明直接原位PCR法检测肝脏TT病毒感染效果很不理想。用dig-11-dUTP标记TT病毒DNA扩增产物，以此检测肝脏标本时假阳性率极高。即使在缺少引物的条件下仍出现阳性信号，表明竞争掺入标记与引物无关。产生假阳性信号的原因是标本经福尔马林固定和蛋白酶K处理后，核酸链出现缺口 [5] ，在PCR扩增过程中，Taq酶非特异地修复并扩增这些缺口，引起dig-11-dUTP非特异性地掺入，经亲合组化显色后，出现假阳性信号。为了解决上述难题，我们将地高辛直接标记在引物5′-端，这样既不影响正常PCR反应，同时可避免标记分子的非特异性掺入。改良原位PCR技术使用的引物选自TT病毒DNA ORF1中的保守序列，经特异性扩增ORF1中的272nt片段，出现紫蓝色阳性信号即表明TT病毒存在。而省略引物、省略Taq酶或用DNaseⅠ预处理标本 后均无阳性信号，表明改良原位PCR检测肝脏TT病毒感染的特异性强。
, 百拇医药
参考文献
1 Miyata H，Tsunoda H，Kazi A，et al.Identification of a novel GC-rich113-nucleotide region to complete the circular，single-stranded DNA genome of TTvirus，the first human circovirus.J Virol，1999，73，3582-3586.
2 Gu J.Principles and application of in situ PCR.Cell Vision，1994，1:8-9.
3 Okamoto H，Nishizawa T，Kato N，et al.Molecular cloning and characˉterization of a novel DNA virus(TTV)associated with posttransfusion hepatitis of unknown etiology.Hepatol Res，1998，10:1-16.
, 百拇医药
4 马为民，周伯平，王火生.一种新的可经输血转播病毒(TTV)的分子流行病学研究.中华肝脏病杂志，1998，6:167-169.
5 Musso O，Sommer P，Drouet E，et al.In situ detection of human cyˉtomegalo
virus DNA in gastrointestinal biopsies from Aids patients by means of various PC
R-derived methods.J Virol Methods，1996，56:125-137.
作者单位:518020广东省深圳市人民医院消化内科
(收稿日期:2003-10-09)
(编辑 刘娜), 百拇医药(邓传珍)
关键词 原位PCR 肝组织 TT病毒
【文献标识码】 A 【文章编号】 1726-7587(2003)11-0970-02
Distribution of TT virus in liver tissue in patients infected with TT virus
Deng Chuanzhen，Li Yinpeng，Jiang Lingmei，et al.
, 百拇医药
Department of Gastroenterology，Shenzhen People’s Hospital，Shenzhen518020.
【Abstract】 Objective To explore distribution of TT virus in liver tissue
in patients infected with TT virus.Methods A modified in situ PCR for TTvirus was established.Hepatic specimens of patients with positive test for TT virus was examined to observe distribution of TT virus in liver tissue.Results TT virus was distributed in the nucleus of hepatocytes，hepatic carcinoma cells and endoth eliocytes in liver.Conclusion TTV is hepatotropic virus and the duplication is mainly in the nucleus of target cells.
, 百拇医药
Key words in situ PCR liver tissue TT virus
TT病毒是一种单链环状DNA病毒 [1，2] ，TT病毒感染者肝脏中病毒的分布及其意义目前尚不清楚。我们建立了改良原位PCR法并检查血清TT病毒DNA阳性病人的肝组织标本80例，以观察TT病毒感染病人肝组织中TT病毒的分布特点，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 病人 血清TT病毒DNA阳性病人80例，男64例，女16例，年龄为21～78岁，平均年龄56.2岁。80例患者中慢性肝炎30例，肝硬化22例，肝癌18例，外伤性肝破裂10例。
1.1.2 肝组织标本 经巢式PCR法检测血清中TT病毒DNA阳性病人，通过肝穿或手术切除获得肝脏标本，用10%中性福尔马林固定，常规石蜡包埋切片，厚4μm。
, 百拇医药
1.1.3 TTV引物合成 根据Okamoto等 [3] 报道的TTV基因序列，采用Goldkey软件，在TTV开放读码框1(ORF1)的高度保守区设计两对套式引物，委托上海Sangon生物工程公司合成。
1.1.4 原位PCR引物 以套式引物的T 3 、T 4 为引物，T 2 的5′-端以地高辛标记，委托上海sangon生物工程公司合成。
1.2 方法
1.2.1 肝脏TTV改良原位PCR检测
1.2.1.1 肝脏石蜡切片处理 常规脱蜡，蛋白酶K37℃消化，用PBS漂洗，多聚甲醛后固定，贴基因框。
1.2.1.2 PCR扩增 PCR缓冲液6μl，25mM MgCl 2 10.8μl，dNTPs4.8μl，T 2 、T 3 各1.2μl，BSA2.4μl，水加至60μl。94℃变性3min，按下列参数循环:94℃1.5min，56℃2min。
, 百拇医药
1.2.1.3 扩增后处理 去基因框，洗片，羊血清封闭，1∶100Anti-Dig-AP亲和，NBT及BCIP显色，显色满意后水洗 中止反应，脱水，透明，封闭，在显微镜下检查。
1.2.1.4 结果判定 细胞内出现紫兰色颗粒为阳性。
1.2.1.5 对照 分别用无引物、无Taq酶及DNaseⅠ预处理等条件作为对照。
1.2.2 统计学方法 肝组织检查结果用χ 2 检验。
2 结果
TT病毒在肝组织中的分布特点见表1。肝炎、肝硬化和外伤性肝破裂病人的肝脏中，TT病毒主要分布在肝细胞核内与内皮细胞核内，极少数位于肝细胞浆内。肝炎标本中，TT病毒呈散在分布，汇管区周围稍密集，肝硬化标本假小叶内TT病毒呈散在分布。肝癌细胞中TT病毒位于肝癌细胞核内，癌组织周围肝细胞内TT病毒散在分布。
, 百拇医药
表1 不同肝病肝脏标本中TT病毒分布特点 (略)
3 讨论
巢式PCR技术是诊断血清中存在TT病毒的主要方法 [4] 。然而血清TT病毒检测结果并不能反映TT病毒感染后在肝组织中的定位与分布。我们应用改良原位PCR技术对病人血清TT病毒阳性病人的肝脏标本检测结果表明，TT病毒感染肝细胞、肝癌细胞及内皮细胞后，主要分布特点是在细胞核内，极少数分布在细胞浆。这种分布特点从形态学上提示TT病毒具有嗜肝性，其复制场所主要在其靶细胞核。在肝细胞癌标本中，可见TT病毒分布于肝癌细胞核内及肝癌组织周围，这种分布特点是否能提示TT病毒与肝细胞癌之间的关系，尚待进一步研究。
本研究对原位PCR法进行了改进，检测效果较好。长期以来，人们用直接原位PCR法通常用放射性同位素、地高辛或生物素标记dUTP。但实验证明直接原位PCR法检测肝脏TT病毒感染效果很不理想。用dig-11-dUTP标记TT病毒DNA扩增产物，以此检测肝脏标本时假阳性率极高。即使在缺少引物的条件下仍出现阳性信号，表明竞争掺入标记与引物无关。产生假阳性信号的原因是标本经福尔马林固定和蛋白酶K处理后，核酸链出现缺口 [5] ，在PCR扩增过程中，Taq酶非特异地修复并扩增这些缺口，引起dig-11-dUTP非特异性地掺入，经亲合组化显色后，出现假阳性信号。为了解决上述难题，我们将地高辛直接标记在引物5′-端，这样既不影响正常PCR反应，同时可避免标记分子的非特异性掺入。改良原位PCR技术使用的引物选自TT病毒DNA ORF1中的保守序列，经特异性扩增ORF1中的272nt片段，出现紫蓝色阳性信号即表明TT病毒存在。而省略引物、省略Taq酶或用DNaseⅠ预处理标本 后均无阳性信号，表明改良原位PCR检测肝脏TT病毒感染的特异性强。
, 百拇医药
参考文献
1 Miyata H，Tsunoda H，Kazi A，et al.Identification of a novel GC-rich113-nucleotide region to complete the circular，single-stranded DNA genome of TTvirus，the first human circovirus.J Virol，1999，73，3582-3586.
2 Gu J.Principles and application of in situ PCR.Cell Vision，1994，1:8-9.
3 Okamoto H，Nishizawa T，Kato N，et al.Molecular cloning and characˉterization of a novel DNA virus(TTV)associated with posttransfusion hepatitis of unknown etiology.Hepatol Res，1998，10:1-16.
, 百拇医药
4 马为民，周伯平，王火生.一种新的可经输血转播病毒(TTV)的分子流行病学研究.中华肝脏病杂志，1998，6:167-169.
5 Musso O，Sommer P，Drouet E，et al.In situ detection of human cyˉtomegalo
virus DNA in gastrointestinal biopsies from Aids patients by means of various PC
R-derived methods.J Virol Methods，1996，56:125-137.
作者单位:518020广东省深圳市人民医院消化内科
(收稿日期:2003-10-09)
(编辑 刘娜), 百拇医药(邓传珍)