自体移植脾组织脾血窦内皮细胞吞噬功能的实验研究
【摘要】 目的 探讨自体移植脾组织脾血窦内皮细胞的吞噬功能，评价自体脾组织移植术后移植脾组织的功能。方法 采用健康昆明种小白鼠90只，随机分为对照组每组5只，手术组每组10只，手术组在无菌条件下行脾切除自体脾组织移植术，分别在术后14、30、60、90、120、180d经尾静脉注射5%墨汁混悬液(0.3～0.4ml/只)，注射后24h取脾组织进行组织学免疫组化第Ⅷ因子染色，在光镜、电镜下观察，同时检测脾血窦内皮细胞吞噬墨汁颗粒的数量。结果 自体移植脾组织脾血窦内皮细胞对第Ⅷ因子相关抗原呈阳性反应。自体脾组织移植术后30d、60d组脾血窦内皮细胞可见吞噬的墨汁颗粒，在90d、120d组逐渐增多，180d组接近正常脾，墨汁颗粒主要集中在红髓及边缘区。结论 自体脾组织移植术后，移植脾组织再生的脾血窦内皮细胞具有吞噬的功能，于自体脾组织移植术后30d、60d开始出现，术后90d、120d逐渐增强，术后180d接近正常脾。
关键词 脾脏 第Ⅷ因子 内皮细胞 小鼠
, http://www.100md.com 【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-6115(2003)12-1057-03
An experimental study on the phagocytic function of the
splenic sinus endothelial cells in the splenic autotransplants in rats
MaYuemei，Ma Xiaojuan，Cheng Aixia，et al.
Department of Operative Surgery，Tianjin Medical University，Tianjin300070.
【Abstract】 Objective To study splenic sinus endothelial cells and explore their roles in spleen function.Methods 90healthy Kunming mice were randomly divided into two groups:(1)total splenectomy combined with splenic autotransplantation group;(2)sham-operation group.Splenectomy and splenic autotransplantation were perˉformed in10animals，the other5only had sham-operation.The following investigations were conducted14，30，60，90，120and180days later in each group:Each mice was injected with Chinese ink(0.2～0.3ml，5%)from the tail vein in the24h postoperation.Immunohistochemical staining techniques，factorⅧ-related-antigen were used to inˉspect splenic sinus endothelial cells at different time points after the operation.Pieces were observed under light and electron-microscopes.Amount of the pinocytotic and phagocytic ink particulates in the endothelialcells were meaˉsured under the light microscope and computerized imaged analysis qualification.Results Splenic sinus endothelial cells were factorⅧ-related-antigen positive.The ink particulates could be found in splenic sinus endothelialcells after total splenectomy combined with splenic autotransplantation group;In24h and3d groups there were the most ink particulate than in other groups.Thesecells localized in red pulp and marginal zone.Conclusion There are phagocytˉicfunction of the splenic sinus endothelial cells in the splenic autotransplants in rats.
, 百拇医药
Key words spleen factorⅧ endothelial cell mice
脾脏是人体最大的周围淋巴器官，是免疫活性细胞增殖分化的场所。临床及实验研究证明脾脏有着极其重要的抗感染免疫及吞噬功能，这些功能的发挥主要依赖于脾血窦内皮细胞、巨噬细胞、T、B淋巴细胞、网状细胞及网状纤维等 [1～3] 。而脾血窦内皮细胞是脾内微循环通路上的第一道防线。但在自体脾组织移植后再生脾血窦内皮细胞吞噬功能的研究，报道甚少。为此，本文对自体脾组织移植后再生脾血窦内皮细胞吞噬功能进行观察，为临床及实验研究提供参考依据。
1 材料和方法
1.1 实验动物 采用健康昆明种小白鼠70只(由第三军医大学实验动物中心提供)，雌雄各半，体重12～15g，随机分为对照组和手术组，每组10只，手术组在无菌条件下行脾 切除自体脾组织大网膜内移植，分别于手术后14、60、90、120、180d经尾静脉注射5%墨汁混悬液(0.2～0.3ml/只)，注射后24h取移植脾组织进行观察，以正常组脾组织作为对照。
, http://www.100md.com
1.2 组织学观察及图像分析 分别取手术组5个相点移植脾组织和对照组脾组织，用10%甲醛固定24h，常规石蜡包埋，HE染色制片，光镜下观察。同时在光镜下采用Tiger医学图像分析系统检测 [3] ，脾血窦内皮细胞吞噬墨汁颗粒量，每个时相点测试10个标本，每组测30个视场。分别测得面积密度取平均值进行统计分析。
1.3 免疫组化观察 选各时相点脾组织，石蜡包埋，分别切取厚3μm切片，采用免疫组化ABC技术，用第Ⅷ因子相关抗原(DaKa公司产品)标记脾血窦内皮细胞，在光镜下观察。
1.4 电镜观察 取手术组5个相点移植脾组织块，切成小块，置3%戊二醛液内固定，透射电镜常规制片，在透射电镜下观察并摄像，观测脾血窦内皮细胞吞噬墨汁颗粒情况。
2 结果
组织学观察发现，在静脉注射墨汁混悬液后的各时相点的脾组织内，均见有细颗粒状，灰
, 百拇医药
色墨汁颗粒，散在分布于脾血窦内皮细胞胞浆内。自体脾组织移植术后14d脾血窦内皮细胞结构不清，未见有吞噬墨汁颗粒。图像分析统计结果显示:术后30d、60d脾血窦内皮细胞可见有吞噬的墨汁颗粒，主要见于部分脾血窦内。在术后90d、120d吞噬的墨汁颗粒逐渐增多，术后180d接近正常脾(图1)。但是，脾血窦轻度扩张，吞噬的墨汁颗粒主要集中在红髓及边缘区。
图1 自体脾组织移植术后各时相点脾血窦内皮细胞吞噬的墨汁颗粒量略
2.1 免疫组化观察 免疫组化标记发现，自体脾组织移植手术后30d、60d、90d脾血窦内皮细胞对第Ⅷ因子相关抗原呈阳性反应，脾血窦内皮细胞形态清晰，可见脾血窦内皮细胞吞噬的墨汁颗粒，多见于边缘区。术后120d、180d对第Ⅷ因子显色反应为强阳性(图2)。
图2 自体移植脾组织术后180d脾血窦内皮细胞对第Ⅷ因子相关抗原呈阳性反应，←脾血
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窦内皮细胞(略)
2.2 超微结构观察 对自体脾组织移植手术后脾组织进行了超微结构观察 [4] ，结果发现各时相点的脾血窦内皮细胞及部分脾血窦内腔内均见有墨汁颗粒。在术后14d脾血 窦内皮细胞结构不清晰，有少数细小的墨汁颗粒，术后30d、60d可见脾血窦内皮细胞胞浆内有散在墨汁颗粒，术后90、120d吞噬的墨汁颗粒逐渐增多，墨汁颗粒明显聚集成团，术后180d脾血窦内皮细胞胞浆内仍可见较多墨汁颗粒(图3)，与正常脾相近似，可见有吞噬体或吞噬泡等吞噬特征性结构。
图3 自体移植脾组织术后120d脾血窦内皮细胞及细胞内的墨汁颗粒(←)，R为红细胞，S为脾血窦， E为内皮细胞。(略)
3 讨论
脾血窦内皮细胞排列组成脾血窦壁，脾血窦直径约13～40μm，其间隙大小受脾脏舒缩功能的影响，脾血窦内皮细胞之间有间隙，有利于红细胞穿越，窦壁外贴附有许多巨噬细胞。脾血窦内皮细胞是脾脏清除衰老红细胞和血中异物以及特殊的免疫反应功能的重要结构之一，是血脾屏障的组成部分 [1，2] ，具有部分吞噬异物的功能，对抗原提呈、吞噬及淋巴细胞的迁移调控有协调作用。本文对脾切除自体脾组织移植手术后，移植脾组织脾血窦内皮细胞再生及功能恢复情况进行探讨，揭示移植脾组织脾血窦内皮细胞的吞噬功能。实验采用小白鼠在无菌条件下行脾切除自体脾组织移植，分别在术后经小鼠尾静脉注射5%墨汁混悬液，注射后24h取脾组织进行切片，在光镜、电镜下观察。采用免疫组化ABC技术，选择常用于标记血管、淋巴管及肿瘤血管内皮细胞的第Ⅷ因子相关抗原 [5] ，观察第Ⅷ因子在脾血窦内皮细胞的阳性反应情况，从而确定再生脾血窦内皮细胞的位置及形态。同时检测脾血窦内皮细胞吞噬墨汁颗粒的数量。光镜及电镜下均可见内皮细胞内有墨汁颗粒，可能是通过吞饮作用而进入内皮细胞。本文采用第Ⅷ因子相关抗原标记脾血窦内皮细胞方法较可靠。
, http://www.100md.com
正常脾及移植脾都具有部分阻止病原大分子物质滤过及吞噬功能，可以捕捉血中的抗原物质及异物 [5，6] 。但移植脾组织再生的脾血窦内皮细胞是否有吞噬功能，目前尚未见报道。本文研究结果表明:移植脾组织脾血窦内皮细胞再生后的吞噬功能于术后30d开始出现，光、电镜均可见脾血窦内皮细胞胞浆内有散在墨汁颗粒，术后90d、120d吞噬的墨汁颗粒逐渐增多，术后180d脾血窦内皮细胞的形态结构及吞噬墨汁颗粒与正常脾相似。本实验经注射墨汁混悬液，采用体视学方法，观察脾切除自体移植脾组织手术后各时相点脾血窦内皮细胞吞噬墨汁颗粒的数量，其结果显示，脾切除自体移植脾组织手术后，随着时间的推移，再生脾血窦内皮细胞逐渐成熟，其吞噬功能也逐渐增强，至手术180d移植脾组织的结构接近正常脾，所以再生的脾血窦内皮细胞的吞噬功能也恢复正常。自体移植脾组织脾血窦内皮细胞有吞噬墨汁颗粒的功能，并与基底膜、巨噬细胞、网状细胞及网状纤维组成血脾屏障，具有重要清除异物及大分子物质的功能。
参考文献
, http://www.100md.com
1 郭光金，蒋登金，张坤，等.自体移植脾组织血脾屏障重建的实验研究.第三军医大学学报，2002，26(12):1451-1453.
2 蒋登金，郭光金，张坤，等.血脾屏障结构与功能的实验研究.中华肝胆外科杂志，002，8(1):49-51.
3 张坤，郭光金，叶明福，等.自体移植脾组织血管再生的实验研究.第三军医大学学报，2002，24(3):308-310.
4 McCuskey RS，McCuskey PA.In Vivo and electron microscopic studies of the splenic microvasculature in mice.Experientia，1985，41:179-187.
5 Marques RG，Petroianu A，Coelho JM，et al.Regeneration of splenic auˉtotransplants.Ann-Hematol，2002，81(11):622-626.
6 arques RG，Petroianu A，de-Olivera Mb，et al.Bacterial clearance after total splenectomy and splenic autotransplantation in rats.Appl-Radiat-Isot，2002，57(6):767-771.
作者单位:300070天津医科大学手术学教研室
(收稿日期:2003-09-07)
(编辑 秋实), http://www.100md.com(马跃美)
关键词 脾脏 第Ⅷ因子 内皮细胞 小鼠
, http://www.100md.com 【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-6115(2003)12-1057-03
An experimental study on the phagocytic function of the
splenic sinus endothelial cells in the splenic autotransplants in rats
MaYuemei，Ma Xiaojuan，Cheng Aixia，et al.
Department of Operative Surgery，Tianjin Medical University，Tianjin300070.
【Abstract】 Objective To study splenic sinus endothelial cells and explore their roles in spleen function.Methods 90healthy Kunming mice were randomly divided into two groups:(1)total splenectomy combined with splenic autotransplantation group;(2)sham-operation group.Splenectomy and splenic autotransplantation were perˉformed in10animals，the other5only had sham-operation.The following investigations were conducted14，30，60，90，120and180days later in each group:Each mice was injected with Chinese ink(0.2～0.3ml，5%)from the tail vein in the24h postoperation.Immunohistochemical staining techniques，factorⅧ-related-antigen were used to inˉspect splenic sinus endothelial cells at different time points after the operation.Pieces were observed under light and electron-microscopes.Amount of the pinocytotic and phagocytic ink particulates in the endothelialcells were meaˉsured under the light microscope and computerized imaged analysis qualification.Results Splenic sinus endothelial cells were factorⅧ-related-antigen positive.The ink particulates could be found in splenic sinus endothelialcells after total splenectomy combined with splenic autotransplantation group;In24h and3d groups there were the most ink particulate than in other groups.Thesecells localized in red pulp and marginal zone.Conclusion There are phagocytˉicfunction of the splenic sinus endothelial cells in the splenic autotransplants in rats.
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Key words spleen factorⅧ endothelial cell mice
脾脏是人体最大的周围淋巴器官，是免疫活性细胞增殖分化的场所。临床及实验研究证明脾脏有着极其重要的抗感染免疫及吞噬功能，这些功能的发挥主要依赖于脾血窦内皮细胞、巨噬细胞、T、B淋巴细胞、网状细胞及网状纤维等 [1～3] 。而脾血窦内皮细胞是脾内微循环通路上的第一道防线。但在自体脾组织移植后再生脾血窦内皮细胞吞噬功能的研究，报道甚少。为此，本文对自体脾组织移植后再生脾血窦内皮细胞吞噬功能进行观察，为临床及实验研究提供参考依据。
1 材料和方法
1.1 实验动物 采用健康昆明种小白鼠70只(由第三军医大学实验动物中心提供)，雌雄各半，体重12～15g，随机分为对照组和手术组，每组10只，手术组在无菌条件下行脾 切除自体脾组织大网膜内移植，分别于手术后14、60、90、120、180d经尾静脉注射5%墨汁混悬液(0.2～0.3ml/只)，注射后24h取移植脾组织进行观察，以正常组脾组织作为对照。
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1.2 组织学观察及图像分析 分别取手术组5个相点移植脾组织和对照组脾组织，用10%甲醛固定24h，常规石蜡包埋，HE染色制片，光镜下观察。同时在光镜下采用Tiger医学图像分析系统检测 [3] ，脾血窦内皮细胞吞噬墨汁颗粒量，每个时相点测试10个标本，每组测30个视场。分别测得面积密度取平均值进行统计分析。
1.3 免疫组化观察 选各时相点脾组织，石蜡包埋，分别切取厚3μm切片，采用免疫组化ABC技术，用第Ⅷ因子相关抗原(DaKa公司产品)标记脾血窦内皮细胞，在光镜下观察。
1.4 电镜观察 取手术组5个相点移植脾组织块，切成小块，置3%戊二醛液内固定，透射电镜常规制片，在透射电镜下观察并摄像，观测脾血窦内皮细胞吞噬墨汁颗粒情况。
2 结果
组织学观察发现，在静脉注射墨汁混悬液后的各时相点的脾组织内，均见有细颗粒状，灰
, 百拇医药
色墨汁颗粒，散在分布于脾血窦内皮细胞胞浆内。自体脾组织移植术后14d脾血窦内皮细胞结构不清，未见有吞噬墨汁颗粒。图像分析统计结果显示:术后30d、60d脾血窦内皮细胞可见有吞噬的墨汁颗粒，主要见于部分脾血窦内。在术后90d、120d吞噬的墨汁颗粒逐渐增多，术后180d接近正常脾(图1)。但是，脾血窦轻度扩张，吞噬的墨汁颗粒主要集中在红髓及边缘区。
图1 自体脾组织移植术后各时相点脾血窦内皮细胞吞噬的墨汁颗粒量略
2.1 免疫组化观察 免疫组化标记发现，自体脾组织移植手术后30d、60d、90d脾血窦内皮细胞对第Ⅷ因子相关抗原呈阳性反应，脾血窦内皮细胞形态清晰，可见脾血窦内皮细胞吞噬的墨汁颗粒，多见于边缘区。术后120d、180d对第Ⅷ因子显色反应为强阳性(图2)。
图2 自体移植脾组织术后180d脾血窦内皮细胞对第Ⅷ因子相关抗原呈阳性反应，←脾血
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窦内皮细胞(略)
2.2 超微结构观察 对自体脾组织移植手术后脾组织进行了超微结构观察 [4] ，结果发现各时相点的脾血窦内皮细胞及部分脾血窦内腔内均见有墨汁颗粒。在术后14d脾血 窦内皮细胞结构不清晰，有少数细小的墨汁颗粒，术后30d、60d可见脾血窦内皮细胞胞浆内有散在墨汁颗粒，术后90、120d吞噬的墨汁颗粒逐渐增多，墨汁颗粒明显聚集成团，术后180d脾血窦内皮细胞胞浆内仍可见较多墨汁颗粒(图3)，与正常脾相近似，可见有吞噬体或吞噬泡等吞噬特征性结构。
图3 自体移植脾组织术后120d脾血窦内皮细胞及细胞内的墨汁颗粒(←)，R为红细胞，S为脾血窦， E为内皮细胞。(略)
3 讨论
脾血窦内皮细胞排列组成脾血窦壁，脾血窦直径约13～40μm，其间隙大小受脾脏舒缩功能的影响，脾血窦内皮细胞之间有间隙，有利于红细胞穿越，窦壁外贴附有许多巨噬细胞。脾血窦内皮细胞是脾脏清除衰老红细胞和血中异物以及特殊的免疫反应功能的重要结构之一，是血脾屏障的组成部分 [1，2] ，具有部分吞噬异物的功能，对抗原提呈、吞噬及淋巴细胞的迁移调控有协调作用。本文对脾切除自体脾组织移植手术后，移植脾组织脾血窦内皮细胞再生及功能恢复情况进行探讨，揭示移植脾组织脾血窦内皮细胞的吞噬功能。实验采用小白鼠在无菌条件下行脾切除自体脾组织移植，分别在术后经小鼠尾静脉注射5%墨汁混悬液，注射后24h取脾组织进行切片，在光镜、电镜下观察。采用免疫组化ABC技术，选择常用于标记血管、淋巴管及肿瘤血管内皮细胞的第Ⅷ因子相关抗原 [5] ，观察第Ⅷ因子在脾血窦内皮细胞的阳性反应情况，从而确定再生脾血窦内皮细胞的位置及形态。同时检测脾血窦内皮细胞吞噬墨汁颗粒的数量。光镜及电镜下均可见内皮细胞内有墨汁颗粒，可能是通过吞饮作用而进入内皮细胞。本文采用第Ⅷ因子相关抗原标记脾血窦内皮细胞方法较可靠。
, http://www.100md.com
正常脾及移植脾都具有部分阻止病原大分子物质滤过及吞噬功能，可以捕捉血中的抗原物质及异物 [5，6] 。但移植脾组织再生的脾血窦内皮细胞是否有吞噬功能，目前尚未见报道。本文研究结果表明:移植脾组织脾血窦内皮细胞再生后的吞噬功能于术后30d开始出现，光、电镜均可见脾血窦内皮细胞胞浆内有散在墨汁颗粒，术后90d、120d吞噬的墨汁颗粒逐渐增多，术后180d脾血窦内皮细胞的形态结构及吞噬墨汁颗粒与正常脾相似。本实验经注射墨汁混悬液，采用体视学方法，观察脾切除自体移植脾组织手术后各时相点脾血窦内皮细胞吞噬墨汁颗粒的数量，其结果显示，脾切除自体移植脾组织手术后，随着时间的推移，再生脾血窦内皮细胞逐渐成熟，其吞噬功能也逐渐增强，至手术180d移植脾组织的结构接近正常脾，所以再生的脾血窦内皮细胞的吞噬功能也恢复正常。自体移植脾组织脾血窦内皮细胞有吞噬墨汁颗粒的功能，并与基底膜、巨噬细胞、网状细胞及网状纤维组成血脾屏障，具有重要清除异物及大分子物质的功能。
参考文献
, http://www.100md.com
1 郭光金，蒋登金，张坤，等.自体移植脾组织血脾屏障重建的实验研究.第三军医大学学报，2002，26(12):1451-1453.
2 蒋登金，郭光金，张坤，等.血脾屏障结构与功能的实验研究.中华肝胆外科杂志，002，8(1):49-51.
3 张坤，郭光金，叶明福，等.自体移植脾组织血管再生的实验研究.第三军医大学学报，2002，24(3):308-310.
4 McCuskey RS，McCuskey PA.In Vivo and electron microscopic studies of the splenic microvasculature in mice.Experientia，1985，41:179-187.
5 Marques RG，Petroianu A，Coelho JM，et al.Regeneration of splenic auˉtotransplants.Ann-Hematol，2002，81(11):622-626.
6 arques RG，Petroianu A，de-Olivera Mb，et al.Bacterial clearance after total splenectomy and splenic autotransplantation in rats.Appl-Radiat-Isot，2002，57(6):767-771.
作者单位:300070天津医科大学手术学教研室
(收稿日期:2003-09-07)
(编辑 秋实), http://www.100md.com(马跃美)