IL-2和IFN-γ基因对HBV基因疫苗免疫协同效果的影响
【摘要】 目的 研究IL-2、IFN-γ基因对HBV基因疫苗诱导小鼠产生特异性体液免疫反应的影响，以探求HBV基因疫苗免疫预防及治疗的新策略。方法 构建pc-IL-2，pc-IFN-γ真核表达质粒，采用脂质体转染cos-7细胞，ELISA检测细胞培养上清液中IL-2、IFN-γ的表达。以pc-IL-2，pc-IFN-γ及表达IL-2与IFN-γ融合蛋白的质粒pcIIF，分别与乙肝表面抗原基因疫苗pcS 2 S等量混合，肌肉注射免疫BALB/c小鼠，每只鼠100μg，2周后采静脉血用ELISA测定免疫鼠血清中抗HBs水平。结果 重组质粒转染48h的细胞上清中IL-2、IFN-γ的表达水平分别为(6350±667)pg/ml和(7904±921)pg/ml。所有免疫小鼠均>10mIU/ml，其中以IL-2、IFN-γ联合或融合作为免疫佐剂组小鼠血清抗HBs水平最高，与IL-2、IFN-γ单独作为佐剂或不使用佐剂组相比差异均具有显著性(P<0.01)。结论 IL-2和适量的IFN-γ单独或联合作为佐剂均可增强HBV基因疫苗的免疫效果，其中以两种细胞因子联合使用效果最佳。
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关键词 乙肝表面抗原 乙肝病毒 基因疫苗 γ干扰素 白介素-2
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)11-1616-03
Evaluation on the effects of IL-2and IFN-γon humoral
immune responses with hepatitis B virus DNA vaccine
Ji Xiaonan，Chen Guangming，Yang Fuqiang，et al.
Dept.of Biotechnology，South China University of Technology，Guangzhou 510602
, 百拇医药
【Abstract】 Objective To investigate the effect of IL-2and IFN-γon immune response induced by plasˉmid encoding hepatitis B virus surface antigen and to explore new strategies for prophylactic and therapeutic HBV vacˉccines.Methods Construction and preparation the recombinant eukaryotic expressed plasmid pc-IFN-γand pc-IL-2.Then transfect the cos-7line cells，detect the target gene expression with ELISA.Furthermore，BALB/c mice were immunized with pc-HBs2s along or coimmunized with the recombinant plastmids，their sera were collected for analyzing anti-HBsAg antibody by ELISA.Results The transfected cells expressed the IL-2and IFN-γ.All imˉmunized mice were positive.Conclusion The pc-IFN-γuse alone inhibit the serum Ab level，the others all show more effective to induce humoral immune response in healthy mice than the pc-HBs2s using along，the most effective is the coimmunized with the pc-IL-2and pc-IFN-γ.
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Key words HBsAg HBV DNA vaccine IL-2 IFN-γ
基因疫苗又称DNA疫苗或核酸疫苗，是近年发展起来的一种新型疫苗。由于它能通过不同的途径刺激机体产生特异性细胞和体液免疫 [1，2] ，已引起国内外学者的广泛关注。研究表明多种细胞因子及其表达载体有明显的免疫佐剂效应，能显著提高疫苗的免疫效果 [3～6] ，其中γ干扰素(IFN-γ) [7] ，白介素-2(IL-2) [7～9] 的效果最为明显。HBV感染严重危害人类身体健康，预防和治疗HBV感染是目前乙肝研究领域的重大课题。本研究分别构建了表达人IL-2和小鼠IFN-γ的重组真核表达质粒，并同已构建的hIL-2/IFN-γ融合蛋白真核表达质粒pc-IIF [10]作为免疫佐剂，分别与HBV基因疫苗pcS 2 S联合免疫小鼠，观察IL-2、IFN-γ基因单独或联合使用时，对HBV基因疫苗免疫效果的影响。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 质粒，菌株及细胞 质粒pcDNA3.1(-)购自美国Invitrogen公司，大肠杆菌菌种DH5α购自上海博彩生物技术 公司，cos-7细胞株引自中科院上海细胞所，质粒pcS 2 S、pc-IIF和pvIL-2均由本室构建保藏。
1.1.2 主要试剂 “立可读”表面抗原检测试剂盒(上海科华)，IL-2和IFN-γ检测试剂盒(晶美公司)，盐酸布比卡因(上海禾丰制药)，巴比妥钠(广州南方化玻公司)，限制内切酶类，T4连接酶(大连宝生物公司)，其他试剂为国产分析纯。
1.1.3 实验动物 4～6周龄的雌性BALB/c小鼠购自第一军医大学实验动物中心。
1.2 方法
, 百拇医药
1.2.1 操作 质粒转化、抽提、酶切、连接等操作按标准实验程序进行。
1.2.2 质粒pc-IL-2和pc-IFN-γ的构建及制备 IFN-γ有生物学活性的种属特异性，人的IFN-γ不能作用于小鼠，因此我们根据已报道的小鼠IFN-γ基因序列，人工合成两条含NiceI和Bam HⅠ酶切位点的引物，从小鼠基因组中PCR扩增长468bp的IFN-γ基因，直接克隆到pUC119中，通过Nhe I和Bam HI酶切将小鼠IFN-γ基因克隆到pcDNA3.1(-)上，为pc-IFNγ;将已有的pvIL-2质粒用Xho I和EcoR I酶解将人IL-2基因克隆到pcDNA3.1(-)载体上，为pc-IL-2。以酶切和测序验证所构建的质粒。
1.2.3 重组质粒的制备 按Qiagen Plasmid Maxi Kit(QIAˉGEN，货号:12162)操作进行，采用紫外分光光度计测定含量。
1.2.4 重组质粒在cos-7细胞里的表达 将已纯化的质粒pcDNA3.1(-)，pc-IL-2和pc-IFNγ分别转染cos-7细胞，操作方法按FuGENE转染试剂盒(货号:1814443)说明进行，将转染细胞在37℃，5%CO 2 培养，于48h后收集上清，用ELISA方法检测细胞上清中的IFN-γ和IL-2的表达水平。
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1.2.5 免疫小鼠 取4～6周龄的雄性BALB/c小鼠，分5组，每组10只。免疫前5天小鼠胫前肌注射0.5%盐酸布比卡因，每侧50μl。免疫时，用75mg/kg戊巴比妥钠麻醉小鼠，将溶于PBS溶液中的DNA(浓度1mg/ml)注射于布比卡因处理后的胫前肌内。疫苗接种2周后，眼球后静脉采血，分离血清，置-20℃保存备用。具体分组与剂量如下:(1)为pc(-)+pcS 2 S(50+50)μg;(2)为pcS 2 S+pc-IIF(50+50)μg;(3)为pcS 2 S+pc-IL-2(50+50)μg;(4)为pcS 2 S+pc(-)IFN-γ(50+50)μg;(5)为pcS 2 S+pc(-)IFN-γ+pc-IL-2(50+25+25)μg。另有阴性参照3只，注射无质粒的PBS。
1.2.6 小鼠血清HBsAg及抗HBs的检测 参照科华公司的立可读试剂盒说明书进行。
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1.2.7 统计学方法 采用两样本均数比较的t检验。
2 结果
2.1 质粒pc-IL-2和质粒pc-IFN-γ的酶切鉴定 重组质粒pc-IL-2和质粒pc-IFN-γ经酶切和测序证实目的基因大小和插入方向与设计相符，IL-2为462bp，IFN-γ为480bp(见图1、图2)。
2.2 ELISA法检测转染cos-7细胞上清液IL-2和IFN-γ的表达水平 检测结果见表1。(稀释10倍)
表1 ELISA法检测转染cos-7细胞上清液IL-2和IFN-γ的表达水平结果 (略)
检测结果表明，在转染48h的细胞上清中IL-2和IFN-γ的表达量分别为(635.4±66.7)和(790.4±92.1)pg/ml，而空载体和细胞上清对照未检测到IL-2和IFN-γ的表达。
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2.3 IL-2和IFN-γ对HBV基因疫苗免疫效果影响的小鼠实验 小鼠免疫2周后，血清均出现抗HBs抗体(>10mIU/ml)。其中第二组和第五组血清中抗HBs抗体水平最高，分别为(135.83±65.08)和(133.85±57.94)mIU/ml，两组之间的差异无显著性(P>0.05)，而同第一组和第四组差异具有显著性(t>2.262，P<0.05)。数据见表2。
图1 pc-IFN-γ酶切电泳鉴定略
图2 pc-IL-2酶切电泳鉴定略
表2 不同基因佐剂诱导BALB/c小鼠血清抗-HBs的产生 (略)
3 讨论
为探讨两种细胞因子作为免疫佐剂的协同作用，在本研究中我们将两种细胞因子基因以单独、联合以及两者的基因融合的形式作为免疫佐剂与乙肝表面抗原疫苗pcS 2 S一起免疫小鼠，结果发现:(1)单独使用IL-2基因作为佐 剂，可明显提高HBV基因疫苗诱导小鼠产生的体液免疫应答，免疫后小鼠血清中抗HBs比单纯HBV基因疫苗免疫组有明显增高(P<0.05)，这个结果与先前的研究 [3，11] 吻合;(2)单独使用IFN-γ基因作为佐剂，剂量为50μg/只时，发现小鼠血清中抗HBs与单独HBV基因疫苗免疫组相比，反而有轻微下降，Bohm等人 [12] 也报道过类似的情况。这可能是在较大剂量时IFN-γ会抑制淋巴细胞(尤其是B细胞)的增殖反应，从而抑制免疫鼠的抗体分泌;(3)当IFN-γ与IL-2的剂量减半后(25μg+25μg/只)联合作为佐剂使用，与单纯HBV基因疫苗免疫组相比，可显著增强HBV基因疫苗诱导的小鼠体液免疫(P<0.01);与单独使用IL-2为佐剂组相比也具有差异性(P<0.05);(4)当使用hIL-2/IFN-γ融合蛋白基因质粒作为佐剂时，与单独HBV基因疫苗免疫组相比，同样可显著增强HBV基因疫苗诱导的小鼠体液免疫(P<0.05)。上述结果表明:(1)IL-2和适量的IFN-γ单独或联合作为佐剂均可增强HBV基因疫苗的免疫效果，其中以两种细胞因子联合作用效果最佳;(2)hIL-2/IFN-γ融合蛋白基因质粒和以IL-2和IFN-γ联合使用在提高HBV基因疫苗诱导的小鼠免疫应答方面表现出免疫协同作用，两者效果无明显差异，因此可采用hIL-2/IFN-γ融合蛋白基因质粒作为乙肝病毒基因疫苗的免疫佐剂，不仅可以提高HBV基因疫苗的免疫效果，同时也将简化质粒生产工艺和减少生产成本，为基因疫苗临床应用的可行性提供了依据。
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参考文献
1 Davis HL，Michel ML，Whalen RG.DNA-based immunization induces continuous secretion of hepatitis B surface antigen and high levels of cirˉculating antibody.Hum Mol Genet，1993，2(11):1847-1851.
2 Roy MJ，Wu MS，Barr LJ，et al.Induction of antigen-specific CD8+T cells，Thelper cells，and protective levels of antibody in humans by parˉticle-mediated administration of a hepatitis B virus DNA vaccine.Vacˉcine，2000，22:19(7-8):764-778.
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3 ChowYH，Chiang BL，Lee YL，et al.Development ofTh1andTh2popuˉlations and the nature of immune responses to hepatitits B virus DNA vaccines can be modulated by codelivery of various cytokine genes.J Immnol，1998，1:160(3):1320-1329.
4 Kim JJ，Yang JS，VanCottTC，et al.Modulation of antigen-specific huˉmoral
responses in rhesus macaques by using cytokine cDNAs and DNA vaccine adjuvants.J Virol，2000，74(7):3427-3429.
, 百拇医药
5 Pasquini S，Xiang Z，Wang Y，et al.Cytokines and costimulatory molecules as genetic adjuvants.Immunol Cell Biol，1997，75(4):397-401.
6 L Stevceva，AG Abimiku，G Franchini.Targeting the mucosa:genetically engineered vaccines and mucosal immune responses.Genes and Immuˉnityl，2000，308-315:Review.
7 Kim JJ，Yang JS，Manson KH，et al.Modulation of antigen-specific celˉlular immune responses to DNA vaccination in rhesus macaques through the use of IL-2，IFN-gamma，or IL-4gene adjuvants.Vaccine，2001，21;19(17-19):2496-2505.
, 百拇医药
8 Geissler M，Gesien A，Tokushige K，et al.Enhancement of cellular and humoral immune responses to hepatitis C virus core protein using DNA-based vaccines augmented with cytokine-expressing plasmids.J Imˉmunol，1997，158(3):1231-1237.
9 Chen G，Chen H，Guo H，Zheng H.Protective effect of DNA-mediated immunization with a combination of SAGI and IL-2gene adjuvant aˉgainst infection of Toxoplasma gondii in mice.Chin Med J(Engl)，2002，115(10):1448-1452.
, http://www.100md.com
10 何晓嫱，陈光明，黄英，等.治疗型双质粒HBV-NDA疫苗的构建及其鉴定.解放军医学杂志，2003，28(6):493-497.
11 Chow YH，Huang WL，Chi WK，et al.Improvement of hepatitis B virus DNA vaccines by plasmids coexpressing hepatitis B surface antigen and interleukin-2.J Virol，1997，71(1):169-178.
12 Bohm W，Kuhrober A，Paier T，et al.DNA vector constructs that prine hepatitis B surface antigen-specific cytotoxic T lymphocyte and antiˉbody responses in mice after intramuscular injection.J Immunol Methˉods，1996，14，193(1):29-40.
作者单位:1 510602广州华南理工大学食品与生物工程学院
2 空军广州医院肝病研究所免疫生化室
(编辑 秋实), 百拇医药(姬晓南)
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关键词 乙肝表面抗原 乙肝病毒 基因疫苗 γ干扰素 白介素-2
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)11-1616-03
Evaluation on the effects of IL-2and IFN-γon humoral
immune responses with hepatitis B virus DNA vaccine
Ji Xiaonan，Chen Guangming，Yang Fuqiang，et al.
Dept.of Biotechnology，South China University of Technology，Guangzhou 510602
, 百拇医药
【Abstract】 Objective To investigate the effect of IL-2and IFN-γon immune response induced by plasˉmid encoding hepatitis B virus surface antigen and to explore new strategies for prophylactic and therapeutic HBV vacˉccines.Methods Construction and preparation the recombinant eukaryotic expressed plasmid pc-IFN-γand pc-IL-2.Then transfect the cos-7line cells，detect the target gene expression with ELISA.Furthermore，BALB/c mice were immunized with pc-HBs2s along or coimmunized with the recombinant plastmids，their sera were collected for analyzing anti-HBsAg antibody by ELISA.Results The transfected cells expressed the IL-2and IFN-γ.All imˉmunized mice were positive.Conclusion The pc-IFN-γuse alone inhibit the serum Ab level，the others all show more effective to induce humoral immune response in healthy mice than the pc-HBs2s using along，the most effective is the coimmunized with the pc-IL-2and pc-IFN-γ.
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Key words HBsAg HBV DNA vaccine IL-2 IFN-γ
基因疫苗又称DNA疫苗或核酸疫苗，是近年发展起来的一种新型疫苗。由于它能通过不同的途径刺激机体产生特异性细胞和体液免疫 [1，2] ，已引起国内外学者的广泛关注。研究表明多种细胞因子及其表达载体有明显的免疫佐剂效应，能显著提高疫苗的免疫效果 [3～6] ，其中γ干扰素(IFN-γ) [7] ，白介素-2(IL-2) [7～9] 的效果最为明显。HBV感染严重危害人类身体健康，预防和治疗HBV感染是目前乙肝研究领域的重大课题。本研究分别构建了表达人IL-2和小鼠IFN-γ的重组真核表达质粒，并同已构建的hIL-2/IFN-γ融合蛋白真核表达质粒pc-IIF [10]作为免疫佐剂，分别与HBV基因疫苗pcS 2 S联合免疫小鼠，观察IL-2、IFN-γ基因单独或联合使用时，对HBV基因疫苗免疫效果的影响。
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1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 质粒，菌株及细胞 质粒pcDNA3.1(-)购自美国Invitrogen公司，大肠杆菌菌种DH5α购自上海博彩生物技术 公司，cos-7细胞株引自中科院上海细胞所，质粒pcS 2 S、pc-IIF和pvIL-2均由本室构建保藏。
1.1.2 主要试剂 “立可读”表面抗原检测试剂盒(上海科华)，IL-2和IFN-γ检测试剂盒(晶美公司)，盐酸布比卡因(上海禾丰制药)，巴比妥钠(广州南方化玻公司)，限制内切酶类，T4连接酶(大连宝生物公司)，其他试剂为国产分析纯。
1.1.3 实验动物 4～6周龄的雌性BALB/c小鼠购自第一军医大学实验动物中心。
1.2 方法
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1.2.1 操作 质粒转化、抽提、酶切、连接等操作按标准实验程序进行。
1.2.2 质粒pc-IL-2和pc-IFN-γ的构建及制备 IFN-γ有生物学活性的种属特异性，人的IFN-γ不能作用于小鼠，因此我们根据已报道的小鼠IFN-γ基因序列，人工合成两条含NiceI和Bam HⅠ酶切位点的引物，从小鼠基因组中PCR扩增长468bp的IFN-γ基因，直接克隆到pUC119中，通过Nhe I和Bam HI酶切将小鼠IFN-γ基因克隆到pcDNA3.1(-)上，为pc-IFNγ;将已有的pvIL-2质粒用Xho I和EcoR I酶解将人IL-2基因克隆到pcDNA3.1(-)载体上，为pc-IL-2。以酶切和测序验证所构建的质粒。
1.2.3 重组质粒的制备 按Qiagen Plasmid Maxi Kit(QIAˉGEN，货号:12162)操作进行，采用紫外分光光度计测定含量。
1.2.4 重组质粒在cos-7细胞里的表达 将已纯化的质粒pcDNA3.1(-)，pc-IL-2和pc-IFNγ分别转染cos-7细胞，操作方法按FuGENE转染试剂盒(货号:1814443)说明进行，将转染细胞在37℃，5%CO 2 培养，于48h后收集上清，用ELISA方法检测细胞上清中的IFN-γ和IL-2的表达水平。
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1.2.5 免疫小鼠 取4～6周龄的雄性BALB/c小鼠，分5组，每组10只。免疫前5天小鼠胫前肌注射0.5%盐酸布比卡因，每侧50μl。免疫时，用75mg/kg戊巴比妥钠麻醉小鼠，将溶于PBS溶液中的DNA(浓度1mg/ml)注射于布比卡因处理后的胫前肌内。疫苗接种2周后，眼球后静脉采血，分离血清，置-20℃保存备用。具体分组与剂量如下:(1)为pc(-)+pcS 2 S(50+50)μg;(2)为pcS 2 S+pc-IIF(50+50)μg;(3)为pcS 2 S+pc-IL-2(50+50)μg;(4)为pcS 2 S+pc(-)IFN-γ(50+50)μg;(5)为pcS 2 S+pc(-)IFN-γ+pc-IL-2(50+25+25)μg。另有阴性参照3只，注射无质粒的PBS。
1.2.6 小鼠血清HBsAg及抗HBs的检测 参照科华公司的立可读试剂盒说明书进行。
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1.2.7 统计学方法 采用两样本均数比较的t检验。
2 结果
2.1 质粒pc-IL-2和质粒pc-IFN-γ的酶切鉴定 重组质粒pc-IL-2和质粒pc-IFN-γ经酶切和测序证实目的基因大小和插入方向与设计相符，IL-2为462bp，IFN-γ为480bp(见图1、图2)。
2.2 ELISA法检测转染cos-7细胞上清液IL-2和IFN-γ的表达水平 检测结果见表1。(稀释10倍)
表1 ELISA法检测转染cos-7细胞上清液IL-2和IFN-γ的表达水平结果 (略)
检测结果表明，在转染48h的细胞上清中IL-2和IFN-γ的表达量分别为(635.4±66.7)和(790.4±92.1)pg/ml，而空载体和细胞上清对照未检测到IL-2和IFN-γ的表达。
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图1 pc-IFN-γ酶切电泳鉴定略
图2 pc-IL-2酶切电泳鉴定略
表2 不同基因佐剂诱导BALB/c小鼠血清抗-HBs的产生 (略)
3 讨论
为探讨两种细胞因子作为免疫佐剂的协同作用，在本研究中我们将两种细胞因子基因以单独、联合以及两者的基因融合的形式作为免疫佐剂与乙肝表面抗原疫苗pcS 2 S一起免疫小鼠，结果发现:(1)单独使用IL-2基因作为佐 剂，可明显提高HBV基因疫苗诱导小鼠产生的体液免疫应答，免疫后小鼠血清中抗HBs比单纯HBV基因疫苗免疫组有明显增高(P<0.05)，这个结果与先前的研究 [3，11] 吻合;(2)单独使用IFN-γ基因作为佐剂，剂量为50μg/只时，发现小鼠血清中抗HBs与单独HBV基因疫苗免疫组相比，反而有轻微下降，Bohm等人 [12] 也报道过类似的情况。这可能是在较大剂量时IFN-γ会抑制淋巴细胞(尤其是B细胞)的增殖反应，从而抑制免疫鼠的抗体分泌;(3)当IFN-γ与IL-2的剂量减半后(25μg+25μg/只)联合作为佐剂使用，与单纯HBV基因疫苗免疫组相比，可显著增强HBV基因疫苗诱导的小鼠体液免疫(P<0.01);与单独使用IL-2为佐剂组相比也具有差异性(P<0.05);(4)当使用hIL-2/IFN-γ融合蛋白基因质粒作为佐剂时，与单独HBV基因疫苗免疫组相比，同样可显著增强HBV基因疫苗诱导的小鼠体液免疫(P<0.05)。上述结果表明:(1)IL-2和适量的IFN-γ单独或联合作为佐剂均可增强HBV基因疫苗的免疫效果，其中以两种细胞因子联合作用效果最佳;(2)hIL-2/IFN-γ融合蛋白基因质粒和以IL-2和IFN-γ联合使用在提高HBV基因疫苗诱导的小鼠免疫应答方面表现出免疫协同作用，两者效果无明显差异，因此可采用hIL-2/IFN-γ融合蛋白基因质粒作为乙肝病毒基因疫苗的免疫佐剂，不仅可以提高HBV基因疫苗的免疫效果，同时也将简化质粒生产工艺和减少生产成本，为基因疫苗临床应用的可行性提供了依据。
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2 Roy MJ，Wu MS，Barr LJ，et al.Induction of antigen-specific CD8+T cells，Thelper cells，and protective levels of antibody in humans by parˉticle-mediated administration of a hepatitis B virus DNA vaccine.Vacˉcine，2000，22:19(7-8):764-778.
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3 ChowYH，Chiang BL，Lee YL，et al.Development ofTh1andTh2popuˉlations and the nature of immune responses to hepatitits B virus DNA vaccines can be modulated by codelivery of various cytokine genes.J Immnol，1998，1:160(3):1320-1329.
4 Kim JJ，Yang JS，VanCottTC，et al.Modulation of antigen-specific huˉmoral
responses in rhesus macaques by using cytokine cDNAs and DNA vaccine adjuvants.J Virol，2000，74(7):3427-3429.
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5 Pasquini S，Xiang Z，Wang Y，et al.Cytokines and costimulatory molecules as genetic adjuvants.Immunol Cell Biol，1997，75(4):397-401.
6 L Stevceva，AG Abimiku，G Franchini.Targeting the mucosa:genetically engineered vaccines and mucosal immune responses.Genes and Immuˉnityl，2000，308-315:Review.
7 Kim JJ，Yang JS，Manson KH，et al.Modulation of antigen-specific celˉlular immune responses to DNA vaccination in rhesus macaques through the use of IL-2，IFN-gamma，or IL-4gene adjuvants.Vaccine，2001，21;19(17-19):2496-2505.
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8 Geissler M，Gesien A，Tokushige K，et al.Enhancement of cellular and humoral immune responses to hepatitis C virus core protein using DNA-based vaccines augmented with cytokine-expressing plasmids.J Imˉmunol，1997，158(3):1231-1237.
9 Chen G，Chen H，Guo H，Zheng H.Protective effect of DNA-mediated immunization with a combination of SAGI and IL-2gene adjuvant aˉgainst infection of Toxoplasma gondii in mice.Chin Med J(Engl)，2002，115(10):1448-1452.
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10 何晓嫱，陈光明，黄英，等.治疗型双质粒HBV-NDA疫苗的构建及其鉴定.解放军医学杂志，2003，28(6):493-497.
11 Chow YH，Huang WL，Chi WK，et al.Improvement of hepatitis B virus DNA vaccines by plasmids coexpressing hepatitis B surface antigen and interleukin-2.J Virol，1997，71(1):169-178.
12 Bohm W，Kuhrober A，Paier T，et al.DNA vector constructs that prine hepatitis B surface antigen-specific cytotoxic T lymphocyte and antiˉbody responses in mice after intramuscular injection.J Immunol Methˉods，1996，14，193(1):29-40.
作者单位:1 510602广州华南理工大学食品与生物工程学院
2 空军广州医院肝病研究所免疫生化室
(编辑 秋实), 百拇医药(姬晓南)