细菌电转化效率若干影响因素探讨
【摘要】 目的 探讨细菌吸光度值(A值)、细菌冻存时间对细菌电转化效率的影响。方法 制备5批不同A值的大肠杆菌XL1-Blue，将噬菌粒pComb3HSS经电穿孔方法转化到XL1-Blue中，测定其转化效率，探讨细菌A值及贮存时间对电转化效率的影响。结果 在A值0.71～0.95范围内，细菌A值越低，电转化效率越高，细菌A值与电转化效率呈显著负相关(r=-0.9101，P<0.05)。细菌贮存时间越长，电转化效率越低。但在半年内仍能达到较高转化率。结论 要达到高转化率，应将细菌A值控制在其对数生长期A值的下限水平。细菌贮存半年内，仍能达到较高的转化效率。贮存1年，仍能满足一般转化需要。
关键词 电转化 大肠埃希氏菌 影响因素
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)11-1619-02
Exploration of factors affecting the efficiency of
, 百拇医药
electroporation for Escherichia coli
Chen Min，Hu Jianlin
Department of Biochemistry and Molecular Biology，Third Military Medical University，Chongqing 400038.
【Abstract】 Objective To explore factors affecting the efficiency of electroporation for Escherichia Coli.Methods Five batches of Escherichia Coli.XL1-Blue with different absorbance were prepared.The phagemids pComb3HSS were transformed into XL1-Blue by electroporation.The efficiency of electroporations were deter
, 百拇医药
mined.The influence of bacterial absorbance and storage duration to the efficiency of electroporations were studied.Results When the bacterial absorbance was between0.71and0.95，the lower the bacterial absorbance，the higher the efficienˉcy of electroporation was.The bacterial absorbance and the efficiency of electrop oration was negative correlated signifiˉcantly(r=-0.9101，P<0.05).The longer the storage duration，the lower the efficiency of electroporation was.Conˉclusion The bacterial absorbance should be controlled to the low limitation of logarithm growth period in order to reach higher efficiency of electroporation.The efficiency of electroporation is still higher when the bacterium is stored in six months.
, 百拇医药
Key words electroporation escherichia coli phagemid
将DNA有效导入细菌，是分子生物学基本技术之一。氯化钙转化法可使每微克超螺旋质粒DNA获得10 6 ～10 7 个转化子，足以满足各种质粒常规克隆的需要 [1] 。但构建cDNA文库、随机多肽文库及噬菌体抗体库需要更高的转化效率。由转化(Electro-transformation)可使细菌转化效率达到10 9～10 10 转化子/μg闭环DNA [1] ，基本上可满足构建上述各种文库的需要。然而，影响细菌电转化效率的因素较多，只有控制好影响因素，才能达到高转化效率。本文初步探讨细菌的吸光度(A)值、细菌冻存时间等因素对细菌转化效率的影响。
1 材料和方法
, http://www.100md.com
1.1 菌株、试剂及仪器 大肠杆菌菌株XL1-Blue为Stratagene公司产品，噬菌粒pComb3HSS由美国Scripps研究所惠赠，胰蛋白胨和酵母提取物为Oxoid公司产品，吗啉代丙烷磺酸(MOPS)为Gibco公司产品，分析纯丙三醇为北京化工厂产品。SB(Super Broth)培养基:30g/L胰蛋白胨，20g/L酵母提取物，10g/L MOPS，pH7.0。电穿孔仪为Bio-Rad公司生产的Gene Pulser。722型光栅分光光度计为上海 第三分析仪器厂生产。
1.2 电转化细菌的制备 (1)将细菌XL1-Blue接种于LB培养基平板上(含四环素40mg/L)，37℃培养18h。(2)从平板上取单个菌落接种于10ml含同样抗生素的SB培养基中，37℃振荡过夜。(3)取过夜培养的细菌2.5ml，接种于500ml SB培养基中，并加入200g/L葡萄糖溶液10ml和1mol/L的MgCl 2 5ml，37℃振荡培养3～4h，检测菌液OD 600 值。(4)将细菌冰浴15min，2700g，4℃离心20min，弃上清。(5)用冰预冷的100ml/L丙三醇(甘油)洗细菌3次，最后1次离心弃上清时保留少量丙三醇，使细菌和丙三醇总体积为2.5～3ml。(6)利用离心管内少量丙三醇重新悬浮细菌，并以每份40μl或300μl分装于EP管中，液氮速冻5min，随后储存于-70℃待用。
, 百拇医药
1.3 菌电穿孔转化效率测定 取电穿孔细菌40μl，与pComb3HSS50pg混合，加入0.1cm电穿孔杯中，冰上放置1min。在电压1.25kV、电阻200Ω、电容2μF条件下进行电击后，立即用37℃预热的SOC培养基3ml洗出电穿孔杯中的细菌，37℃振荡培养1h。随后进行适当稀释，取适量细菌铺于含氨苄青霉素(0.1g/L)的LB培养基平板上。37℃培养18h后，进行菌落计数，并计算出转化率。
1.4 统计学方法 对细菌A值及贮存时间与电转化效率之间进行直线相关性检验。
2 结果
2.1 细菌A值对电转化效率的影响 制备了5批不同A值的电转化细菌，A值为0.71～0.95，细菌A值越低，电转化效率越高(表1)。细菌A值与电转化效率呈显著负相关(r=-0.9101，P<0.05)。
表1 不同A 600 值细菌的电转化效率略
, http://www.100md.com
2.2 细菌贮存时间长短对电转化效率的影响 制备的电穿孔细菌贮存于-70℃。对同一批细菌在不同贮存时间测得的电转化效率见表2。
表1 不同贮存时间细菌的电转化效率略
3 讨论
将外源基因导入受体细胞的常用的方法分氯化钙法、脂质体转染法和电穿孔法。尽管前两种方法能够达到较高的转化效率，可以满足各种质粒常规克隆的需要 [1] ，然而，cDNA文库、随机多肽文库及噬菌体抗体库的构建需要更高的转化效率。电穿孔法是利用高压电脉冲作用于受体细胞，使细胞表面产生暂时性的孔隙，从而将DNA、RNA、蛋白 质等多种生物分子或颗粒导入胞内的方法。利用电穿孔法将质粒及噬菌粒DNA转化到大肠杆菌中，转化效率可高达10 9 ～10 10 cfu/μg，基本上可满足构建上述各种文库的需要。然而，电转化效率受诸多因素影响，如感受态细菌的浓度、电场强度、脉冲时间等因素均可影响电转化效率 [2～4] 。本研究对感受态大肠杆菌的吸光度值及贮存时间对电转化效率影响进行了探讨。
, http://www.100md.com
本文采用的细菌XL1-Blue对数生长中期A值为0.7～0.8。实验结果表明，将细菌A 600 值控制在其对数生长中期A 600 值范围内，细菌电转化效率变化不大，但要达到最高转化效率，需将A 600 值控制在下限水平。本研究在制备电转化细菌过程中还发现，细菌生长至接近对数生长中期时，A值变化非常迅速，需每5～10min监测一次A 600 ，以保证细菌A值控制在对数生长中期A值范围内。若操作不熟练或因其它原因使培养时间延长，细菌A值会迅速增高而使电转化效率下降。在处理达到对数生长期的细菌时，将细菌从摇床移入冰水浴时一定要快，避免细菌继续繁殖。
本文结果还表明，随着细菌贮存时间的延长，电转化效率逐渐下降，因此，构建各种DNA文库，感受态细菌贮存时间不宜太长。但结果也提示，细菌贮存半年内，电转化效率下降不足一次方，即仍能达到较高的转化效率。细菌贮存1年后，电转化效率虽明显下降，但仍能达到氯化钙转化法所达到的转化效率，可以满足质粒噬菌粒DNA常规转化的需要。因此，在有电穿孔设备的实验室，可以一次大量制备电转化细菌，贮存于-70℃，用于DNA常规转化，可使用1年以上，这无疑给DNA的转化工作带来很大的方便。
, http://www.100md.com
参考文献
1 卢圣栋.现代分子生物学实验技术.第二版.北京:中国协和医科大学出版社，1999，278.
2 李南，凌世淦，吴梧桐.电穿孔法转化大肠杆菌TG1的条件优化.药物生物技术，2001，8(3):143-146.
3 赵禹，侯秉璋，乔玲.电转化技术在噬菌体抗体库构建中的应用.天津医科大学学报，2002，8(4):413-415.
4 张建琼，张雪萍，谢维.高效电转化率条件的探索.南京师大学报，2000，23(2):72-74.
作者单位:1 400038第三军医大学生物化学与分子生物学教研室
2 400038第三军医大学第一附属医院呼吸科
(编辑 秋实), 百拇医药(陈敏)
关键词 电转化 大肠埃希氏菌 影响因素
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)11-1619-02
Exploration of factors affecting the efficiency of
, 百拇医药
electroporation for Escherichia coli
Chen Min，Hu Jianlin
Department of Biochemistry and Molecular Biology，Third Military Medical University，Chongqing 400038.
【Abstract】 Objective To explore factors affecting the efficiency of electroporation for Escherichia Coli.Methods Five batches of Escherichia Coli.XL1-Blue with different absorbance were prepared.The phagemids pComb3HSS were transformed into XL1-Blue by electroporation.The efficiency of electroporations were deter
, 百拇医药
mined.The influence of bacterial absorbance and storage duration to the efficiency of electroporations were studied.Results When the bacterial absorbance was between0.71and0.95，the lower the bacterial absorbance，the higher the efficienˉcy of electroporation was.The bacterial absorbance and the efficiency of electrop oration was negative correlated signifiˉcantly(r=-0.9101，P<0.05).The longer the storage duration，the lower the efficiency of electroporation was.Conˉclusion The bacterial absorbance should be controlled to the low limitation of logarithm growth period in order to reach higher efficiency of electroporation.The efficiency of electroporation is still higher when the bacterium is stored in six months.
, 百拇医药
Key words electroporation escherichia coli phagemid
将DNA有效导入细菌，是分子生物学基本技术之一。氯化钙转化法可使每微克超螺旋质粒DNA获得10 6 ～10 7 个转化子，足以满足各种质粒常规克隆的需要 [1] 。但构建cDNA文库、随机多肽文库及噬菌体抗体库需要更高的转化效率。由转化(Electro-transformation)可使细菌转化效率达到10 9～10 10 转化子/μg闭环DNA [1] ，基本上可满足构建上述各种文库的需要。然而，影响细菌电转化效率的因素较多，只有控制好影响因素，才能达到高转化效率。本文初步探讨细菌的吸光度(A)值、细菌冻存时间等因素对细菌转化效率的影响。
1 材料和方法
, http://www.100md.com
1.1 菌株、试剂及仪器 大肠杆菌菌株XL1-Blue为Stratagene公司产品，噬菌粒pComb3HSS由美国Scripps研究所惠赠，胰蛋白胨和酵母提取物为Oxoid公司产品，吗啉代丙烷磺酸(MOPS)为Gibco公司产品，分析纯丙三醇为北京化工厂产品。SB(Super Broth)培养基:30g/L胰蛋白胨，20g/L酵母提取物，10g/L MOPS，pH7.0。电穿孔仪为Bio-Rad公司生产的Gene Pulser。722型光栅分光光度计为上海 第三分析仪器厂生产。
1.2 电转化细菌的制备 (1)将细菌XL1-Blue接种于LB培养基平板上(含四环素40mg/L)，37℃培养18h。(2)从平板上取单个菌落接种于10ml含同样抗生素的SB培养基中，37℃振荡过夜。(3)取过夜培养的细菌2.5ml，接种于500ml SB培养基中，并加入200g/L葡萄糖溶液10ml和1mol/L的MgCl 2 5ml，37℃振荡培养3～4h，检测菌液OD 600 值。(4)将细菌冰浴15min，2700g，4℃离心20min，弃上清。(5)用冰预冷的100ml/L丙三醇(甘油)洗细菌3次，最后1次离心弃上清时保留少量丙三醇，使细菌和丙三醇总体积为2.5～3ml。(6)利用离心管内少量丙三醇重新悬浮细菌，并以每份40μl或300μl分装于EP管中，液氮速冻5min，随后储存于-70℃待用。
, 百拇医药
1.3 菌电穿孔转化效率测定 取电穿孔细菌40μl，与pComb3HSS50pg混合，加入0.1cm电穿孔杯中，冰上放置1min。在电压1.25kV、电阻200Ω、电容2μF条件下进行电击后，立即用37℃预热的SOC培养基3ml洗出电穿孔杯中的细菌，37℃振荡培养1h。随后进行适当稀释，取适量细菌铺于含氨苄青霉素(0.1g/L)的LB培养基平板上。37℃培养18h后，进行菌落计数，并计算出转化率。
1.4 统计学方法 对细菌A值及贮存时间与电转化效率之间进行直线相关性检验。
2 结果
2.1 细菌A值对电转化效率的影响 制备了5批不同A值的电转化细菌，A值为0.71～0.95，细菌A值越低，电转化效率越高(表1)。细菌A值与电转化效率呈显著负相关(r=-0.9101，P<0.05)。
表1 不同A 600 值细菌的电转化效率略
, http://www.100md.com
2.2 细菌贮存时间长短对电转化效率的影响 制备的电穿孔细菌贮存于-70℃。对同一批细菌在不同贮存时间测得的电转化效率见表2。
表1 不同贮存时间细菌的电转化效率略
3 讨论
将外源基因导入受体细胞的常用的方法分氯化钙法、脂质体转染法和电穿孔法。尽管前两种方法能够达到较高的转化效率，可以满足各种质粒常规克隆的需要 [1] ，然而，cDNA文库、随机多肽文库及噬菌体抗体库的构建需要更高的转化效率。电穿孔法是利用高压电脉冲作用于受体细胞，使细胞表面产生暂时性的孔隙，从而将DNA、RNA、蛋白 质等多种生物分子或颗粒导入胞内的方法。利用电穿孔法将质粒及噬菌粒DNA转化到大肠杆菌中，转化效率可高达10 9 ～10 10 cfu/μg，基本上可满足构建上述各种文库的需要。然而，电转化效率受诸多因素影响，如感受态细菌的浓度、电场强度、脉冲时间等因素均可影响电转化效率 [2～4] 。本研究对感受态大肠杆菌的吸光度值及贮存时间对电转化效率影响进行了探讨。
, http://www.100md.com
本文采用的细菌XL1-Blue对数生长中期A值为0.7～0.8。实验结果表明，将细菌A 600 值控制在其对数生长中期A 600 值范围内，细菌电转化效率变化不大，但要达到最高转化效率，需将A 600 值控制在下限水平。本研究在制备电转化细菌过程中还发现，细菌生长至接近对数生长中期时，A值变化非常迅速，需每5～10min监测一次A 600 ，以保证细菌A值控制在对数生长中期A值范围内。若操作不熟练或因其它原因使培养时间延长，细菌A值会迅速增高而使电转化效率下降。在处理达到对数生长期的细菌时，将细菌从摇床移入冰水浴时一定要快，避免细菌继续繁殖。
本文结果还表明，随着细菌贮存时间的延长，电转化效率逐渐下降，因此，构建各种DNA文库，感受态细菌贮存时间不宜太长。但结果也提示，细菌贮存半年内，电转化效率下降不足一次方，即仍能达到较高的转化效率。细菌贮存1年后，电转化效率虽明显下降，但仍能达到氯化钙转化法所达到的转化效率，可以满足质粒噬菌粒DNA常规转化的需要。因此，在有电穿孔设备的实验室，可以一次大量制备电转化细菌，贮存于-70℃，用于DNA常规转化，可使用1年以上，这无疑给DNA的转化工作带来很大的方便。
, http://www.100md.com
参考文献
1 卢圣栋.现代分子生物学实验技术.第二版.北京:中国协和医科大学出版社，1999，278.
2 李南，凌世淦，吴梧桐.电穿孔法转化大肠杆菌TG1的条件优化.药物生物技术，2001，8(3):143-146.
3 赵禹，侯秉璋，乔玲.电转化技术在噬菌体抗体库构建中的应用.天津医科大学学报，2002，8(4):413-415.
4 张建琼，张雪萍，谢维.高效电转化率条件的探索.南京师大学报，2000，23(2):72-74.
作者单位:1 400038第三军医大学生物化学与分子生物学教研室
2 400038第三军医大学第一附属医院呼吸科
(编辑 秋实), 百拇医药(陈敏)