中国汉族人群细胞色素P450酶CYP2C19基因多态性分析
【摘要】 目的 研究中国汉族人群CYP2C19基因多态性分布情况。方法 104例无血缘关系的健康志愿者参加本研究，其中男53例，女51例，年龄21～26岁，平均23岁。用PCR-RFLP法进行分析。结果 弱代谢型共15例(14.42%)，其中m1/m1型12例(11.54%);m1/m2型3例(2.88%)，m2/m2型未检出;强代谢型共89例(85.58%)，其中外显子5及外显子4均为wt/wt型者37例，占35.58%;wt/m1型38例，占36.53%;wt/m2型8例，占7.69%;wt/m1+wt/m2型6例，占5.77%。由此，wt的等位基因频率为0.6058，m1的为0.3333，m2的为0.0686。结论 我国汉族人群中，弱代谢型频率为14.42%，其中m1型突变占多数，与报道的亚洲人比例一致，低于白色人种。PCR-RFLP检测手段是行之有效的方法。
关键词 汉族CYP2C19 基因多态性 PCR-RFLP
【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2003)15-1355-04
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Genetic polymorphism analysis of cytochrome P4502C19
in a Chinese Han population
Niu Chunyan，Luo Jinyan
Department of Gastroenterology，The Second Hospital of Xi’an Jiaotong University，Xi’an710004.
【Abstract】 Objective To assess the genotype pattern distribution of cytochrome P4502C19in a Chinese Han population.Methods One hundred and four unrelated，healthy Chinese Han population subjects(53malesand51feˉmales，aged from21to26)were genotyped for CYP2C19according to a genotyping technique to identify the wild-type(wt)gene and two mutatins，CYP2C19 m1 in exon5and CYP2C19 m2 in exon4by PCR-RFLP.Results The frequenˉcy of poor metabollizers by the genotyping analysis was14.42%(15of the104subjects)，consisting of12homozygous for CYP2C19 m1(m1/m1)，3heterozygous for the defects(m1/m2)，there was no homozygous forCYP2C19 m2 (m2/m2)being found.The frequency of extensive metablizers was85.58%(89of the104subjects)，consisting of37(35.58%)homozygous for CYP2C19 wt (wt/wt)in both exon4and exon5，38(36.53%)heterozygous for CYP2C19 wt and CYP2C19 m1 ，8(7.69%)heterozygous for CYP2C19 wt and CYP2C19 m2 and6heterozygous for both CYP2C19 wt /CYP2C19 m1 and CYP2C19 wt /CYP2C19 m2 .Thus the frequency of the CYP2C19 m1 allele was0.3333，the CYP2C19 m2 allele was0.0686，and the frequency of the CYP2C19 wt was0.6058.Conclusion The frequency of poor metabolizers in Chinese is14.42%，whereas the frequency of extensive metabolizers is85.58%，CYP2C19 m1 was the majority in two mutations and frequency of the CYP2C19 m1 allele is about five times than that of mutant allele CYP2C19 m2 .Theseresults are consistent with the exhibited reports.
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Key words Han population CYP2C19 genetic polymorphism PCR-RFLP
随着药物研发的飞速发展，新药不断问世。由于许多药物在肝内代谢，因而研究肝药酶对内源、外源性化合物在体内的Ⅰ相生物转化作用，在药效学、药动学以及不良反应中有着重要意义，尤其对预测疗效、药物-药物间相互作用，指导临床合理用药有着非同寻常的意义。
已有的研究表明，S-美芬妥英4’羟化酶(S-MP，后来证实为CYP2C19)代谢表型呈现遗传多态性 [1] ，表现为强代谢型和弱代谢型。这种弱代谢基因型及表型的多态性受常染色体隐性遗传调控，而且存在显著的种族间和个体间差异 [2，3] 。与S-MP4’羟化酶代谢缺陷有关的基因突变最主要有二:CYP2C19m1(外显子5中单碱基突变)及CYP2C19m2(外显子4中单碱基突变)。因此，研究不同民族及不同人群的CYP2C19基因多态性具有非常重要的临床意义。
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迄今为止有关中国汉族人群CYP2C19基因多态性的研究报道很少。本研究用PCR-RFLP方法研究陕西地区健康汉族人群CYP2C19的分布情况并与其他地区及民族比较，旨在通过了解CYP2C19基因多态性，根据病人的条件筛选药物、实现临床给药方案个体化，包括给药剂量、给药间隔时间、给药途径及剂型选择等，从而使患者的治疗效果得到更进一步的优化和提高。
1 对象及方法
1.1 对象 104例无血缘关系的健康志愿者，均为陕西籍在校学生及健康献血员，其中男53例，女51例，年龄21～35岁，平均26岁，无严重疾病史，经体格检查及常规检查均未见异常。
1.2 研究方法
1.2.1 试剂来源 Taq DNA聚合酶、10xPCR buffer、25mM MgCl 2 、DNA分子量标准物pUC19DNA/MspⅠ(HpaⅡ)Marker均为MBI产品;基因组DNA提取试剂盒、10mMdNTPs为Songon生物公司产品;DNA凝胶回收试剂盒为杭州维特洁生物公司产品;Bam HI、SmaⅠ内切酶及其缓冲液均为宝生物工程(大连)公司提供，其余试剂为分析纯。
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1.2.2 引物设计及合成 根据CYP2C19等位基因内含子4和内含子5碱基序列以及内含子5和内显子6分别设计外显子4和外显子5的特异性引物，由Songon生物公司合成。外显子4的引物为:上游(5’-CACCCTGTGATCCˉCACTTTC-3’)，下游(5’-CTAATGGGCTTAGAAGCCTG-3’)，外显子5的引物为:上游(5’-CAACCAGAGCTTGˉGCATATTG-3’)，下游(5’-CACAAATACGCAAGCAGTCAC-3’)。
1.2.3 基因组DNA提取 取外周静脉血5ml。在500μl血液中加入1ml无菌双蒸水，5000r/min，室温离心2min，去上清，用200μl TE悬浮白细胞;加入400μl Cell Lysis Solution混匀，再加入3μl Proteinase K混匀，55℃水浴1h以上，其间上下混匀几次;加入600μl氯仿轻轻混匀;10000r/min室温离心2min，取500μl上层清液，移至无菌1.5ml离心管中;加入500μl Precipitation Solution混匀，室温放置2min，10000r/min，离心2min;吸去上清，立即加入100μl1.2mol/LNaCl，轻轻震荡直至DNA样品完全溶解，加入3μl RNase A，置于37℃10min，去除RNA;加入300μl预冷无水乙醇，-20℃放置10min，0000r/min，离心3～4min，倒掉乙醇，用70%乙醇洗涤1次，倒置室温干燥10min，DNA用100μl TE溶解，-20℃贮存备用。
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1.2.4 仪器 PTC-150型PCR仪由美国MJ RESEARCH，INC公司生产，JM-250型电泳仪由大连捷迈科贸有限公司生产。
1.2.5 PCR-RFLP(polymerase chain reaction-restriction fragˉment length polymorphism，多聚酶链反应-限制性片段长度多态性)分析 (1)PCR扩增:以下列组分组成100μl反应体系:无菌去离子水68μl，10mMdNTPs2μl，10xPCR buffer10μl，25mMMgCl 2 6μl，上、下游引物各2μl，DNA模型10μl，Taq poly DNAase0.5μl。外显子4的扩增条件为:94℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸1min;外显子5的扩增条件为:94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min。其中预变性5min，末次延伸10min，共35个循环;PCR产物上样5μl，在1%琼脂糖凝胶中50V电压电泳1h后在紫外灯下观察结果。(2)DNA琼脂糖凝胶回收:PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳后，在紫外灯下将目的条带切下，用试剂盒回收DNA。(3)RFLP分析:用限制性内切酶对目的片段进行消化，外显子4的酶切反应体系为:Bam HI1μl，10x K buffer2μl，无菌去离子水7μl，DNA10μl;外显子5的酶切反应体系为:Sma I1μl，10x T buffer2μl，0.1%BSA2μl，无菌去离子水5μl，DNA10μl。37℃水浴过夜，酶切产物用1.5%琼脂糖凝胶(溴化乙啶染色)电泳，300nm紫外线灯下观察带型，并将所得结果与文献报道的其它地区、种族人群P4502C19基因分布特点进行比较。
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1.3 统计方法 表型频率和基因频率采用基因计数法计算。正常人群进行Hardy-Weinberg遗传平衡定律的检验。民族之间的比较用X 2 检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 PCR-RFLP结果 见图1。预计外显子5大小为284bp，因突变发生在SmaⅠ的酶切位点，经SmaⅠ消化后， 显示3种带型，野生型有二个片段:171bp及113bp，杂合子型的3个片段为284bp、151bp和113bp，突变型纯合子为284bp的单一条带。条带的左侧均为DNA Marker。预计外显子4大小为375bp，因突变发生在Bam HI的酶切位点，经Bam HI消化后，野生型可被切成二个分别为224bp及151bp的二个片段，野生型/突变型杂合子显示3个片段;375bp、224bp及151bp。图1 PCR-RFLP分析结果
2.2 104名汉族健康志愿者CYP2C19表型及基因频率的分布 见表1。表1 104名陕西健康汉族志愿者CYP2C19表型及基因频率分析
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2.3 104名陕西地区健康汉族人CYP2C19表型及基因频率的分布与其他地区及民族的比较见表2。由表可见CYP2C19的分布与其他地区汉族比较，差异无显著性;与其他地区少数民族比较，有不同，但无统计学差异。表2 104名陕西汉族健康志愿者CYP2C19表型及基因频率与其他地区比较 注:陕西地区汉族与其他地区汉族比较，P>0.05;与民族比较，P>0.053 讨论人类细胞色素P450(CYP450s)是存在于肝脏微粒体混合功能氧化酶系(mixed function oxidase system，MFOS)的主要成分，是一组由许多同工酶组成的超基因大家族。CYP2C家族参与95%的Ⅰ相生物转化。CYP2C19主要存在于肝微粒体内，基因定位于10号染色体上-10q24.1-24.3。其化学本质是分子质量在46～60KDa的结构和性质相似而又不尽相同的一族蛋白质，是由血红蛋白超家族基因编码的细胞色素P450酶系中的一种同工酶。CYP2C19是CYP2C亚族中含量最少的，但它在药物代谢中具有很重要的作用。1984年Wedlund等发现S-MP的羟化代谢存在遗传多态现象 [4] ，1987年发现其参与多种药物的代谢[1] :美芬妥英、安定、苯巴比妥、普耐洛尔、奥美拉唑、氯胍以及兰索拉唑、泮妥拉唑等。1993年Wrighton等将他们从人肝脏中分离出的这种酶命名为CY2C19 [5] 。
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S-MP羟化代谢主要由单基因CYP2C19编码表达的CYP2C19酶蛋白介导。研究表明，大多数个体能迅速进行S-MP的4’-羟化代谢，称为强代谢型(extensive metabolizer，EM，包括纯合子EM及杂合子EM)此羟化作用具有立体选择性，少数个体出现羟化代谢障碍，称为弱代谢型(poor metabolizer，PM)。S-MP的4’-羟化能力减弱由对S-美芬妥英具高亲和力的细胞色素P450酶系活性部分或完全缺乏或失活所致，亦即CYP2C19存在基因多态性，受常染色体隐性遗传调控，存在个体间及种族间差异。1994年，de Morais等在日本S-MP慢代谢人群中发现了两个等位基因的突变位点，分别命名为CYP2C19m1(外显子5突变型)和CYP2C19m2(外显子4突变型) [2，3] 。CYP2C19m1和CYP2C19m2是两个互相独立的突变型等位基因，其终产物无催化活性，因此就失去了对美芬妥英及其他物质的羟化代谢能力。CYP2C19基因多态性的分子机制为:CYP2C19m1由外显子5上681位碱基G→A发生单碱基突变，使转录产物mRNA成熟时的剪接位点发生改变，外显子5前40个碱基对缺乏，此缺乏包含1个SmaⅠ限制性酶切位点。这一变化导致215- 227位氨基酸缺乏，并使始于215位氨基酸的阅读框架发生移位，因此，在215位氨基酸下游第20个氨基酸处提前产生一个终止密码子，结果使这一截短的含234个氨基酸的蛋白质缺乏血红素的结合区，催化活性降低或丧失。CYP2C19m2由外显子4上636位碱基G→A单碱基突变，使212位原来编码色氨酸的密码子变为终止密码子，从而只产生CYP2C19前4个外显子的编码产物，仅211个氨基酸组成的无活性蛋白质。
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研究CYP2C19基因型的意义在于:(1)纯合子EM(野生型/野生型)代谢作用最强，药物在体内被快速代谢，影响疗效;(2)杂合子EM(野生型/突变型)代谢作用次之;(3)PM(突变型/突变型)代谢作用弱，药物在体内代谢慢，虽不影响药物疗效，但易引起药物蓄积，导致不良反应。一般来说，弱代谢型个体，无论从遗传学角度还是药物诱导方面看，其血药浓度均明显高于强代谢型，因此，在接受同样的标准剂量药物时，发生浓度依赖性副作用的危险性就会增加;另一方面，强代谢型个体在标准剂量治疗时则不易达到起效的血药浓度甚至治疗失败。另外，以CYP2C19为主要代谢酶的药物之间可产生相互作用，而且易受其他药物的诱导或抑制。因此基因型是影响药物疗效的个体间差异、不良反应的直接因素。当CYP2C19为某种药物的主要代谢酶时，不同基因型患者的药代学、药动学参数将受到不同的影响。也就是说，同一种治疗剂量的药物在不同个体会产生不同的疗效和副作用。近年研究还发现，CYP2C19参与质子泵抑制剂(奥美拉唑、兰索拉唑、泮托拉唑)的羟化代谢，质子泵抑制剂在酸相关疾病中的临床疗效个体差异、对Hp的清除甚至某些对质子泵抑制剂耐药的酸相关疾病等均与CYP2C19密切相关 [6～8] 。CYP2C19酶活性除了与药物代谢有关外，研究还发现与肿瘤(食管癌、肺癌、膀胱癌)发生相关。
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既往研究表明，东方人CYP2C19弱代谢型的频率(13%～23%)明显高于白色人种(3%～5%)，日本人群为18.86%，黑人介于白种人和东方人之间 [9] 。研究东方人群CYP2C19基因多态性与药代动力学的关系在临床治疗中比白色人种更有意义。本研究结果，37例(35.58%)为外显子4和外显子5共同的野生型等位基因纯合子;wt/m1型杂合子38例(36.53%)，wt/m2型杂合子8例(7.69%)，wt/m1+wt/m2联合型杂合子6例(5.77%)，野生型/突变型杂合子共52例(50%);m1/m1型纯合子12例(11.54%)，m1/m2型杂合子3例(2.88%)，m2/m2型纯合子未检出，野生型/野生型纯合子及杂合子共15例(14.42%)。其中野生型/突变型中，以wt/m1型最多，而野生型/野生型突变中，也以m1/m1型最多，远高于m1/m2型的比例，提示中国汉族人群中m1型突变是最主要的突变，与国内报道的一致，高于白色人种 [3] 。本文的结果，陕西地区健康汉族人群wt的等位基因频率为0.6058，m1的为0.3333，m2的为0.0686，m1等位基因频率几乎为m2的5倍。由基因频率的比较可看出，中国各地区汉族之间的CYP2C19基因多态性比较接近，差异无显著性;与少数民族比较有所不同 [10] ，但未达到统计学差异，分析其原因除了民族的遗传背景、文化差异之外，可能还与生活地区特点以及一些后天因素如饮食习惯、吸烟、同时应用其他药物等有关。
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我国是一个多民族国家，研究不同民族及不同人群的CYP2C19基因型具有非常重要的临床意义。目前，在已获得某些药物代谢酶的遗传信息基础上，测定基因型作为监测治疗药物的一种方法已在世界范围内广泛应用。在临床治疗过程中，当预测药物代谢、不良反应以及决定药物配伍、选择剂量、判定疗效、维持剂量、使用安全性时，均应考虑到基因型与代谢表型的关系，这样，疗效的个体间差异可通过根据基因型和代谢表型调整剂量而得到弥补 [11] 。分析基因型的方法很多，如PCR-RFLP、单链核酸多态性、双标记抗体法、循环核酸法等，而PCR-RFLP作为检测基因型的手段简便易行，具有很高的敏感性和特异性，与药物代谢表型分析结果有很高的符合率，是一项行之有效的方法。
参考文献
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10 张惠文，陈盛强.健康汉族人细胞色素P4502C19基因的检测.现代临床医学生物工程学杂志，2002，8(4):261-262.
11 Weide JVD，Steijan LSW.Review article:Cytochrom P450enzyme:geˉnetic polymorphisms and impact on clinical pharmacology.Ann Clin Biochem，1999，36:722-729.
作者单位:710004西安交通大学第二医院消化科
(编辑罗 彬), http://www.100md.com(牛春燕 罗金燕)
关键词 汉族CYP2C19 基因多态性 PCR-RFLP
【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2003)15-1355-04
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Genetic polymorphism analysis of cytochrome P4502C19
in a Chinese Han population
Niu Chunyan，Luo Jinyan
Department of Gastroenterology，The Second Hospital of Xi’an Jiaotong University，Xi’an710004.
【Abstract】 Objective To assess the genotype pattern distribution of cytochrome P4502C19in a Chinese Han population.Methods One hundred and four unrelated，healthy Chinese Han population subjects(53malesand51feˉmales，aged from21to26)were genotyped for CYP2C19according to a genotyping technique to identify the wild-type(wt)gene and two mutatins，CYP2C19 m1 in exon5and CYP2C19 m2 in exon4by PCR-RFLP.Results The frequenˉcy of poor metabollizers by the genotyping analysis was14.42%(15of the104subjects)，consisting of12homozygous for CYP2C19 m1(m1/m1)，3heterozygous for the defects(m1/m2)，there was no homozygous forCYP2C19 m2 (m2/m2)being found.The frequency of extensive metablizers was85.58%(89of the104subjects)，consisting of37(35.58%)homozygous for CYP2C19 wt (wt/wt)in both exon4and exon5，38(36.53%)heterozygous for CYP2C19 wt and CYP2C19 m1 ，8(7.69%)heterozygous for CYP2C19 wt and CYP2C19 m2 and6heterozygous for both CYP2C19 wt /CYP2C19 m1 and CYP2C19 wt /CYP2C19 m2 .Thus the frequency of the CYP2C19 m1 allele was0.3333，the CYP2C19 m2 allele was0.0686，and the frequency of the CYP2C19 wt was0.6058.Conclusion The frequency of poor metabolizers in Chinese is14.42%，whereas the frequency of extensive metabolizers is85.58%，CYP2C19 m1 was the majority in two mutations and frequency of the CYP2C19 m1 allele is about five times than that of mutant allele CYP2C19 m2 .Theseresults are consistent with the exhibited reports.
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Key words Han population CYP2C19 genetic polymorphism PCR-RFLP
随着药物研发的飞速发展，新药不断问世。由于许多药物在肝内代谢，因而研究肝药酶对内源、外源性化合物在体内的Ⅰ相生物转化作用，在药效学、药动学以及不良反应中有着重要意义，尤其对预测疗效、药物-药物间相互作用，指导临床合理用药有着非同寻常的意义。
已有的研究表明，S-美芬妥英4’羟化酶(S-MP，后来证实为CYP2C19)代谢表型呈现遗传多态性 [1] ，表现为强代谢型和弱代谢型。这种弱代谢基因型及表型的多态性受常染色体隐性遗传调控，而且存在显著的种族间和个体间差异 [2，3] 。与S-MP4’羟化酶代谢缺陷有关的基因突变最主要有二:CYP2C19m1(外显子5中单碱基突变)及CYP2C19m2(外显子4中单碱基突变)。因此，研究不同民族及不同人群的CYP2C19基因多态性具有非常重要的临床意义。
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迄今为止有关中国汉族人群CYP2C19基因多态性的研究报道很少。本研究用PCR-RFLP方法研究陕西地区健康汉族人群CYP2C19的分布情况并与其他地区及民族比较，旨在通过了解CYP2C19基因多态性，根据病人的条件筛选药物、实现临床给药方案个体化，包括给药剂量、给药间隔时间、给药途径及剂型选择等，从而使患者的治疗效果得到更进一步的优化和提高。
1 对象及方法
1.1 对象 104例无血缘关系的健康志愿者，均为陕西籍在校学生及健康献血员，其中男53例，女51例，年龄21～35岁，平均26岁，无严重疾病史，经体格检查及常规检查均未见异常。
1.2 研究方法
1.2.1 试剂来源 Taq DNA聚合酶、10xPCR buffer、25mM MgCl 2 、DNA分子量标准物pUC19DNA/MspⅠ(HpaⅡ)Marker均为MBI产品;基因组DNA提取试剂盒、10mMdNTPs为Songon生物公司产品;DNA凝胶回收试剂盒为杭州维特洁生物公司产品;Bam HI、SmaⅠ内切酶及其缓冲液均为宝生物工程(大连)公司提供，其余试剂为分析纯。
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1.2.2 引物设计及合成 根据CYP2C19等位基因内含子4和内含子5碱基序列以及内含子5和内显子6分别设计外显子4和外显子5的特异性引物，由Songon生物公司合成。外显子4的引物为:上游(5’-CACCCTGTGATCCˉCACTTTC-3’)，下游(5’-CTAATGGGCTTAGAAGCCTG-3’)，外显子5的引物为:上游(5’-CAACCAGAGCTTGˉGCATATTG-3’)，下游(5’-CACAAATACGCAAGCAGTCAC-3’)。
1.2.3 基因组DNA提取 取外周静脉血5ml。在500μl血液中加入1ml无菌双蒸水，5000r/min，室温离心2min，去上清，用200μl TE悬浮白细胞;加入400μl Cell Lysis Solution混匀，再加入3μl Proteinase K混匀，55℃水浴1h以上，其间上下混匀几次;加入600μl氯仿轻轻混匀;10000r/min室温离心2min，取500μl上层清液，移至无菌1.5ml离心管中;加入500μl Precipitation Solution混匀，室温放置2min，10000r/min，离心2min;吸去上清，立即加入100μl1.2mol/LNaCl，轻轻震荡直至DNA样品完全溶解，加入3μl RNase A，置于37℃10min，去除RNA;加入300μl预冷无水乙醇，-20℃放置10min，0000r/min，离心3～4min，倒掉乙醇，用70%乙醇洗涤1次，倒置室温干燥10min，DNA用100μl TE溶解，-20℃贮存备用。
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1.2.4 仪器 PTC-150型PCR仪由美国MJ RESEARCH，INC公司生产，JM-250型电泳仪由大连捷迈科贸有限公司生产。
1.2.5 PCR-RFLP(polymerase chain reaction-restriction fragˉment length polymorphism，多聚酶链反应-限制性片段长度多态性)分析 (1)PCR扩增:以下列组分组成100μl反应体系:无菌去离子水68μl，10mMdNTPs2μl，10xPCR buffer10μl，25mMMgCl 2 6μl，上、下游引物各2μl，DNA模型10μl，Taq poly DNAase0.5μl。外显子4的扩增条件为:94℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸1min;外显子5的扩增条件为:94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min。其中预变性5min，末次延伸10min，共35个循环;PCR产物上样5μl，在1%琼脂糖凝胶中50V电压电泳1h后在紫外灯下观察结果。(2)DNA琼脂糖凝胶回收:PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳后，在紫外灯下将目的条带切下，用试剂盒回收DNA。(3)RFLP分析:用限制性内切酶对目的片段进行消化，外显子4的酶切反应体系为:Bam HI1μl，10x K buffer2μl，无菌去离子水7μl，DNA10μl;外显子5的酶切反应体系为:Sma I1μl，10x T buffer2μl，0.1%BSA2μl，无菌去离子水5μl，DNA10μl。37℃水浴过夜，酶切产物用1.5%琼脂糖凝胶(溴化乙啶染色)电泳，300nm紫外线灯下观察带型，并将所得结果与文献报道的其它地区、种族人群P4502C19基因分布特点进行比较。
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1.3 统计方法 表型频率和基因频率采用基因计数法计算。正常人群进行Hardy-Weinberg遗传平衡定律的检验。民族之间的比较用X 2 检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 PCR-RFLP结果 见图1。预计外显子5大小为284bp，因突变发生在SmaⅠ的酶切位点，经SmaⅠ消化后， 显示3种带型，野生型有二个片段:171bp及113bp，杂合子型的3个片段为284bp、151bp和113bp，突变型纯合子为284bp的单一条带。条带的左侧均为DNA Marker。预计外显子4大小为375bp，因突变发生在Bam HI的酶切位点，经Bam HI消化后，野生型可被切成二个分别为224bp及151bp的二个片段，野生型/突变型杂合子显示3个片段;375bp、224bp及151bp。图1 PCR-RFLP分析结果
2.2 104名汉族健康志愿者CYP2C19表型及基因频率的分布 见表1。表1 104名陕西健康汉族志愿者CYP2C19表型及基因频率分析
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2.3 104名陕西地区健康汉族人CYP2C19表型及基因频率的分布与其他地区及民族的比较见表2。由表可见CYP2C19的分布与其他地区汉族比较，差异无显著性;与其他地区少数民族比较，有不同，但无统计学差异。表2 104名陕西汉族健康志愿者CYP2C19表型及基因频率与其他地区比较 注:陕西地区汉族与其他地区汉族比较，P>0.05;与民族比较，P>0.053 讨论人类细胞色素P450(CYP450s)是存在于肝脏微粒体混合功能氧化酶系(mixed function oxidase system，MFOS)的主要成分，是一组由许多同工酶组成的超基因大家族。CYP2C家族参与95%的Ⅰ相生物转化。CYP2C19主要存在于肝微粒体内，基因定位于10号染色体上-10q24.1-24.3。其化学本质是分子质量在46～60KDa的结构和性质相似而又不尽相同的一族蛋白质，是由血红蛋白超家族基因编码的细胞色素P450酶系中的一种同工酶。CYP2C19是CYP2C亚族中含量最少的，但它在药物代谢中具有很重要的作用。1984年Wedlund等发现S-MP的羟化代谢存在遗传多态现象 [4] ，1987年发现其参与多种药物的代谢[1] :美芬妥英、安定、苯巴比妥、普耐洛尔、奥美拉唑、氯胍以及兰索拉唑、泮妥拉唑等。1993年Wrighton等将他们从人肝脏中分离出的这种酶命名为CY2C19 [5] 。
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S-MP羟化代谢主要由单基因CYP2C19编码表达的CYP2C19酶蛋白介导。研究表明，大多数个体能迅速进行S-MP的4’-羟化代谢，称为强代谢型(extensive metabolizer，EM，包括纯合子EM及杂合子EM)此羟化作用具有立体选择性，少数个体出现羟化代谢障碍，称为弱代谢型(poor metabolizer，PM)。S-MP的4’-羟化能力减弱由对S-美芬妥英具高亲和力的细胞色素P450酶系活性部分或完全缺乏或失活所致，亦即CYP2C19存在基因多态性，受常染色体隐性遗传调控，存在个体间及种族间差异。1994年，de Morais等在日本S-MP慢代谢人群中发现了两个等位基因的突变位点，分别命名为CYP2C19m1(外显子5突变型)和CYP2C19m2(外显子4突变型) [2，3] 。CYP2C19m1和CYP2C19m2是两个互相独立的突变型等位基因，其终产物无催化活性，因此就失去了对美芬妥英及其他物质的羟化代谢能力。CYP2C19基因多态性的分子机制为:CYP2C19m1由外显子5上681位碱基G→A发生单碱基突变，使转录产物mRNA成熟时的剪接位点发生改变，外显子5前40个碱基对缺乏，此缺乏包含1个SmaⅠ限制性酶切位点。这一变化导致215- 227位氨基酸缺乏，并使始于215位氨基酸的阅读框架发生移位，因此，在215位氨基酸下游第20个氨基酸处提前产生一个终止密码子，结果使这一截短的含234个氨基酸的蛋白质缺乏血红素的结合区，催化活性降低或丧失。CYP2C19m2由外显子4上636位碱基G→A单碱基突变，使212位原来编码色氨酸的密码子变为终止密码子，从而只产生CYP2C19前4个外显子的编码产物，仅211个氨基酸组成的无活性蛋白质。
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研究CYP2C19基因型的意义在于:(1)纯合子EM(野生型/野生型)代谢作用最强，药物在体内被快速代谢，影响疗效;(2)杂合子EM(野生型/突变型)代谢作用次之;(3)PM(突变型/突变型)代谢作用弱，药物在体内代谢慢，虽不影响药物疗效，但易引起药物蓄积，导致不良反应。一般来说，弱代谢型个体，无论从遗传学角度还是药物诱导方面看，其血药浓度均明显高于强代谢型，因此，在接受同样的标准剂量药物时，发生浓度依赖性副作用的危险性就会增加;另一方面，强代谢型个体在标准剂量治疗时则不易达到起效的血药浓度甚至治疗失败。另外，以CYP2C19为主要代谢酶的药物之间可产生相互作用，而且易受其他药物的诱导或抑制。因此基因型是影响药物疗效的个体间差异、不良反应的直接因素。当CYP2C19为某种药物的主要代谢酶时，不同基因型患者的药代学、药动学参数将受到不同的影响。也就是说，同一种治疗剂量的药物在不同个体会产生不同的疗效和副作用。近年研究还发现，CYP2C19参与质子泵抑制剂(奥美拉唑、兰索拉唑、泮托拉唑)的羟化代谢，质子泵抑制剂在酸相关疾病中的临床疗效个体差异、对Hp的清除甚至某些对质子泵抑制剂耐药的酸相关疾病等均与CYP2C19密切相关 [6～8] 。CYP2C19酶活性除了与药物代谢有关外，研究还发现与肿瘤(食管癌、肺癌、膀胱癌)发生相关。
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既往研究表明，东方人CYP2C19弱代谢型的频率(13%～23%)明显高于白色人种(3%～5%)，日本人群为18.86%，黑人介于白种人和东方人之间 [9] 。研究东方人群CYP2C19基因多态性与药代动力学的关系在临床治疗中比白色人种更有意义。本研究结果，37例(35.58%)为外显子4和外显子5共同的野生型等位基因纯合子;wt/m1型杂合子38例(36.53%)，wt/m2型杂合子8例(7.69%)，wt/m1+wt/m2联合型杂合子6例(5.77%)，野生型/突变型杂合子共52例(50%);m1/m1型纯合子12例(11.54%)，m1/m2型杂合子3例(2.88%)，m2/m2型纯合子未检出，野生型/野生型纯合子及杂合子共15例(14.42%)。其中野生型/突变型中，以wt/m1型最多，而野生型/野生型突变中，也以m1/m1型最多，远高于m1/m2型的比例，提示中国汉族人群中m1型突变是最主要的突变，与国内报道的一致，高于白色人种 [3] 。本文的结果，陕西地区健康汉族人群wt的等位基因频率为0.6058，m1的为0.3333，m2的为0.0686，m1等位基因频率几乎为m2的5倍。由基因频率的比较可看出，中国各地区汉族之间的CYP2C19基因多态性比较接近，差异无显著性;与少数民族比较有所不同 [10] ，但未达到统计学差异，分析其原因除了民族的遗传背景、文化差异之外，可能还与生活地区特点以及一些后天因素如饮食习惯、吸烟、同时应用其他药物等有关。
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我国是一个多民族国家，研究不同民族及不同人群的CYP2C19基因型具有非常重要的临床意义。目前，在已获得某些药物代谢酶的遗传信息基础上，测定基因型作为监测治疗药物的一种方法已在世界范围内广泛应用。在临床治疗过程中，当预测药物代谢、不良反应以及决定药物配伍、选择剂量、判定疗效、维持剂量、使用安全性时，均应考虑到基因型与代谢表型的关系，这样，疗效的个体间差异可通过根据基因型和代谢表型调整剂量而得到弥补 [11] 。分析基因型的方法很多，如PCR-RFLP、单链核酸多态性、双标记抗体法、循环核酸法等，而PCR-RFLP作为检测基因型的手段简便易行，具有很高的敏感性和特异性，与药物代谢表型分析结果有很高的符合率，是一项行之有效的方法。
参考文献
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2 de Morais SMF.Wilkinson GR，Blaisdell J.Nakamura K，Meyer UA，Goldstein JA.The major genetic defectresponsible for the polymorphism of S-mephenytoin in humans.J Biol Chem，1994，269:15419-15422.
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4 Wedlund PJ，Aslanian WS，McAllister CB，et al.Frenquency of mephenytoin hydroxylation deficiency in a Caucasian population:Idepenˉdence from debrisoquinehydroxylation deficiency.Clin Pharmacol Ther，1984，36(6):773.
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10 张惠文，陈盛强.健康汉族人细胞色素P4502C19基因的检测.现代临床医学生物工程学杂志，2002，8(4):261-262.
11 Weide JVD，Steijan LSW.Review article:Cytochrom P450enzyme:geˉnetic polymorphisms and impact on clinical pharmacology.Ann Clin Biochem，1999，36:722-729.
作者单位:710004西安交通大学第二医院消化科
(编辑罗 彬), http://www.100md.com(牛春燕 罗金燕)