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编号:10399935
雷公藤中多糖的提取和含量测定
http://www.100md.com 《中华医药杂志》 2003年第1期
     【文献标识码】 B 【文章编号】 1680-077X(2003)01-0039-03

    雷公藤Tripterygium wilfordii Hook.f.系卫矛科雷公藤,属木质藤本植物。其化学成分复杂,主要为生物碱类、萜类及糖类 [1] 。药理研究发现,雷公藤具有活血化瘀,降低血液粘度、抗炎、抗肿瘤、抗生育等作用,还能提高人体免疫力[1] 。但同时具有较大的毒副作用,影响了它的临床应用。 多糖是一类高效低毒,并具有广泛生物活性的一类高分子化合物,为了提高其临床应用的安全性,我们对其中的多糖进行了提取和含量测定,为进一步开发利用奠定了基础。

    1 仪器与药品

    1.1 仪器 UV-752型分光光度计(上海第三分析仪器厂);GOA-型电热真空干燥箱(天津市东郊机械加工厂);RE-52A型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)。
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    1.2 药品 葡萄糖:AR,105℃干燥恒重,所用其它试剂均为分析纯;中药雷公藤购于张家口市药材公司,并按照2000年药典进行鉴定,符合标准,实验前于硅胶干燥器中干燥2天。

    2 方法与结果

    2.1 葡萄糖标准贮备液的制备 精密称取干燥恒重的葡萄糖标准品100mg,溶解并定容100ml,则其浓度为1mg/ml。将其浓度稀释100倍即为对照品溶液。

    2.2 苯酚液的配制 称取苯酚100g,于烧瓶中,加入0.1g铝片,0.05g碳酸氢钠,加热蒸馏,收集182℃馏分10g,加蒸馏水190g溶解,置于棕色瓶中备用。

    2.3 测定条件的选择

    2.3.1 反应温度选择 精密吸取葡萄糖贮备液1.0ml于100ml容量瓶中,用水稀释到刻度,为对照品溶液。分别吸取对照品液1.0ml于两个有塞试管中,各加苯酚液1.0ml,并分别迅速滴加浓硫酸5.0ml。另取两个试管各加1.0ml水同上操作,为空白液。一份于水浴中煮沸15min,另一份于40℃水浴中恒温0.5h。取出,冷却至室温,15min后于490nm处测其吸光度值,分别为0.112和0.126。因此,本实验采用40℃恒温0.5h的方法。
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    2.3.2 苯酚及硫酸用量选择 苯酚-硫酸比色法测定多糖的原理,是多糖被浓硫酸水合产生的高温迅速水解成单糖,该单糖在强酸性条件下,与苯酚反应生成橙色衍生物。它在490nm处有最大吸收,其吸光度与浓度呈线性关系。我们分别改变苯酚和硫酸用量,目的在于寻找合适的比例。吸取对照品液1.0ml5份,分别加入苯酚液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml,分别加水至2.0ml,再各滴加浓硫酸5.0ml,40℃恒温0.5h后,测其吸光度值,分别为0.095、0.112、0.125、0.127、0.126,可见加入苯酚液0.6ml以上时,反应都能完成;另取对照品液1.0ml5份,分别加苯酚液1.0ml,再分别滴加浓硫酸2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml,并均用水稀释至8.0ml,加入硫酸体积占总体积的62.5%以上时的结果较满意。见表1。表1 不同硫酸用量时对测定结果的影响

    2.3.3 反应时间选择及稳定性 取对照品液1.0ml3份,各加苯酚液1.0ml,浓硫酸5.0ml,于40℃分别恒温20、30、40min。测得吸光度分别为0.116、0.125、0.126,可见加热0.5h即可使反应完全;另测反应完成后样品在不同时间内的吸光度值,结果3h内吸收稳定。
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    2.4 标准曲线制备 精密吸取标准贮备液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0ml均定容100ml,分别取1.0ml,各加入苯酚液1.0ml,迅速滴加浓硫酸5.0ml(硫酸占总体积71.4%),另以1.0ml 水同上操作,作为空白液。于40℃水浴中恒温0.5h,取出,冷却15min后,于490nm处测其吸光度值,分别为0.046、0.125、0.24、0.38、0.51,得回归方程A=0.01312C-0.01534,r=0.9995。

    实验表明,在糖含量5~40μg范围内,吸光度与糖浓度呈现良好的线性关系。

    2.5 精密度试验 精密吸取对照溶液1.0ml,10份,同2.4操作,结果RSD=1.22%。

    2.6 多糖的提取与精制 称取雷公藤100g,用95%乙醇回流提取40min,除去脂溶性成分和色素等,残渣用1500ml水煮沸1h,过滤,残渣再用1200ml水煮沸40min,过滤,合并提取液,用旋转蒸发器减压浓缩至200ml,用Seveg法除去蛋白,然后分成4份,加入乙醇,使醇含量分别为70%、75%、80%、85%,静置过夜,抽滤,沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤,得精制多糖,真空干燥后称重。各定容1000ml,再稀释100倍,各取1.0ml按2.4操作,测其吸光度,根据标准曲线求含量。结果见表2。表2 不同醇浓度时多糖得率和含量
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    2.7 换算因子测定 准确称取精制多糖10mg,用水定容500ml,吸取1.0ml按2.4操作,根据标准曲线计算多糖含量,然后按下式计算换算因子f:f=W C·D W:多糖重(mg),C:多糖浓度(μg/ml);D:稀释因素,得f=2.10,见表3。 表3 换算因子测定

    2.8 样品液制备 准确称取中药粉末50mg,3份,分别置于索氏提取器中,用95%乙醇回流提取1h后,第一份加150ml水煮沸1h,第二份先加100ml水,煮沸1h,过滤,残渣再用50ml水煮沸40min,第三份分别加80、40、40ml水煮3次,分别1.0、0.5、0.5h,三份均定容100ml,备用。

    2.9 样品含量测定 分别精密吸取上述样品液10ml,稀释至100ml,各取1.0ml按2.4操作,并按下式计算多糖含量含量(%)=C·D·f W ×100%式中W:样品重(mg),C:多糖浓度(μg/ml),D:稀释因素,f:换算因子,并按生药计算多糖含量,结果表明提取两次即可。见表4。表4 不同提取次数样品含量
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    2.10 回收率实验 精密吸取0.5ml样品液,6份,分别加入不同量的对照品液,使其总体积为1.0ml,以下按2.4操作,测得平均回收率为100.5%,结果见表5。表5 回收率实验

    3 讨论

    苯酚-硫酸比色法是测定多糖含量较为经典有效的方法之一,但在报道中对反应温度的控制、试剂中苯酚及硫酸用量不尽相同。常见的反应温度有煮沸、40℃恒温和室温 三种,鉴于冬天和夏天室温相差较大,本实验仅对前两种条件进行了比较,证实以40℃恒温0.5h较好。加入苯酚量在0.5ml以上时,均能使反应完全,因此,在配制苯酚液时,不妨免去蒸馏一步。对于硫酸用量,结果是硫酸占总体积62.5%时,在重现性、稳定性及回收率方面都有明显的优越性,并且与文献报道一致 [2]

    关于多糖的干燥,许多文献都是采用真空干燥和冷冻干燥,我们发现在真空干燥器中加入P 2 O 5 或固体NaOH等干燥剂,同时保持高真空度,可提高干燥效率。然而也有文献报道用60℃烘干 [3,4] 。我们经过多次实验证实,多糖的干燥不能加热,也不能室温下缓慢干燥,否则会使多糖变成难溶的角质块状物。
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    参考文献

    1 李秀才.雷公藤的研究与临床应用.中国中药杂志,1997,22(1):53.

    2 董群,郑丽伊,方积年.改良的苯酚-硫酸法测定总糖和寡糖的研究.中国药学杂志,1996,31(9):550.

    3 刘媛,薛慧中,杨文革,等.玉米须多糖的提取及含量测定.南京中医药大学学报,1999,15(2):90.

    4 何云庆,李荣芷.不同产地灵芝中多糖含量测定.中国中药杂志,1997,22(2):83.

    (收稿日期:2002-06-22)

    作者单位:075000河北省张家口医学院

    (编辑一 坤), 百拇医药(刘晓河)


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