SARS患者早期外周血T淋巴细胞亚群的变化
【摘要】 目的 研究严重急性呼吸综合征患者早期外周血T淋巴细胞亚群的变化。方法 采用流式细胞术与血细胞分析仪结合的双平台检测方法进行绝对计数，比较SARS患者、疑似患者和正常人外周血T淋巴细胞亚群。结果 SARS患者在病程早期外周血中淋巴细胞总数、CD3 + 、CD4 + 及CD8 + T淋巴细胞，均较正常人明显下降，P<0.05。而疑似组与正常对照组差异无显著性。结论 SARS患者在病程早期外周血淋巴细胞及各亚群均受到破坏，CD3 + 、CD4 + 及CD8 + T淋巴细胞计数可以作为辅助诊断标准之一。
关键词 严重急性呼吸综合征 T淋巴细胞亚群 流式细胞仪
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)11-1651-03
The changes of T-lymphocyte subsets in peripheral
, 百拇医药
blood of patients with SARS
Wei Yongxiang，Cai Zhen，Yang Ling，et al.
Beijing Tongren Hospital Affiliated to Capital Medical University，Beijing 100730.
【Abstract】 Objective To study the changes of different sub-set of T lymphocytes in the peripheral blood of the Severe Acute Respiratory Syndrome(SARS)patients.Methods The blood samples came from three set:the SARS patients group，the suspected group and the healthy persons group.All the samples were analyzed with the Flow Cytomˉetry and Blood Corpuscle Analysis Apparatus to determine the quantities of different T lymphocytes’sub-set，and then the results of the patients were compared with those of the suspected and the healthy persons.Results The total lymphocytes，CD3 + T lymphocytes，CD4 + T lymphocytes and CD8 + T lymphocytes in the peripheral blood of the SARS patients were all lower than those of the healthy persons in early proceeding.As contrast，there were no differences beˉtween samples of the suspected and the healthy persons.Conclusion The total lymphocytes，CD3 + T lymphocytes，CD4 + T lymphocytes and CD8 + T lymphocytes in the peripheral blood of the SARS patients were destroyed in early proceeding，so the quantities of these cells could be used as one adjuvant criterion for diagnosis.
, 百拇医药
Key words SARS T-lymphocyte subset flow cytometry
严重急性呼吸综合征(Severe acute respiratory syndrome，SARS)是去冬今春流行于亚洲、北美和欧洲的呼吸道烈性传染病，死亡率很高。随发病例的增加，由最初WHO公布的3%[1] 上升到15%以上 [2]。在中国大陆确证病人共5327例，死亡病例348例，病死率6.5%[3] 。4月16日，WHO确认引起非典型肺炎的病原体是冠状病毒的一个变种，目前全世界针对SARS防治的研究工作正在紧张的进行。我院在SARS流行期间，也收治了数十例病人，现将一些数据总结归纳如下。
1 资料与方法
1.1 研究对象及分组 4月27日～5月13日因发热来我院就诊，以疑似SARS收治的病例23例，其中根据卫生部颁发的《传染性非典型肺炎临床诊断标准(试行)》确诊12例，男9例(其中1例合并有2型糖尿病)，女3例，年龄18～49岁，平均31.3岁。疑似11例，男6例，女5例，年龄17～40岁，平均29.8岁，其中有5例因入院1～2天即转院未能明确诊断，其它6例诊断为普通肺炎。另采集年龄、性别匹配的12例体检者血样作为正常对照。
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1.2 标本采集方法 患者血样均于入院次日清晨采集，所有血样均用EDTA真空采血管(BD公司)采集静脉血2ml，室温下放置，于采血后6h内标记，24h内上机检测。
1.3 CD3、CD4、CD8计数方法 采用流式细胞术与血细胞分析仪相结合的双平台计数方法。(1)用日本SYSMEX血细胞分析仪计数采集血样中总白细胞(WBC)数量和各分类白细胞百分比;(2)FACScalibur流式细胞仪测定(美国Becˉton-Dickinson公司)CD3、CD4、CD8T淋巴细胞百分比:每一试管中加入FITC-CD4/PE-CD8/PE-Cy5.5-CD3(CALTˉAG产品)三色试剂5μl，然后加入待测血样100μl，振荡混匀，室温避光孵育20min后，每管加入BD公司1xFACS裂解液1ml裂解红细胞，然后离心、清洗，置避光处待测。
1.4 统计学方法 用SPSS11.0软件包，采用独立样本t检验方法。
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2 结果
正常人、疑似患者和确诊病人外周血白细胞数、淋巴细胞数以及CD3 + 、CD4 + 和CD8 + T淋巴细胞数总结于表1。对于外周血总白细胞数量虽然三组比较未见明显差异，但在SARS组中4例WBC<4×10 9 /L，占33.3%，3例>10×10 9 /L，占25%;疑似组中WBC<4×10 9 /L者1例，>10×10 9 /L者3例;而正常对照组均在4×10 9 ～10×10 9 /L之间。
T淋巴细胞亚群分析，SARS患者外周血中淋巴细胞数及各亚群绝对计数均明显降低，与正常对照组相比，差异有显著性，P<0.05。疑似组与正常对照组和SARS组比较差异无显著性。各组CD3 + 、CD4 + 和CD8 + T淋巴细胞均数比较见图1。统计各组中CD4T淋巴细胞数据，SARS组中 CD4<400/μl6例，占50%，其中4例低于200/μl;疑似组中CD4<400/μl2例;正常对照组CD4均高于400/μl。
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表1 三组血样中白细胞总数、淋巴细胞数及T细胞各亚群绝对计数结果略
图1 略
3 讨论
2003年4月广州SARS防治组首席专家钟南山院士总结广州呼吸病研究所2003年1～3月诊治的83例较重的SARS患者的临床情况，发现这些患者外周血中CD4 + 和CD8 + T淋巴细胞计数都明显降低，一些重症患者CD4细胞 计数甚至低于艾滋病患者，而治愈的SARS患者与死亡患者的CD4和CD8细胞计数差异也有显著性。这提示检测患者CD4和CD8细胞计数可能对于辅助诊断和判断患者的预后有帮助。来自多伦多的报告 [4] 得出相似的结论，北京协和医院李太生教授在其《106例病例总结》也发布了类似研究结果，指出98%的SARS病人CD4 + T细胞数量在急性期显著减少，且早于胸片的改变。
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本研究于病人入院次日、激素干预之前采集了收治的SARS患者血样，并将最终确诊和非确诊病例分为两组，分别与正常对照组作了比较，也得到相似的结论。证实了SARS患者早期外周血淋巴细胞数、CD3 + 、CD4 + 和CD8 + T淋巴细胞细胞计数较正常对照组明显降低。但疑似组与SARS组及正常对照组差异无显著性。SARS组中1例CD4 + T淋巴细胞低于64/μl，为一20岁的男性患者，入院体温40℃，发热5日收入院，胸片可见双侧肺下部阴影，伴有呼吸急促，临床症状较为危重。另1例CD4 + T淋巴细胞104/μl的患者合并有2型糖尿病。虽然例数太少，不足以得出结论，但提示CD4 + T淋巴细胞下降程度与病情严重程度及合并疾病有一定关系。疑似组与正常对照及SARS组比较，其T细胞亚群绝对数下降虽没有统计学差异，但从三组CD3、CD4和CD8均数比较图中可以看到还是有一定程度的减低。疑似组包括有部分由于转院时尚处于观察阶段则未能明确诊断的疑似病例，和后来明确为细菌感染肺炎的病例。未明确诊断病例由于患者转院而未能对其临床资料进一步追踪，不能排除确诊为SARS的可能性，而细菌性肺炎则表现为炎症血象。故该组所得数据比较离散，级差较大。
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上述研究虽然都证明了SARS病毒感染后很快CD4 + 和CD8 + T淋巴细胞就下降，但原因仍不清楚。淋巴细胞是免疫系统的核心成分。作为机体保护自身的防御性结构的免疫系统，主要功能有:(1)识别和清除侵入机体的微生物、异体细胞或大分子物质(抗原)，使人体免于病毒、细菌、污染物质及疾病的攻击;(2)监护机体内部的稳定性，清除表面抗原发生变化的细胞(肿瘤细胞和病毒感染的细胞等)。很多疾病都是由于机体免疫系统受损发生或加剧，T淋巴细胞在多种疾病的发生、发展过程中发挥着十分重要的作用。对于SARS来说，钟南山院士在6月5日中国工程院召开突发性疾病咨询小组第二次会议的总结道:在最初病毒复制过程中，免疫系统的CD4、CD8T细胞等早期下降就很明显。进入后期免疫系统全面遭到破坏，易产生大量的衣原体、支原体等继发性感染。那么是否SARS病毒会特异性地杀伤T淋巴细胞，摧毁人体免疫系统呢?是直接杀伤或是间接作用呢?这些问题都需要进一步研究来解决。
另一方面，免疫系统的CD4、CD8T细胞等早期下降这一现象也给临床的治疗原则提供了指导。在缺乏特异性治疗方法的情况下，着眼于增强机体免疫功能是一个积极的治疗措施。而且从发病年龄和死亡率来说，SARS发病多集中在青壮年，但死亡率老年人明显偏高，香港报道在60岁以上人群中甚至达到43.3% [2] 。大陆虽然没有这么高的死亡率，但也明显高于青壮年。这一方面与老年人群中合并有其他疾患的比率较高有关。另一方面机体免疫功能也应该是一个重要因素。老年人机体机能退化，免疫功能相对较差，T淋巴细胞再生能力下降。这也提示应用免疫调节剂或免疫促进剂或许能有助于SARS的治 疗，而免疫抑制作用的治疗方法则应当慎重使用。
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参考文献
1 Preliminary clinical description of severe acute respiratory syndrome.Puˉbished on March，21，2003on the MMWR website http://www.cdc.gov/mmwr.
2 Epidemiological determinants of spread of causal agent of severe acute respiratory syndrome in Hong Kong.The Lancet published online onMay7，2003http://image.thelancet.com/extras\03art4453web.pdf.
3 卫生部疾控中心网站.
4 Clinical features and short-term outcomes of144patients with SARS in the greater toronto area.JAMA，4，2003，21(289):1-9.
作者单位:100730首都医科大学附属北京同仁医院中心实验室
(编辑 曲全), 百拇医药(魏永祥)
关键词 严重急性呼吸综合征 T淋巴细胞亚群 流式细胞仪
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)11-1651-03
The changes of T-lymphocyte subsets in peripheral
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blood of patients with SARS
Wei Yongxiang，Cai Zhen，Yang Ling，et al.
Beijing Tongren Hospital Affiliated to Capital Medical University，Beijing 100730.
【Abstract】 Objective To study the changes of different sub-set of T lymphocytes in the peripheral blood of the Severe Acute Respiratory Syndrome(SARS)patients.Methods The blood samples came from three set:the SARS patients group，the suspected group and the healthy persons group.All the samples were analyzed with the Flow Cytomˉetry and Blood Corpuscle Analysis Apparatus to determine the quantities of different T lymphocytes’sub-set，and then the results of the patients were compared with those of the suspected and the healthy persons.Results The total lymphocytes，CD3 + T lymphocytes，CD4 + T lymphocytes and CD8 + T lymphocytes in the peripheral blood of the SARS patients were all lower than those of the healthy persons in early proceeding.As contrast，there were no differences beˉtween samples of the suspected and the healthy persons.Conclusion The total lymphocytes，CD3 + T lymphocytes，CD4 + T lymphocytes and CD8 + T lymphocytes in the peripheral blood of the SARS patients were destroyed in early proceeding，so the quantities of these cells could be used as one adjuvant criterion for diagnosis.
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Key words SARS T-lymphocyte subset flow cytometry
严重急性呼吸综合征(Severe acute respiratory syndrome，SARS)是去冬今春流行于亚洲、北美和欧洲的呼吸道烈性传染病，死亡率很高。随发病例的增加，由最初WHO公布的3%[1] 上升到15%以上 [2]。在中国大陆确证病人共5327例，死亡病例348例，病死率6.5%[3] 。4月16日，WHO确认引起非典型肺炎的病原体是冠状病毒的一个变种，目前全世界针对SARS防治的研究工作正在紧张的进行。我院在SARS流行期间，也收治了数十例病人，现将一些数据总结归纳如下。
1 资料与方法
1.1 研究对象及分组 4月27日～5月13日因发热来我院就诊，以疑似SARS收治的病例23例，其中根据卫生部颁发的《传染性非典型肺炎临床诊断标准(试行)》确诊12例，男9例(其中1例合并有2型糖尿病)，女3例，年龄18～49岁，平均31.3岁。疑似11例，男6例，女5例，年龄17～40岁，平均29.8岁，其中有5例因入院1～2天即转院未能明确诊断，其它6例诊断为普通肺炎。另采集年龄、性别匹配的12例体检者血样作为正常对照。
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1.2 标本采集方法 患者血样均于入院次日清晨采集，所有血样均用EDTA真空采血管(BD公司)采集静脉血2ml，室温下放置，于采血后6h内标记，24h内上机检测。
1.3 CD3、CD4、CD8计数方法 采用流式细胞术与血细胞分析仪相结合的双平台计数方法。(1)用日本SYSMEX血细胞分析仪计数采集血样中总白细胞(WBC)数量和各分类白细胞百分比;(2)FACScalibur流式细胞仪测定(美国Becˉton-Dickinson公司)CD3、CD4、CD8T淋巴细胞百分比:每一试管中加入FITC-CD4/PE-CD8/PE-Cy5.5-CD3(CALTˉAG产品)三色试剂5μl，然后加入待测血样100μl，振荡混匀，室温避光孵育20min后，每管加入BD公司1xFACS裂解液1ml裂解红细胞，然后离心、清洗，置避光处待测。
1.4 统计学方法 用SPSS11.0软件包，采用独立样本t检验方法。
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2 结果
正常人、疑似患者和确诊病人外周血白细胞数、淋巴细胞数以及CD3 + 、CD4 + 和CD8 + T淋巴细胞数总结于表1。对于外周血总白细胞数量虽然三组比较未见明显差异，但在SARS组中4例WBC<4×10 9 /L，占33.3%，3例>10×10 9 /L，占25%;疑似组中WBC<4×10 9 /L者1例，>10×10 9 /L者3例;而正常对照组均在4×10 9 ～10×10 9 /L之间。
T淋巴细胞亚群分析，SARS患者外周血中淋巴细胞数及各亚群绝对计数均明显降低，与正常对照组相比，差异有显著性，P<0.05。疑似组与正常对照组和SARS组比较差异无显著性。各组CD3 + 、CD4 + 和CD8 + T淋巴细胞均数比较见图1。统计各组中CD4T淋巴细胞数据，SARS组中 CD4<400/μl6例，占50%，其中4例低于200/μl;疑似组中CD4<400/μl2例;正常对照组CD4均高于400/μl。
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表1 三组血样中白细胞总数、淋巴细胞数及T细胞各亚群绝对计数结果略
图1 略
3 讨论
2003年4月广州SARS防治组首席专家钟南山院士总结广州呼吸病研究所2003年1～3月诊治的83例较重的SARS患者的临床情况，发现这些患者外周血中CD4 + 和CD8 + T淋巴细胞计数都明显降低，一些重症患者CD4细胞 计数甚至低于艾滋病患者，而治愈的SARS患者与死亡患者的CD4和CD8细胞计数差异也有显著性。这提示检测患者CD4和CD8细胞计数可能对于辅助诊断和判断患者的预后有帮助。来自多伦多的报告 [4] 得出相似的结论，北京协和医院李太生教授在其《106例病例总结》也发布了类似研究结果，指出98%的SARS病人CD4 + T细胞数量在急性期显著减少，且早于胸片的改变。
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本研究于病人入院次日、激素干预之前采集了收治的SARS患者血样，并将最终确诊和非确诊病例分为两组，分别与正常对照组作了比较，也得到相似的结论。证实了SARS患者早期外周血淋巴细胞数、CD3 + 、CD4 + 和CD8 + T淋巴细胞细胞计数较正常对照组明显降低。但疑似组与SARS组及正常对照组差异无显著性。SARS组中1例CD4 + T淋巴细胞低于64/μl，为一20岁的男性患者，入院体温40℃，发热5日收入院，胸片可见双侧肺下部阴影，伴有呼吸急促，临床症状较为危重。另1例CD4 + T淋巴细胞104/μl的患者合并有2型糖尿病。虽然例数太少，不足以得出结论，但提示CD4 + T淋巴细胞下降程度与病情严重程度及合并疾病有一定关系。疑似组与正常对照及SARS组比较，其T细胞亚群绝对数下降虽没有统计学差异，但从三组CD3、CD4和CD8均数比较图中可以看到还是有一定程度的减低。疑似组包括有部分由于转院时尚处于观察阶段则未能明确诊断的疑似病例，和后来明确为细菌感染肺炎的病例。未明确诊断病例由于患者转院而未能对其临床资料进一步追踪，不能排除确诊为SARS的可能性，而细菌性肺炎则表现为炎症血象。故该组所得数据比较离散，级差较大。
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上述研究虽然都证明了SARS病毒感染后很快CD4 + 和CD8 + T淋巴细胞就下降，但原因仍不清楚。淋巴细胞是免疫系统的核心成分。作为机体保护自身的防御性结构的免疫系统，主要功能有:(1)识别和清除侵入机体的微生物、异体细胞或大分子物质(抗原)，使人体免于病毒、细菌、污染物质及疾病的攻击;(2)监护机体内部的稳定性，清除表面抗原发生变化的细胞(肿瘤细胞和病毒感染的细胞等)。很多疾病都是由于机体免疫系统受损发生或加剧，T淋巴细胞在多种疾病的发生、发展过程中发挥着十分重要的作用。对于SARS来说，钟南山院士在6月5日中国工程院召开突发性疾病咨询小组第二次会议的总结道:在最初病毒复制过程中，免疫系统的CD4、CD8T细胞等早期下降就很明显。进入后期免疫系统全面遭到破坏，易产生大量的衣原体、支原体等继发性感染。那么是否SARS病毒会特异性地杀伤T淋巴细胞，摧毁人体免疫系统呢?是直接杀伤或是间接作用呢?这些问题都需要进一步研究来解决。
另一方面，免疫系统的CD4、CD8T细胞等早期下降这一现象也给临床的治疗原则提供了指导。在缺乏特异性治疗方法的情况下，着眼于增强机体免疫功能是一个积极的治疗措施。而且从发病年龄和死亡率来说，SARS发病多集中在青壮年，但死亡率老年人明显偏高，香港报道在60岁以上人群中甚至达到43.3% [2] 。大陆虽然没有这么高的死亡率，但也明显高于青壮年。这一方面与老年人群中合并有其他疾患的比率较高有关。另一方面机体免疫功能也应该是一个重要因素。老年人机体机能退化，免疫功能相对较差，T淋巴细胞再生能力下降。这也提示应用免疫调节剂或免疫促进剂或许能有助于SARS的治 疗，而免疫抑制作用的治疗方法则应当慎重使用。
, http://www.100md.com
参考文献
1 Preliminary clinical description of severe acute respiratory syndrome.Puˉbished on March，21，2003on the MMWR website http://www.cdc.gov/mmwr.
2 Epidemiological determinants of spread of causal agent of severe acute respiratory syndrome in Hong Kong.The Lancet published online onMay7，2003http://image.thelancet.com/extras\03art4453web.pdf.
3 卫生部疾控中心网站.
4 Clinical features and short-term outcomes of144patients with SARS in the greater toronto area.JAMA，4，2003，21(289):1-9.
作者单位:100730首都医科大学附属北京同仁医院中心实验室
(编辑 曲全), 百拇医药(魏永祥)