传染性非典型肺炎患者恢复期和痊愈后的病原学指标研究
【摘要】 目的 观察恢复期和痊愈出院复查的传染性非典型肺炎[严重急性呼吸综合征(SARS)]的病原学指标，比较用ELISA和间接免疫荧光法(IFA)检测不同时期抗SARS冠状病毒(coronavirus，CoV)抗体的结果。方法 研究对象来自四家SARS定点收治医院。采用ELISA和IFA方法分别检测351例血清标本，其中临床确诊SARS患者140例，部分病人有2～3份血清;从SARS病房撤离的医护人员154例。RT-PCR法检测恢复期和出院复查病例的粪便及漱口液标本20份。结果 (1)总阳性率:ELISA法IgM36%，IgG48.1%;IFA法IgM43.2%，IgG52.2%。而急性期IFA法IgM和IgG阳性率(17.2%和20%)明显高于ELISA(8.6%和5.7%)法;在痊愈复查的病例(发病60～90天)中除去SARS-CoV抗体全阴性者外，85%～90%IgG型抗体依然保持阳性，而IgM型抗体56%～70%阳性。(2)140例病例中抗-SARS CoV阳性(任何一份血、任何一次检测、任何一种方法出现阳性就计为阳性)113例(81%)，符合临床诊断。27例病程在30～90天的病例未检测到SARS CoV抗体。但冠状病毒RNA的检测发现，在27例中2例的粪便、3例的漱口液(标本采集时间在病程的6～26天)中阳性，其他病例则没有病原学指标支持SARS的临床诊断。(3)密切接触SARS患者的医护人员ELISA检测12例出现抗SARS-CoV抗体，而IFA方法则全部阴性。结论 (1)IFA方法可以比较早期的检测出病毒抗体。IgM阳性率始终较低，IgG抗体产生早，可以和IgM同时出现。(2)在临床诊断SARS的病例中将近1/5的病例病原学方面不支持SARS的诊断。临床的误诊一方面由于缺乏早期诊断手段，另一方面是特殊时期多种复杂因素造成的。(3)还没有证据表明在密切接触SARS病人的医务人员中有隐性感染者。
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关键词 传染性非典型肺炎 冠状病毒 酶联免疫法 间接免疫荧光法
【文献标识码】 A【文章编号】 1606-8106(2003)12-1777-03
Etiological research for convalescent and recovery patients with SARS
YanHuiping，Tan Yufen，Zhang Yonghong，et al.
Beijing Youan Hospital，Capital University of Medical Sciences，Beijing 100054.
【Abstract】 Objective To observe etiological markers of convalescent and recovery patients with severe acute respiratory syndrome(SARS).To compare positive rate for SARS-coronavirus(CoV)antibodies by ELISA and indiˉrect immunoflourescence assay(IFA).Methods 351sera coming from4hospitals were detected.140cases(197samples)of351were diagnosed clinically as SARS.154of351were doctors and nurses who had ever worked in the SARS wards.20samples of feces and mouth washings were tested by RT-PCR.Results (1)The total positive rate，by ELISA，was36%(71/197)for IgM and48.1%(96/197)for IgG;by IFA was43.2%(60/139)for IgM and52.2%(74/139)for IgG.In the acute stage of patient anti-SARS CoV by IFA was higher than that by ELISA(17.1%for IgM and20%for IgG vs8.6%and5.7%).In the convalescent and recovery patients(60～90days from onset)，85%～90%of them were still positive for IgG but only56～70%of them presented IgM antibody.(2)113of140cases(81%)can be found SARS-CoV antibodies who were consistent with clinical diagnosis.Unfortunately，27of140cases were not found any SARS-CoV antibodies in30～90days from onset but2of27in feces，3of27in mouth washings were found SARS coronavirus RNA.(3)Concerning those doctors and nurses，12of themwere found antibodˉies against SARS by ELISA，by all were negative by IFA.Conclusion About1/5patients who were diagnosed SARS clinically could not be supported by etiology.IgM antibody against SARS-CoV was always in lower level，meanwhile IgG against SARS-CoV appeared early.In early stage of the illness，using IFA to detect antibodies is a little better than using ELISA.
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Key words SARS coronavirus ELISA IFA
到目前为止，已经有不少报道对传染性非典型肺炎即严重急性呼吸综合征(SARS)的病原学、流行病学、临床学等各种特点做了描述 [1～3] 。但人类目前对它的认识还十分有限，例如在诊断方法和试剂，在诊断标准等方面还有许多等待研究解决的问题。本文主要针对恢复期和痊愈复查的SARS患者，对其病原学指标做了分析研究，报告如下。
1 材料和方法
1.1 研究对象 (1)351份血清标本，分为两种人群:①SARS临床诊断病例140例(197份标本)，分别来自北京佑安医院、北京宣武医院等四家非典型肺炎定点收治医院。②从SARS病房撤离的医护人员154例。(2)恢复期和痊愈复查病人漱口液、粪便标本20份。
1.2 实验方法 (1)采用两种方法检测抗-SARS冠状病毒(SARS-CoV)抗体:①间接免疫荧光法(IFA):由德国EUˉROIMMUN公司提供SARS-CoV感染的Vero E6细胞制成的细胞涂片，同时提供非感染细胞作为阴性对照。操作方法:首先将血清60℃灭活30min，移至生物安全柜内操作，在细胞玻片上滴加1∶10和1∶100稀释的待检测血清，室温孵育，充分洗片后再加FITC标记的抗体作用，甘油封片，荧光显微镜下观察结果，以感染细胞中出现特异性绿色颗粒状荧光为阳性。②酶联免疫法(ELISA):由华大吉比爱公司提供试剂盒，血清处理同IFA方法，按说明书操作。(2)RT-PCR方法检测患者粪便中SARS-CoV RNA，主要参考WHO推荐引物和Drosten [1] 等报告的方法，由中国科学院北方基因组P3实验室协助完成。
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2 结果
2.1 临床诊断病例中抗SARS-CoV抗体检测结果 对不同时期的血清标本，用两种方法进行了检测，总检出率见表1。在共同检测的139例中，ELISA和IFA的符合率为86%。急性期和恢复期患者(发病15天以内)血清中两种方法的检出率见表2。
表1 ELISA法和IFA法检测SARS病毒抗体的总检出率略
表2 急性期和恢复、痊愈患者SARS病毒抗体的检出率(略)
从急性期血清检测结果可见，对早期患者，IFA方法检测抗-SARS病毒抗体更具有优越性(例数较少未做统计学处理)。IFA方法检测SARS IgG抗体阳性时，可表现特异性的荧光模式。
观察各期SARS患者，IgM阳性率始终较低，IgG抗体产生早，急性期患者中4例是与IgM同时检出;在痊愈复查的病例(发病60～90天)中除去SARS-CoV抗体全阴性者外，85%～90%IgG型抗体依然保持阳性，而IgM型抗体56%～70%阳性。本研究中，如果以任何一份血清标本、任何一种方法、任何一种抗体出现阳性就计为阳性的话，140例临床诊断病例中SARS-CoV抗体阳性者113例(81%)，符合临床诊断，27例(19%)患者血清检测SARS-CoV抗体阴性，病程已在30～90天，不支持临床诊断，但需要结合其他检测结果。
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2.2 RT-PCR检测结果 27例抗SARS病毒抗体全阴性的患者中，15例20份粪便或漱口液检测了SARS-CoV RNA，2例粪便中阳性，3例漱口液中阳性，采集标本时间在病程的6～26天。
2.3 医护人员检测结果 154例SARS病人的密切接触者接受了抗-SARS CoV的检测，ELISA法IgM抗体10例阳性，IgG抗体2例阳性，但用IFA法检测全部阴性。
3 讨论
SARS这场突如其来的灾难虽然暂时过去了，但它还给人类留下许多问号，我们对它的来龙去脉还有许多不理解，还没有真正认识它、掌握它的规律，所以还不能够有效预防和控制这种疾病。
本项研究主要从恢复期和痊愈病例的随访情况，分析了实验室病原学诊断与临床诊断的关系。实验结果证实，在临床诊断SARS的患者中，约有1/5的病例在发病30～90天随访观察中未检测出抗-SARS-CoV抗体，从免疫学角 度不支持SARS冠状病毒感染，但其中有5例曾于漱口液或粪便中检测出病毒RNA。RT-PCR检测是在国家级实验室采用多对引物扩增完成，抗体的检测作用也采用了两种不同的方法，而且这27例全阴性者约半数是双份血清均为阴性。这一结果给我们几个方面的思考:由于缺乏特异性早期诊断指标，导致临床出现误诊病例。病毒RNA阳性为何不能够检测出相应的抗体?可能某些感染者抗体水平很低，目前的检测试剂灵敏度还不够，或者是不同的毒株之间在免疫反应上有差异?
, 百拇医药
当然在传染性非典型肺炎猖獗的特殊时期，造成病原学诊断与临床诊断不符的原因是多方面的，有其复杂的影响因素。
对于目前检测SARS病毒抗体的两种主要方法，方立群等报告[4] ，在发病10天，IgG阳性率为55.1%，IgM阳性率为16.3%，本研究也表明，间接免疫荧光法比较适合较早期血清、低滴度抗体和混有其他干扰因素(如，本身有自身抗体)患者的检测，因为此时可以结合未感染细胞的形态学加以鉴别。而ELISA在使用上更方便快捷，适合大量标本的研究，但在特异性方面还有待改进。观察各期SARS患者，IgM阳性水平较低，笔者观察了抗体滴度(另文报道)，IgG抗体产生早，急性期患者中4例是与IgM同时检出;在痊愈复查的病例(发病60～90天)中除去SARS-CoV抗体全阴性者外，85%～90%IgG型抗体依然保持阳性，而IgM型抗体56%～60%阳性。这是SARS患者的一个特点。
关于SARS冠状病毒隐性感染问题，笔者观察了154例医护人员，并且结合X线和临床观察，还没有充足的证据表明在这一人群中存在SARS病毒的隐性感染。
, 百拇医药
参考文献
1 Drosten C，Gunther S，Preiser W，et al.Identification of a novel coronˉavirus in patients with severe acute respiratory syndrome.N Eng J Med，2003，383:1967-1976.
2 洪涛，王健伟，孙异临，等.电镜观察从非典型肺炎患者尸检标本中发现衣原体样和冠状病毒性颗粒.中华医学杂志，2003，83:632-636.
3 赵春惠，郭雁宾，吴昊，等.北京地区108例SARS患者临床特征、 治疗效果及转归分析.中华医学杂志，2003，83:897-899.
4 方立群，张泮河，杨宝安，等.间接免疫荧光抗体实验在传染性非典型肺炎诊断中的作用.中华流行病杂志，2003，24:484-486.
作者单位:100054首都医科大学北京佑安医院
(编辑 曲全), 百拇医药(闫惠平)
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关键词 传染性非典型肺炎 冠状病毒 酶联免疫法 间接免疫荧光法
【文献标识码】 A【文章编号】 1606-8106(2003)12-1777-03
Etiological research for convalescent and recovery patients with SARS
YanHuiping，Tan Yufen，Zhang Yonghong，et al.
Beijing Youan Hospital，Capital University of Medical Sciences，Beijing 100054.
【Abstract】 Objective To observe etiological markers of convalescent and recovery patients with severe acute respiratory syndrome(SARS).To compare positive rate for SARS-coronavirus(CoV)antibodies by ELISA and indiˉrect immunoflourescence assay(IFA).Methods 351sera coming from4hospitals were detected.140cases(197samples)of351were diagnosed clinically as SARS.154of351were doctors and nurses who had ever worked in the SARS wards.20samples of feces and mouth washings were tested by RT-PCR.Results (1)The total positive rate，by ELISA，was36%(71/197)for IgM and48.1%(96/197)for IgG;by IFA was43.2%(60/139)for IgM and52.2%(74/139)for IgG.In the acute stage of patient anti-SARS CoV by IFA was higher than that by ELISA(17.1%for IgM and20%for IgG vs8.6%and5.7%).In the convalescent and recovery patients(60～90days from onset)，85%～90%of them were still positive for IgG but only56～70%of them presented IgM antibody.(2)113of140cases(81%)can be found SARS-CoV antibodies who were consistent with clinical diagnosis.Unfortunately，27of140cases were not found any SARS-CoV antibodies in30～90days from onset but2of27in feces，3of27in mouth washings were found SARS coronavirus RNA.(3)Concerning those doctors and nurses，12of themwere found antibodˉies against SARS by ELISA，by all were negative by IFA.Conclusion About1/5patients who were diagnosed SARS clinically could not be supported by etiology.IgM antibody against SARS-CoV was always in lower level，meanwhile IgG against SARS-CoV appeared early.In early stage of the illness，using IFA to detect antibodies is a little better than using ELISA.
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Key words SARS coronavirus ELISA IFA
到目前为止，已经有不少报道对传染性非典型肺炎即严重急性呼吸综合征(SARS)的病原学、流行病学、临床学等各种特点做了描述 [1～3] 。但人类目前对它的认识还十分有限，例如在诊断方法和试剂，在诊断标准等方面还有许多等待研究解决的问题。本文主要针对恢复期和痊愈复查的SARS患者，对其病原学指标做了分析研究，报告如下。
1 材料和方法
1.1 研究对象 (1)351份血清标本，分为两种人群:①SARS临床诊断病例140例(197份标本)，分别来自北京佑安医院、北京宣武医院等四家非典型肺炎定点收治医院。②从SARS病房撤离的医护人员154例。(2)恢复期和痊愈复查病人漱口液、粪便标本20份。
1.2 实验方法 (1)采用两种方法检测抗-SARS冠状病毒(SARS-CoV)抗体:①间接免疫荧光法(IFA):由德国EUˉROIMMUN公司提供SARS-CoV感染的Vero E6细胞制成的细胞涂片，同时提供非感染细胞作为阴性对照。操作方法:首先将血清60℃灭活30min，移至生物安全柜内操作，在细胞玻片上滴加1∶10和1∶100稀释的待检测血清，室温孵育，充分洗片后再加FITC标记的抗体作用，甘油封片，荧光显微镜下观察结果，以感染细胞中出现特异性绿色颗粒状荧光为阳性。②酶联免疫法(ELISA):由华大吉比爱公司提供试剂盒，血清处理同IFA方法，按说明书操作。(2)RT-PCR方法检测患者粪便中SARS-CoV RNA，主要参考WHO推荐引物和Drosten [1] 等报告的方法，由中国科学院北方基因组P3实验室协助完成。
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2 结果
2.1 临床诊断病例中抗SARS-CoV抗体检测结果 对不同时期的血清标本，用两种方法进行了检测，总检出率见表1。在共同检测的139例中，ELISA和IFA的符合率为86%。急性期和恢复期患者(发病15天以内)血清中两种方法的检出率见表2。
表1 ELISA法和IFA法检测SARS病毒抗体的总检出率略
表2 急性期和恢复、痊愈患者SARS病毒抗体的检出率(略)
从急性期血清检测结果可见，对早期患者，IFA方法检测抗-SARS病毒抗体更具有优越性(例数较少未做统计学处理)。IFA方法检测SARS IgG抗体阳性时，可表现特异性的荧光模式。
观察各期SARS患者，IgM阳性率始终较低，IgG抗体产生早，急性期患者中4例是与IgM同时检出;在痊愈复查的病例(发病60～90天)中除去SARS-CoV抗体全阴性者外，85%～90%IgG型抗体依然保持阳性，而IgM型抗体56%～70%阳性。本研究中，如果以任何一份血清标本、任何一种方法、任何一种抗体出现阳性就计为阳性的话，140例临床诊断病例中SARS-CoV抗体阳性者113例(81%)，符合临床诊断，27例(19%)患者血清检测SARS-CoV抗体阴性，病程已在30～90天，不支持临床诊断，但需要结合其他检测结果。
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2.2 RT-PCR检测结果 27例抗SARS病毒抗体全阴性的患者中，15例20份粪便或漱口液检测了SARS-CoV RNA，2例粪便中阳性，3例漱口液中阳性，采集标本时间在病程的6～26天。
2.3 医护人员检测结果 154例SARS病人的密切接触者接受了抗-SARS CoV的检测，ELISA法IgM抗体10例阳性，IgG抗体2例阳性，但用IFA法检测全部阴性。
3 讨论
SARS这场突如其来的灾难虽然暂时过去了，但它还给人类留下许多问号，我们对它的来龙去脉还有许多不理解，还没有真正认识它、掌握它的规律，所以还不能够有效预防和控制这种疾病。
本项研究主要从恢复期和痊愈病例的随访情况，分析了实验室病原学诊断与临床诊断的关系。实验结果证实，在临床诊断SARS的患者中，约有1/5的病例在发病30～90天随访观察中未检测出抗-SARS-CoV抗体，从免疫学角 度不支持SARS冠状病毒感染，但其中有5例曾于漱口液或粪便中检测出病毒RNA。RT-PCR检测是在国家级实验室采用多对引物扩增完成，抗体的检测作用也采用了两种不同的方法，而且这27例全阴性者约半数是双份血清均为阴性。这一结果给我们几个方面的思考:由于缺乏特异性早期诊断指标，导致临床出现误诊病例。病毒RNA阳性为何不能够检测出相应的抗体?可能某些感染者抗体水平很低，目前的检测试剂灵敏度还不够，或者是不同的毒株之间在免疫反应上有差异?
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当然在传染性非典型肺炎猖獗的特殊时期，造成病原学诊断与临床诊断不符的原因是多方面的，有其复杂的影响因素。
对于目前检测SARS病毒抗体的两种主要方法，方立群等报告[4] ，在发病10天，IgG阳性率为55.1%，IgM阳性率为16.3%，本研究也表明，间接免疫荧光法比较适合较早期血清、低滴度抗体和混有其他干扰因素(如，本身有自身抗体)患者的检测，因为此时可以结合未感染细胞的形态学加以鉴别。而ELISA在使用上更方便快捷，适合大量标本的研究，但在特异性方面还有待改进。观察各期SARS患者，IgM阳性水平较低，笔者观察了抗体滴度(另文报道)，IgG抗体产生早，急性期患者中4例是与IgM同时检出;在痊愈复查的病例(发病60～90天)中除去SARS-CoV抗体全阴性者外，85%～90%IgG型抗体依然保持阳性，而IgM型抗体56%～60%阳性。这是SARS患者的一个特点。
关于SARS冠状病毒隐性感染问题，笔者观察了154例医护人员，并且结合X线和临床观察，还没有充足的证据表明在这一人群中存在SARS病毒的隐性感染。
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参考文献
1 Drosten C，Gunther S，Preiser W，et al.Identification of a novel coronˉavirus in patients with severe acute respiratory syndrome.N Eng J Med，2003，383:1967-1976.
2 洪涛，王健伟，孙异临，等.电镜观察从非典型肺炎患者尸检标本中发现衣原体样和冠状病毒性颗粒.中华医学杂志，2003，83:632-636.
3 赵春惠，郭雁宾，吴昊，等.北京地区108例SARS患者临床特征、 治疗效果及转归分析.中华医学杂志，2003，83:897-899.
4 方立群，张泮河，杨宝安，等.间接免疫荧光抗体实验在传染性非典型肺炎诊断中的作用.中华流行病杂志，2003，24:484-486.
作者单位:100054首都医科大学北京佑安医院
(编辑 曲全), 百拇医药(闫惠平)