标记免疫分析技术发展状况浅谈
【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2003)16-1479-02
标记免疫分析
是一门综合性学科，也是一门边缘学科。是集基础医学、实验医学及临床应用于一体的学科。在当前的各种免疫诊断技术中标记免疫分析技术是最为活跃的、发展最快的一个领域。其基本原理是利用抗原—抗体结合反应的特异性，加上各种标记物的可测量性来达到方便敏感地检测各种体内微量生物活性物质，包括内分泌激素、蛋白质、多肽、核酸、神经递质、受体、细胞因子、细胞表面抗原、肿瘤标志物、血药浓度等 [1] 。
自1959年Yalow和Berson创建的放射免疫分析(RIA)具有灵敏度高、特异性强、简便实用、成本低廉等优点。为生物医学的微量物质分析开创了新的领域。发展到目前为止由此衍生出了各种各样的标记免疫分析技术，虽然RIA仍有较广泛的使用市场和价值，但其方法学上固有的弱点使发展受到一定限制。如必须使用放射性同位素作为标记物，存在着辐射防护及防止污染的问题，试剂盒使用时间短，每次操作都要做标准曲线，可测量范围相对较窄，难以实现操作及测量的自动化等。
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从20世纪70年代末发展起来的非同位素标记的各种标记免疫分析技术克服了RIA固有的缺陷。灵敏度更高，可测范围宽，试剂盒使用时间长，操作及测量可全自动化进行。标记免疫分析技术按照示踪标记物的类型和标记技术可分以下类别:(1)放射性核素标记:放射免疫分析(RIA)1959年;竞争性蛋白结合分析(CPBA)1960年;免疫放射量度分析(IRMA)1968年;放射受体分析(RRA)1968年;免疫放射量度双位点夹心(IRMA)1971年。(2)酶标记免疫分析:酶联免疫吸附测定(ELISA)1971年;酶增强免疫分析(EMIT)1972年;酶放射免疫分析(ERIA)1979年;高灵敏度ELISA，1980年;酶循环免疫分析(ECIA)1986年。(3)荧光标记免疫分析:荧光增强标记免疫分析(FIA)1981年;时间分辨光荧光免疫分析(TRFIA)1982年。(4)化学发光免疫分析:直接标记化学发光免疫分析(CLIA)1977年;增强化学发光酶免疫分析(E-CLIA)1989年;电化学发光免疫分析(EˉCLIA)1991年;微粒子免疫发光分析(MEIA)1995年。
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近年来各类化学发光检测设备在临床日益广泛的应用，已较大程度的取代了一些传统的RIA项目。在免疫分析方法中用放射性同位素标记所占的比例由1980年的60%下降为1989年的25%。非同位素标记由1980年的不足40%上升为1989年的75% [2] ，近10年来这个比例仍在变化。以本单位为例，使用RIA试剂盒从10年前的95%下降到目前的44%，三甲以上的大型医院则不足20%，有的仅为5%。取而代之的是各类非同位素标记的免疫分析技术，特别是各种全自动化学发光分析设备有的医院已达4～6台。在一些较富裕地区此类设备在二级甲等以下的医院亦有装备。
70年代初，Engvall和Perlaman等学者首次创建了非均相的酶免疫检测技术，也称固相酶免疫检测技术，即酶联免疫吸附试验(ELISA)。是将待测抗原或抗体通过吸附或特异性抗体或抗原的捕捉使其固定于固相支持物表面，再将用酶标记的抗体或抗原与之反应，酶在液相反应中催化底物显色来测定待测抗原或抗体的含量。最常用的为辣根过氧化物酶和碱性硫酸酶。随即出现的均相酶免疫检测技术，也称非固相或液相免疫检测技术，即酶倍增免疫分析(EMIA)，其示踪酶有6-磷酸葡萄糖脱氨酶、溶菌酶及苹果酸脱氢酶等。近年来发展起来的生物素-亲和素系统(BAS)是一种生物反应的放大系统，其亲和常数Ka值高达10 -15 mol/L，是抗原抗体反应的10～100万倍 [1] 。亲和素通过4个结合位点多价桥联标记物而起到生物反应的放大作用。BAS不仅在酶免检测技术中广泛使用，在几乎所有的标记免疫检测技术中都可应用，如同位素、金标及荧光素等。目前较为广泛使用的是化学发光酶免分析(CLEIA)，如美国DPC公司的Immulite，是一种全自动酶放大化学发光免疫分析仪，其灵敏度及特异性都高于RIA。
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80年代初创建的时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)使用镧系元素作为标记物。目前有5种镧系元素即铕(Eu)、铽(Tb)、钐(Sm)、铌(Nd)和镝(Dy)用作标记物，其中以Eu标记抗体应用最广泛，其激发光波长为337nm，发射波长615nm，很容易进行波长分辨，排除了激发光的干扰。时间分辨荧光仪通过延迟一定时间测定，就可获得Eu 3+ 的特异性荧光信号并有效排除非特异性的荧光信号。具有灵敏度高(可达10 -17 mol/L) [3] 。检测范围宽、稳定性好、易于自动化的特点。该系统还可采用多标记的方法，对多个待测物同时检测。作为标记物的镧系元素很容易从荧光波长和荧光寿命分辨来区别不同的荧光信号，是TRFIA的技术特色之一。
20世纪70年代末创立的化学发光免疫检测技术(CLIˉA)对于临床免疫分析检测超微量活性物质的技术进步起到了极大的促进作用，它是利用催化剂在氧化剂存在的条件下使发光物质形成激发态产物，当激发态产物回到基态时释放的能量转变为光子从而产生发光现象，用发光物质标记抗体或抗原，免疫反应结束后，通过测量发射光的强度，根据标准曲线测知待测物的深度。较常用的化学发光标记物有吖啶酯及其衍生物，不需要催化剂，自然本底低、信噪比高、稳定性好，其分子中的N-羟基琥珀酰亚胺酯活化基因可与抗原或抗体分子末端的氨基共价结合，生成化学发光活性强、免疫反应特异性高的标记抗体。如Ciba-Corning ACS180免疫分析试剂就是采用二甲基吖啶酯直接标记的。近年来已成功解决了初期发光持续时间短、信号强度弱、本底高、易受环境物质干扰及操作烦琐等问题。生产出专用的全自动设备及配套的试剂盒，使得这一技术在临床检测中广泛推广使用。目前不同类型的化学发光免疫分析试剂主要有三类:一是以吖啶酯作为直接标记物的化学发光分析系统(如ACS:180系统);二是以辣根过氧化物酶(HRP)标记，鲁米诺作为发光底物(如Amersham公司的Amerlite系统);三是以碱性磷酸酶为标记物，3-(2’-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3’-磷酰氧基)-苯基-1，2环氧乙烷(AMMPPD)为发光底物的化学发光系统(如DPC公司的Immulite系统)。由于从加样、传输、温育反应、分离、洗涤、测量、数据处理、质控分析和结果打印都是全自动化，避免了传统RIA及IRMA手工操作等产生的各类误差，大大提高了检测的灵敏度及精确性，结果的可靠性亦得以提高。发光标记物的稳定性好、有效期长、可达数月甚至数年，使得试剂盒的使用时间延长，这对使用量相对较小的医疗机构十分有利。
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电化学发光免疫分析(ECLIA)是20世纪90年代初发展起来的一种新型化学发光免疫分析方法，与一般化学发光不同在于它是在电极表面由化学引发的特异性化学发光反应，实际上包括了电化学和化学发光两个过程。是由电启动的发光反应。而一般的化学发光是通过与化合物之间混合反应发出光子的发光反应。最常用的电化学发光化合物是二联吡啶钌[Ru(bpy) 3 ] 2+ ，它与电子供体三丙胺(TPA)在电场(非化学反应)触发下产生化学发光反应，即在电场下的氧化还原反应。将[Ru(bpy) 3 ] 3+ 还原为激发态的[Ru(bpy) 3] 2+# ，后者发射一个620nm的光子回到基态，只需0.01ms就可发出稳定的光，每秒几十万次的循环电化学发光大大提高了分析的灵敏度 [4] 。ECLIA由于其方法学的先进性其优点是明确的，如Boehringer Mannheim公司的Elesys1010及Elesys2010等全自动电化学发光免疫分析仪已在国内多家医疗单位使用，反映良好。
, 百拇医药 20世纪90年代中期发展起来的微粒子捕捉免疫发光技术(MEIA)，又称固液相标记免疫发光技术。特点为将抗原/抗体包被于表面多孔，直径仅0.5μm的微粒上，可和玻璃纤维不可逆结合。采用碱性磷酸酶为标记物，4-甲基磷酸伞酮(MUP)为发光底物，后者在荧光照射后产生可测量性荧光。美国ABBOTT axsym System免疫分析仪是一种采用多种方法学的免疫分析系统，除了EMIA外，还采用了离子捕捉发光技术(ICIA)、荧光偏振免疫发光技术(FRIA)及辐射能衰减免疫检测技术(REA)。不同的方法结合使用，扩大了检测范围，大大提高了免疫分析的灵敏度，特异性和稳定性，反应时间缩短，是全自动定量免疫分析的一个里程碑 [5] 。该设备经国内多家单位使用，认为其仪器设计科学合理，分析项目全面(肝炎系列、肿瘤系列、甲状腺系列、生殖激素系列、优生检查、血药浓度等近80种项目)。检测快速，多数项目12～50min即可出结果。各类项目可任意组合，是大、中型医院临床实验室比较理想的免疫分析仪之一 [6] 。
, http://www.100md.com 鉴于目前多种免疫分析方法并存，必然存在多种方法之间的比较，这种比较的影响因素也是多方面的。如方法学的先进性、检测的灵敏度、稳定性、设备及试剂价格等等。市场上相互竞争激烈，使用单位则应根据自身的情况进行选择并与其它免疫学方法相互补充。所以，就使用者而言还很难肯定哪种方法/设备最好。上述各类免疫学方法各具特点，使用者只有通过实践进行正确评价，选择适合自身医院及科室特点的设备。
当今在各种全自动化学发光免疫分析系统推出的情况下，传统的RIA使用市场逐渐缩小，特别是在沿海发达地区。但RIA经历了40年的研究应用，灵敏度、特异性、精密度、稳定性及临床符合率已达到较高水平，国产试剂盒的技术含量大大提高，在样品量不大的中小型医疗机构仍广泛使用。检测设备及试剂盒价格便宜、操作简单。在生物医学的基础研究中，新的生物活性物质发现日益增多，研究它们和某些疾病发生及发展的关系，需建立高灵敏度、高特异性的检测方法，高自动化的非放射性标记免疫分析在生命科学实验中是不能取代RIA技术的。RIA和其它放射示踪技术仍处在不断更新换代发展阶段 [6] 。由于全自动化学发光设备及试剂目前的价格较昂贵，全自动功能主要面对临床的常规大量样品检测，检测项目尚不完全。因此，RIA技术在我国今后相当长的一段时间内依然具有一定的市场，在样品量不大的中小型医院广泛使用。全自动化的化学发光技术也在不断的完善及发展中。目前各类设备亦并非没有缺陷，除了价格问题外，如某些项目的批检测结果常与其它相关检测及临床诊断不符;操作不当也可引起结果误差，且浪费大量价格昂贵的试剂;大量样品上机血清样品蒸发过快导致检测结果的误差 [7] ;设备所用去离子水的纯度不够造成的误差;缺乏规范化的质量控制指标等等。因此，目前尚没有一种免疫分析技术是完美无缺的，许多问题还有待于相关学科的专家去研究解决，在实践中进行检验，我们期待着标记免疫分析技术不断完善，为临床诊断及人民的健康做出贡献。
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参考文献
1 王自正.现代医学标记免疫学，北京:人民军医出版社，2000，1.
2 Gosling J PA.Decade of development in immunoassay methodology.Clin Chem，1990，36(8):1408-1427.
3 孙龙安.医学特种检验与实验室诊断，北京:人民军医出版社，2002，5.
4 尹东光，贺佑丰.几种主要化学发光物质的发光性能及其化学发光免疫分析体系，标记免疫分析与临床，2002，9(4):229.
5 郎江明.临床免疫诊断学，广州:广东科技出版社.809-811.
6 成军，袁兴旺.美国Abbott Axsym免疫分析仪性能初步评价.国外医学·临床生物化学与检验分册，2003，24(2):112-113.
7 滕龙，杜成仁.ACCESS化学发光分析仪在机样品风干速度及对测定结果的影响.中华检验医学杂志，2003，26(3):178.
作者单位:518067广东省深圳蛇口联合医院放射免疫检测中心
(编辑晓 亮), http://www.100md.com(马)
标记免疫分析
是一门综合性学科，也是一门边缘学科。是集基础医学、实验医学及临床应用于一体的学科。在当前的各种免疫诊断技术中标记免疫分析技术是最为活跃的、发展最快的一个领域。其基本原理是利用抗原—抗体结合反应的特异性，加上各种标记物的可测量性来达到方便敏感地检测各种体内微量生物活性物质，包括内分泌激素、蛋白质、多肽、核酸、神经递质、受体、细胞因子、细胞表面抗原、肿瘤标志物、血药浓度等 [1] 。
自1959年Yalow和Berson创建的放射免疫分析(RIA)具有灵敏度高、特异性强、简便实用、成本低廉等优点。为生物医学的微量物质分析开创了新的领域。发展到目前为止由此衍生出了各种各样的标记免疫分析技术，虽然RIA仍有较广泛的使用市场和价值，但其方法学上固有的弱点使发展受到一定限制。如必须使用放射性同位素作为标记物，存在着辐射防护及防止污染的问题，试剂盒使用时间短，每次操作都要做标准曲线，可测量范围相对较窄，难以实现操作及测量的自动化等。
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从20世纪70年代末发展起来的非同位素标记的各种标记免疫分析技术克服了RIA固有的缺陷。灵敏度更高，可测范围宽，试剂盒使用时间长，操作及测量可全自动化进行。标记免疫分析技术按照示踪标记物的类型和标记技术可分以下类别:(1)放射性核素标记:放射免疫分析(RIA)1959年;竞争性蛋白结合分析(CPBA)1960年;免疫放射量度分析(IRMA)1968年;放射受体分析(RRA)1968年;免疫放射量度双位点夹心(IRMA)1971年。(2)酶标记免疫分析:酶联免疫吸附测定(ELISA)1971年;酶增强免疫分析(EMIT)1972年;酶放射免疫分析(ERIA)1979年;高灵敏度ELISA，1980年;酶循环免疫分析(ECIA)1986年。(3)荧光标记免疫分析:荧光增强标记免疫分析(FIA)1981年;时间分辨光荧光免疫分析(TRFIA)1982年。(4)化学发光免疫分析:直接标记化学发光免疫分析(CLIA)1977年;增强化学发光酶免疫分析(E-CLIA)1989年;电化学发光免疫分析(EˉCLIA)1991年;微粒子免疫发光分析(MEIA)1995年。
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近年来各类化学发光检测设备在临床日益广泛的应用，已较大程度的取代了一些传统的RIA项目。在免疫分析方法中用放射性同位素标记所占的比例由1980年的60%下降为1989年的25%。非同位素标记由1980年的不足40%上升为1989年的75% [2] ，近10年来这个比例仍在变化。以本单位为例，使用RIA试剂盒从10年前的95%下降到目前的44%，三甲以上的大型医院则不足20%，有的仅为5%。取而代之的是各类非同位素标记的免疫分析技术，特别是各种全自动化学发光分析设备有的医院已达4～6台。在一些较富裕地区此类设备在二级甲等以下的医院亦有装备。
70年代初，Engvall和Perlaman等学者首次创建了非均相的酶免疫检测技术，也称固相酶免疫检测技术，即酶联免疫吸附试验(ELISA)。是将待测抗原或抗体通过吸附或特异性抗体或抗原的捕捉使其固定于固相支持物表面，再将用酶标记的抗体或抗原与之反应，酶在液相反应中催化底物显色来测定待测抗原或抗体的含量。最常用的为辣根过氧化物酶和碱性硫酸酶。随即出现的均相酶免疫检测技术，也称非固相或液相免疫检测技术，即酶倍增免疫分析(EMIA)，其示踪酶有6-磷酸葡萄糖脱氨酶、溶菌酶及苹果酸脱氢酶等。近年来发展起来的生物素-亲和素系统(BAS)是一种生物反应的放大系统，其亲和常数Ka值高达10 -15 mol/L，是抗原抗体反应的10～100万倍 [1] 。亲和素通过4个结合位点多价桥联标记物而起到生物反应的放大作用。BAS不仅在酶免检测技术中广泛使用，在几乎所有的标记免疫检测技术中都可应用，如同位素、金标及荧光素等。目前较为广泛使用的是化学发光酶免分析(CLEIA)，如美国DPC公司的Immulite，是一种全自动酶放大化学发光免疫分析仪，其灵敏度及特异性都高于RIA。
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80年代初创建的时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)使用镧系元素作为标记物。目前有5种镧系元素即铕(Eu)、铽(Tb)、钐(Sm)、铌(Nd)和镝(Dy)用作标记物，其中以Eu标记抗体应用最广泛，其激发光波长为337nm，发射波长615nm，很容易进行波长分辨，排除了激发光的干扰。时间分辨荧光仪通过延迟一定时间测定，就可获得Eu 3+ 的特异性荧光信号并有效排除非特异性的荧光信号。具有灵敏度高(可达10 -17 mol/L) [3] 。检测范围宽、稳定性好、易于自动化的特点。该系统还可采用多标记的方法，对多个待测物同时检测。作为标记物的镧系元素很容易从荧光波长和荧光寿命分辨来区别不同的荧光信号，是TRFIA的技术特色之一。
20世纪70年代末创立的化学发光免疫检测技术(CLIˉA)对于临床免疫分析检测超微量活性物质的技术进步起到了极大的促进作用，它是利用催化剂在氧化剂存在的条件下使发光物质形成激发态产物，当激发态产物回到基态时释放的能量转变为光子从而产生发光现象，用发光物质标记抗体或抗原，免疫反应结束后，通过测量发射光的强度，根据标准曲线测知待测物的深度。较常用的化学发光标记物有吖啶酯及其衍生物，不需要催化剂，自然本底低、信噪比高、稳定性好，其分子中的N-羟基琥珀酰亚胺酯活化基因可与抗原或抗体分子末端的氨基共价结合，生成化学发光活性强、免疫反应特异性高的标记抗体。如Ciba-Corning ACS180免疫分析试剂就是采用二甲基吖啶酯直接标记的。近年来已成功解决了初期发光持续时间短、信号强度弱、本底高、易受环境物质干扰及操作烦琐等问题。生产出专用的全自动设备及配套的试剂盒，使得这一技术在临床检测中广泛推广使用。目前不同类型的化学发光免疫分析试剂主要有三类:一是以吖啶酯作为直接标记物的化学发光分析系统(如ACS:180系统);二是以辣根过氧化物酶(HRP)标记，鲁米诺作为发光底物(如Amersham公司的Amerlite系统);三是以碱性磷酸酶为标记物，3-(2’-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3’-磷酰氧基)-苯基-1，2环氧乙烷(AMMPPD)为发光底物的化学发光系统(如DPC公司的Immulite系统)。由于从加样、传输、温育反应、分离、洗涤、测量、数据处理、质控分析和结果打印都是全自动化，避免了传统RIA及IRMA手工操作等产生的各类误差，大大提高了检测的灵敏度及精确性，结果的可靠性亦得以提高。发光标记物的稳定性好、有效期长、可达数月甚至数年，使得试剂盒的使用时间延长，这对使用量相对较小的医疗机构十分有利。
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电化学发光免疫分析(ECLIA)是20世纪90年代初发展起来的一种新型化学发光免疫分析方法，与一般化学发光不同在于它是在电极表面由化学引发的特异性化学发光反应，实际上包括了电化学和化学发光两个过程。是由电启动的发光反应。而一般的化学发光是通过与化合物之间混合反应发出光子的发光反应。最常用的电化学发光化合物是二联吡啶钌[Ru(bpy) 3 ] 2+ ，它与电子供体三丙胺(TPA)在电场(非化学反应)触发下产生化学发光反应，即在电场下的氧化还原反应。将[Ru(bpy) 3 ] 3+ 还原为激发态的[Ru(bpy) 3] 2+# ，后者发射一个620nm的光子回到基态，只需0.01ms就可发出稳定的光，每秒几十万次的循环电化学发光大大提高了分析的灵敏度 [4] 。ECLIA由于其方法学的先进性其优点是明确的，如Boehringer Mannheim公司的Elesys1010及Elesys2010等全自动电化学发光免疫分析仪已在国内多家医疗单位使用，反映良好。
, 百拇医药 20世纪90年代中期发展起来的微粒子捕捉免疫发光技术(MEIA)，又称固液相标记免疫发光技术。特点为将抗原/抗体包被于表面多孔，直径仅0.5μm的微粒上，可和玻璃纤维不可逆结合。采用碱性磷酸酶为标记物，4-甲基磷酸伞酮(MUP)为发光底物，后者在荧光照射后产生可测量性荧光。美国ABBOTT axsym System免疫分析仪是一种采用多种方法学的免疫分析系统，除了EMIA外，还采用了离子捕捉发光技术(ICIA)、荧光偏振免疫发光技术(FRIA)及辐射能衰减免疫检测技术(REA)。不同的方法结合使用，扩大了检测范围，大大提高了免疫分析的灵敏度，特异性和稳定性，反应时间缩短，是全自动定量免疫分析的一个里程碑 [5] 。该设备经国内多家单位使用，认为其仪器设计科学合理，分析项目全面(肝炎系列、肿瘤系列、甲状腺系列、生殖激素系列、优生检查、血药浓度等近80种项目)。检测快速，多数项目12～50min即可出结果。各类项目可任意组合，是大、中型医院临床实验室比较理想的免疫分析仪之一 [6] 。
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当今在各种全自动化学发光免疫分析系统推出的情况下，传统的RIA使用市场逐渐缩小，特别是在沿海发达地区。但RIA经历了40年的研究应用，灵敏度、特异性、精密度、稳定性及临床符合率已达到较高水平，国产试剂盒的技术含量大大提高，在样品量不大的中小型医疗机构仍广泛使用。检测设备及试剂盒价格便宜、操作简单。在生物医学的基础研究中，新的生物活性物质发现日益增多，研究它们和某些疾病发生及发展的关系，需建立高灵敏度、高特异性的检测方法，高自动化的非放射性标记免疫分析在生命科学实验中是不能取代RIA技术的。RIA和其它放射示踪技术仍处在不断更新换代发展阶段 [6] 。由于全自动化学发光设备及试剂目前的价格较昂贵，全自动功能主要面对临床的常规大量样品检测，检测项目尚不完全。因此，RIA技术在我国今后相当长的一段时间内依然具有一定的市场，在样品量不大的中小型医院广泛使用。全自动化的化学发光技术也在不断的完善及发展中。目前各类设备亦并非没有缺陷，除了价格问题外，如某些项目的批检测结果常与其它相关检测及临床诊断不符;操作不当也可引起结果误差，且浪费大量价格昂贵的试剂;大量样品上机血清样品蒸发过快导致检测结果的误差 [7] ;设备所用去离子水的纯度不够造成的误差;缺乏规范化的质量控制指标等等。因此，目前尚没有一种免疫分析技术是完美无缺的，许多问题还有待于相关学科的专家去研究解决，在实践中进行检验，我们期待着标记免疫分析技术不断完善，为临床诊断及人民的健康做出贡献。
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参考文献
1 王自正.现代医学标记免疫学，北京:人民军医出版社，2000，1.
2 Gosling J PA.Decade of development in immunoassay methodology.Clin Chem，1990，36(8):1408-1427.
3 孙龙安.医学特种检验与实验室诊断，北京:人民军医出版社，2002，5.
4 尹东光，贺佑丰.几种主要化学发光物质的发光性能及其化学发光免疫分析体系，标记免疫分析与临床，2002，9(4):229.
5 郎江明.临床免疫诊断学，广州:广东科技出版社.809-811.
6 成军，袁兴旺.美国Abbott Axsym免疫分析仪性能初步评价.国外医学·临床生物化学与检验分册，2003，24(2):112-113.
7 滕龙，杜成仁.ACCESS化学发光分析仪在机样品风干速度及对测定结果的影响.中华检验医学杂志，2003，26(3):178.
作者单位:518067广东省深圳蛇口联合医院放射免疫检测中心
(编辑晓 亮), http://www.100md.com(马)