切应力诱导人脐静脉血管内皮细胞基因转录因子NF-κB的活化
【摘要】 目的 研究发现力学信号可在内皮细胞内传递而引起内皮细胞一系列代谢变化。本研究欲明确流体切应力诱导血管内皮细胞NF-κB活化。方法 将对照和切应力处理10、20、30、60min的人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)裂解物，通过SDS-PAGE电泳分离，用半干电转移仪将蛋白从凝胶转移于硝酸纤维素膜上，检测IκBα和磷酸化IκBα免疫印迹强度。将生长于载玻片上的对照和切应力处理0.5、1、1.5、2h的HUVECs，用4%多聚甲醛固定后，用免疫荧光细胞化学染色检测切应力刺激后NF-κB p65的核转移情况。结果 IκBα和磷酸化IκBα免疫印迹显示，切应力刺激HUVECs10min后磷酸化IκB明显增强，其后随刺激时间延长逐渐降低，于60min降至几乎测不到;IκB随刺激时间延长而降低，30min降至测不到。NF-κB p65荧光细胞化学染色显示，未刺激的HUVECs胞浆染色阳性，刺激0.5、1h后胞核染色阳性，1.5、2h后胞核染色强阳性。结论 提示切应力刺激可诱导NF-κB激活并向核内转移。
关键词 基因转录因子 NF-κB 切应力 活化
, 百拇医药
【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2003)17-1547-03
Flow shear stress induce gene transcriptional factor NF-κB
activation in human umbilical vein endothelial cells
Liang Feng，Hu Dayi，Wu Mingying，et al.
Cardiovascular Center，Beijing Tongren Hospital，Capital University of Medical Science，Beijing100730.
【Abstract】 Objective Previous studies found that mechanical signal could transduce in HUVECs，and reguˉlate metabolism of endothelial cells.This study isto examine the NF-κB activation induced by flow shear stress in vascular endothelial cells.Methods The lysates of primary cultured umbilical vein endothelial cells that untreated and treated with shear stress for10，20，30，60minutes，wereseparated by SDS-PAGE.Semi-dry transfer cell was used to transfer proteins fromSDS-PAGE onto nitrocellulose membrane，then the immunoblotting density of IκBαand phospho-IκBαwere determined by Western blot.The primary cultured umbilicalvein endothelial cells that were culˉtured on slides were fixed with4%paraformaldehyde.Then the NF-κB p65immunocytofluorescent staining were perˉformed.Results Western blot of the primary cultured vascular endothelial cell lysates showed that a markedly inˉcreased density of P-IκB blot occurred at10minutes of exposure of the cells to4.2dyne/cm 2 flow shear stress and density of the blot dramatically dropped down after60minutes of exposure.Coincidence with that，the density of IκB blot dropped down after30minutes.NF-κB p65immunocytofluorescent staining of the primary cultured vascular enˉdothelial cells showed that when treated with4.2dyne/cm 2 flow shear stress for0.5or1hours，the cell nuclei became staining，after1.5or2hours，the staining was very strong.Conclusion This study suggests that shear stress can inˉduce NF-κB activation in vascular endothelial cells.
, 百拇医药
Key words gene transcriptional factor NF-κB shear stress activation
业已证实，NF-κB激活通路存在于血管内皮细胞和平滑肌细胞中。且多种因素可激活NF-κB。血管内皮细胞在血液与血管壁之间充当着“感受器”和“传导器”角色 [1] ，可分泌多种趋化和粘附分子 [2] ，这些分子在白细胞附着、浸润和迁移于血管的过程中起重要作用 [1] 。新近研究显示表达这些分子之基因都含有NF-κB结合位点，即血管内皮细胞受到外源因素刺激后，激活NF-κB，后者与这些分子基因的反应元件结合，促使其表达上调。故NF-κB被认为是血管内皮细胞受损的始动机制之一。本研究欲用层流 ˇ 基金项目:CMB资助项目(98-681)，国家自然科学基金资助项目(39830110，39970293) 低切应力刺激脐静脉血管内皮细胞，并检测其NF-κB的活化。
, http://www.100md.com 1 材料和方法
1.1 材料 M199细胞培养基、Ⅱ型胶原酶、胎牛血清、封闭用羊血清均购自Gibco BRL公司(USA)。新生小牛血清为成都市华星生物制品厂产品。硝酸纤维素膜由上海华舜生物有限公司生产。IκBα和磷酸化IκBα免疫印迹试剂盒为New Engl Biolabs公司(Britain)产品。兔抗人NF-κB p65多克隆抗体为Santa Cruz Biotechnology Inc公司(USA)产品。生物素标记的羊抗兔第二抗体和荧光素标记的链霉亲和素为DAKO公司(Denmark)产品。其余试剂为进口及国产分析纯。垂直电泳仪及半干电转移仪(Semidry transfer cell)均购自BIO RAD公司(USA)。
1.2 方法
1.2.1 内皮细胞培养及切应力刺激 细胞培养及切应力刺激。原代培养的人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)，取自健康产妇分娩的新鲜脐带，用0.1%胶原酶消化分离后，培养于M199完全培养基，内含20%胎牛血清、青霉素100U/ml和链霉素100μg/ml。细胞长灌培养瓶底部后接种于载玻片上，待细胞融合铺满后，将其置于平行板流动装置流室中，循环泵入细胞培养液，控制层流切应力为4.2dyne/cm 2 。分别处理内皮细胞10、20、30、60、90和120min，未处理细胞作为对照，收集细胞用于下述的各种检测。所有实验步骤均严格消毒防止污染。
, 百拇医药
1.2.2 IκBα和磷酸化IκBα免疫印迹 滴加1×SDS加样缓冲液150μl于单层生长的原代培养内皮细胞上，然后将其刮入EP管内，超声处理15s，100℃煮沸5min，4℃离心5min后，收集上清。紫外分光光度仪测定后稀释各样品总蛋白浓度相等。SDS-PAGE小胶30mA恒流电泳。半干电转移仪将蛋白转移于硝酸纤维素膜上。按photope R○HRP Westˉern Detection试剂盒说明书进行免疫印迹，即室温下5%牛血清白蛋白封闭1h，兔抗人IκBα或磷酸化IκBα一抗(1∶1000)4℃孵育过夜，辣根过氧化物酶标记的二抗(1:2000)室温下孵育1h，加入发光底物，X线片感光，显影。
1.2.3 免疫荧光细胞化学染色 将生长于载玻片的原代培养内皮细胞用4%多聚甲醛固定20min，5%羊血清工作液封闭20min，然后分别孵育于兔抗人NF-κB p65多克隆抗体(1∶100)1h，生物素标记的羊抗兔二抗(1∶300)45min和荧光素标记的链霉亲和素(1∶100)15min，最后用50%碱性缓冲甘油封片，荧光显微镜观察。为排除切应力刺激过程中细菌LPS污染因素的影响，将用于切应力刺激2h的细胞培养液收集，并用其孵育接种于载玻片上的原代培养内皮细胞0.5、1、1.5、2h，然后行NF -κB p65免疫荧光细胞化学染色，明确用于刺激后的细胞培养液是否可活化NF-κB，从而排除污染因素导致NF-κB活化。
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2 结果
2.1 原代培养血管内皮细胞IκBα或磷酸化IκBα免疫印迹结果 原代培养血管内皮细胞裂解物免疫印迹结果显示，切应力刺激10min后磷酸化IκB增强，60min后降至测不到。相应地IκB随刺激时间的延长而逐渐降低，30min降至测不到(图1)。结果提示切应力刺激可诱导人血管内皮细胞IκB的磷酸化和降解。图1 原代培养血管内皮细胞IκBα或磷酸化IκBα免疫印迹结果
2.2 原代培养血管内皮细胞NF-κB p65免疫荧光细胞化学染色结果 NF-κB p65免疫荧光细胞化学染色显示，未处理的内皮细胞胞浆染色阳性，胞核染色阴性(图2A)。当切应力刺激0.5、1h后胞核染色阳性(图2B，C)，1.5、2h后胞核染色强阳性(图2D，E)，提示切应力刺激后NF-κB向核内转移。将用于切应力刺激2h的细胞培养液收集，并用其孵育接种于载玻片上的血管内皮细胞，显示细胞核染色均阴性(图略)，说明NF-κB的核转移并非污染因素导致。图2 NF-κB p65免疫荧光细胞化学染色观察切缨力处理的原代培养内皮细胞NF-κB核转移对照(A);切应力刺激0.5h(B)，1h(C)，1.5h(D)，2h(E)600×
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3 讨论
血管内皮为血管内壁的单层细胞，与血液密切接触。流经整个血管网的脉冲血流产生生物机械力，作用于血管 壁，调节其功能变化[3] 。这些血流机械力包括流体静压力，环状张力，伸展力，以及层流和非层流管壁摩擦力 [4]。切应力被定义为血流与内皮的粘性阻力，即为血流动力学的切线性力，主要作用于内皮细胞，通过机械传导过程，内皮细胞转换机械刺激为生物化学信号 [5] ，调节内皮细胞的功能。且已有的文献报道切应力可上调许多基因表达 [6] 。本研究报道低切应力可诱导原代培养脐静脉血管内皮细胞NF-κB活化。
NF-κB最常见的是以p50和p65二聚体形式存在于胞浆内，并与抑制因子IκB结合，以无活性的形式存在于胞浆内。当细胞受到刺激后，IκB磷酸化并降解 [7] ，使p50和p65转移于核内并结合于特定的DNA序列，诱导基因转录激活 [8] 。Lan等用于EMSA方法发现切应力可激活NF-κB，并与特定的核苷酸序列作用 [9] 。
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基于对目前NF-κB活化机制的理解，目前已发展出多种生物化学、免疫化学和免疫组化检测方法测定NF-κB的活化。本研究对切应力处理的人原代培养脐静脉血管内皮细胞裂解物，行IκBα和磷酸化IκBα免疫印迹检测法。发现层流切应力刺激可诱导人脐静脉血管内皮细胞IκBα的磷酸化和降解。NF-κB p65免疫荧光细胞化学染色发现，层流切应力诱导人脐静脉血管内皮细胞NF-κB核转移。本研究提示层流切应力刺激血管内皮细胞NF-κB活化，调节特定的基因的表达，参与动脉粥样硬化的发生和发展。
参考文献
1 李建军，李庚山.NF-κB与心血管疾病.国外医学·分子生物学 分册，1999，21:123-126.
2 Liao F，Andalibi A，C deBeer FC，et al.Genetic control of inflammatory gene induction and NF-κB-like transcription factor activation in reˉsponse to an atherogenic diet in mice.J Clin Invest，1993，91:2572-2579.
, 百拇医药
3 Davies PF.Haemodynamic influences on vascular remodelling.Trnasˉplant Immunol，1997，5:243-248.
4 Ku DN.Blood flow in arteries.Annu Rev Fluid Mech，1997，29(2):399-403.
5 Chien S，Li S，Shyy JYJ.Effects of mechanical forces on signal transducˉtion and gene expression in endothelial cells.Hypertension，1998，31(part2):162-169.
6 Davies PF，Barbee KA，Volin MV，et al.Spatial relationships in early sinaling events of flow-mediated endothelial mechanotransduction.Anˉnu Rev Physol，1997，59(5):527-540.
, http://www.100md.com
7 Liechanover A.The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway.Cell，1994，79:13-21.
8 May MJ，Ghosh S.Signal transduction through NF-κB.Immunol Toˉday，1998，19(2):80-88.
9 Lan Q，Mercurius KO，Davies PF.Stimulation of transcription factor NF-κB and AP-1in endothelial cells subjected to shear stress.Biochem Biophys Res Commun，1994，201:950-956.
作者单位:1100730首都医科大学附属北京同仁医院心脏中心
2610041四川大学华西医学中心基础医学院
(编辑晓 勇), 百拇医药(梁 峰 胡大一 吴明营 李田昌 汤楚中 刘梅林)
关键词 基因转录因子 NF-κB 切应力 活化
, 百拇医药
【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2003)17-1547-03
Flow shear stress induce gene transcriptional factor NF-κB
activation in human umbilical vein endothelial cells
Liang Feng，Hu Dayi，Wu Mingying，et al.
Cardiovascular Center，Beijing Tongren Hospital，Capital University of Medical Science，Beijing100730.
【Abstract】 Objective Previous studies found that mechanical signal could transduce in HUVECs，and reguˉlate metabolism of endothelial cells.This study isto examine the NF-κB activation induced by flow shear stress in vascular endothelial cells.Methods The lysates of primary cultured umbilical vein endothelial cells that untreated and treated with shear stress for10，20，30，60minutes，wereseparated by SDS-PAGE.Semi-dry transfer cell was used to transfer proteins fromSDS-PAGE onto nitrocellulose membrane，then the immunoblotting density of IκBαand phospho-IκBαwere determined by Western blot.The primary cultured umbilicalvein endothelial cells that were culˉtured on slides were fixed with4%paraformaldehyde.Then the NF-κB p65immunocytofluorescent staining were perˉformed.Results Western blot of the primary cultured vascular endothelial cell lysates showed that a markedly inˉcreased density of P-IκB blot occurred at10minutes of exposure of the cells to4.2dyne/cm 2 flow shear stress and density of the blot dramatically dropped down after60minutes of exposure.Coincidence with that，the density of IκB blot dropped down after30minutes.NF-κB p65immunocytofluorescent staining of the primary cultured vascular enˉdothelial cells showed that when treated with4.2dyne/cm 2 flow shear stress for0.5or1hours，the cell nuclei became staining，after1.5or2hours，the staining was very strong.Conclusion This study suggests that shear stress can inˉduce NF-κB activation in vascular endothelial cells.
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Key words gene transcriptional factor NF-κB shear stress activation
业已证实，NF-κB激活通路存在于血管内皮细胞和平滑肌细胞中。且多种因素可激活NF-κB。血管内皮细胞在血液与血管壁之间充当着“感受器”和“传导器”角色 [1] ，可分泌多种趋化和粘附分子 [2] ，这些分子在白细胞附着、浸润和迁移于血管的过程中起重要作用 [1] 。新近研究显示表达这些分子之基因都含有NF-κB结合位点，即血管内皮细胞受到外源因素刺激后，激活NF-κB，后者与这些分子基因的反应元件结合，促使其表达上调。故NF-κB被认为是血管内皮细胞受损的始动机制之一。本研究欲用层流 ˇ 基金项目:CMB资助项目(98-681)，国家自然科学基金资助项目(39830110，39970293) 低切应力刺激脐静脉血管内皮细胞，并检测其NF-κB的活化。
, http://www.100md.com 1 材料和方法
1.1 材料 M199细胞培养基、Ⅱ型胶原酶、胎牛血清、封闭用羊血清均购自Gibco BRL公司(USA)。新生小牛血清为成都市华星生物制品厂产品。硝酸纤维素膜由上海华舜生物有限公司生产。IκBα和磷酸化IκBα免疫印迹试剂盒为New Engl Biolabs公司(Britain)产品。兔抗人NF-κB p65多克隆抗体为Santa Cruz Biotechnology Inc公司(USA)产品。生物素标记的羊抗兔第二抗体和荧光素标记的链霉亲和素为DAKO公司(Denmark)产品。其余试剂为进口及国产分析纯。垂直电泳仪及半干电转移仪(Semidry transfer cell)均购自BIO RAD公司(USA)。
1.2 方法
1.2.1 内皮细胞培养及切应力刺激 细胞培养及切应力刺激。原代培养的人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)，取自健康产妇分娩的新鲜脐带，用0.1%胶原酶消化分离后，培养于M199完全培养基，内含20%胎牛血清、青霉素100U/ml和链霉素100μg/ml。细胞长灌培养瓶底部后接种于载玻片上，待细胞融合铺满后，将其置于平行板流动装置流室中，循环泵入细胞培养液，控制层流切应力为4.2dyne/cm 2 。分别处理内皮细胞10、20、30、60、90和120min，未处理细胞作为对照，收集细胞用于下述的各种检测。所有实验步骤均严格消毒防止污染。
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1.2.2 IκBα和磷酸化IκBα免疫印迹 滴加1×SDS加样缓冲液150μl于单层生长的原代培养内皮细胞上，然后将其刮入EP管内，超声处理15s，100℃煮沸5min，4℃离心5min后，收集上清。紫外分光光度仪测定后稀释各样品总蛋白浓度相等。SDS-PAGE小胶30mA恒流电泳。半干电转移仪将蛋白转移于硝酸纤维素膜上。按photope R○HRP Westˉern Detection试剂盒说明书进行免疫印迹，即室温下5%牛血清白蛋白封闭1h，兔抗人IκBα或磷酸化IκBα一抗(1∶1000)4℃孵育过夜，辣根过氧化物酶标记的二抗(1:2000)室温下孵育1h，加入发光底物，X线片感光，显影。
1.2.3 免疫荧光细胞化学染色 将生长于载玻片的原代培养内皮细胞用4%多聚甲醛固定20min，5%羊血清工作液封闭20min，然后分别孵育于兔抗人NF-κB p65多克隆抗体(1∶100)1h，生物素标记的羊抗兔二抗(1∶300)45min和荧光素标记的链霉亲和素(1∶100)15min，最后用50%碱性缓冲甘油封片，荧光显微镜观察。为排除切应力刺激过程中细菌LPS污染因素的影响，将用于切应力刺激2h的细胞培养液收集，并用其孵育接种于载玻片上的原代培养内皮细胞0.5、1、1.5、2h，然后行NF -κB p65免疫荧光细胞化学染色，明确用于刺激后的细胞培养液是否可活化NF-κB，从而排除污染因素导致NF-κB活化。
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2 结果
2.1 原代培养血管内皮细胞IκBα或磷酸化IκBα免疫印迹结果 原代培养血管内皮细胞裂解物免疫印迹结果显示，切应力刺激10min后磷酸化IκB增强，60min后降至测不到。相应地IκB随刺激时间的延长而逐渐降低，30min降至测不到(图1)。结果提示切应力刺激可诱导人血管内皮细胞IκB的磷酸化和降解。图1 原代培养血管内皮细胞IκBα或磷酸化IκBα免疫印迹结果
2.2 原代培养血管内皮细胞NF-κB p65免疫荧光细胞化学染色结果 NF-κB p65免疫荧光细胞化学染色显示，未处理的内皮细胞胞浆染色阳性，胞核染色阴性(图2A)。当切应力刺激0.5、1h后胞核染色阳性(图2B，C)，1.5、2h后胞核染色强阳性(图2D，E)，提示切应力刺激后NF-κB向核内转移。将用于切应力刺激2h的细胞培养液收集，并用其孵育接种于载玻片上的血管内皮细胞，显示细胞核染色均阴性(图略)，说明NF-κB的核转移并非污染因素导致。图2 NF-κB p65免疫荧光细胞化学染色观察切缨力处理的原代培养内皮细胞NF-κB核转移对照(A);切应力刺激0.5h(B)，1h(C)，1.5h(D)，2h(E)600×
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3 讨论
血管内皮为血管内壁的单层细胞，与血液密切接触。流经整个血管网的脉冲血流产生生物机械力，作用于血管 壁，调节其功能变化[3] 。这些血流机械力包括流体静压力，环状张力，伸展力，以及层流和非层流管壁摩擦力 [4]。切应力被定义为血流与内皮的粘性阻力，即为血流动力学的切线性力，主要作用于内皮细胞，通过机械传导过程，内皮细胞转换机械刺激为生物化学信号 [5] ，调节内皮细胞的功能。且已有的文献报道切应力可上调许多基因表达 [6] 。本研究报道低切应力可诱导原代培养脐静脉血管内皮细胞NF-κB活化。
NF-κB最常见的是以p50和p65二聚体形式存在于胞浆内，并与抑制因子IκB结合，以无活性的形式存在于胞浆内。当细胞受到刺激后，IκB磷酸化并降解 [7] ，使p50和p65转移于核内并结合于特定的DNA序列，诱导基因转录激活 [8] 。Lan等用于EMSA方法发现切应力可激活NF-κB，并与特定的核苷酸序列作用 [9] 。
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基于对目前NF-κB活化机制的理解，目前已发展出多种生物化学、免疫化学和免疫组化检测方法测定NF-κB的活化。本研究对切应力处理的人原代培养脐静脉血管内皮细胞裂解物，行IκBα和磷酸化IκBα免疫印迹检测法。发现层流切应力刺激可诱导人脐静脉血管内皮细胞IκBα的磷酸化和降解。NF-κB p65免疫荧光细胞化学染色发现，层流切应力诱导人脐静脉血管内皮细胞NF-κB核转移。本研究提示层流切应力刺激血管内皮细胞NF-κB活化，调节特定的基因的表达，参与动脉粥样硬化的发生和发展。
参考文献
1 李建军，李庚山.NF-κB与心血管疾病.国外医学·分子生物学 分册，1999，21:123-126.
2 Liao F，Andalibi A，C deBeer FC，et al.Genetic control of inflammatory gene induction and NF-κB-like transcription factor activation in reˉsponse to an atherogenic diet in mice.J Clin Invest，1993，91:2572-2579.
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3 Davies PF.Haemodynamic influences on vascular remodelling.Trnasˉplant Immunol，1997，5:243-248.
4 Ku DN.Blood flow in arteries.Annu Rev Fluid Mech，1997，29(2):399-403.
5 Chien S，Li S，Shyy JYJ.Effects of mechanical forces on signal transducˉtion and gene expression in endothelial cells.Hypertension，1998，31(part2):162-169.
6 Davies PF，Barbee KA，Volin MV，et al.Spatial relationships in early sinaling events of flow-mediated endothelial mechanotransduction.Anˉnu Rev Physol，1997，59(5):527-540.
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7 Liechanover A.The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway.Cell，1994，79:13-21.
8 May MJ，Ghosh S.Signal transduction through NF-κB.Immunol Toˉday，1998，19(2):80-88.
9 Lan Q，Mercurius KO，Davies PF.Stimulation of transcription factor NF-κB and AP-1in endothelial cells subjected to shear stress.Biochem Biophys Res Commun，1994，201:950-956.
作者单位:1100730首都医科大学附属北京同仁医院心脏中心
2610041四川大学华西医学中心基础医学院
(编辑晓 勇), 百拇医药(梁 峰 胡大一 吴明营 李田昌 汤楚中 刘梅林)