SARS冠状病毒模型猴的抗体消长
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中华中西医杂志 2003年7月 第4卷 第14期
【摘要】 目的 观察SARS冠状病毒感染中国恒河猴后，冠状病毒抗体在动物体内的动态变化过程，为评价疫苗效果提供检测指标。方法 用从我国SARS病人分离经Vero-E6细胞培养扩增的SARS冠状病毒，经过鼻腔接种10只恒河猴和10只食蟹猴。定期采血，分离血清，检测其血清IgG和IgM抗体滴度。结果 接种病毒后的前8天，SARS冠状病毒血浆抗体呈阴性，与人类SARS病人检测结果相似 [1，2] 。12/20的动物在接种病毒8～14天后抗体呈阳性，16/18在15～21天阳性，14/16在22～35天呈阳性，36天后，10/10动物呈阳性，SARS动物模型猴抗体总阳性率为80%。结论 用恒河猴制作的SARS冠状病毒的动物模型进行疫苗和药效评价，其抗体消长情况可作为药物筛选、疫苗评价的重要指标。
关键词 SARS冠状病毒 动物模型血清抗体滴定
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)14-2081-03
, 百拇医药
Observation on dynamic of SARS antibody in experimental
infection of SARS coronavirus on rhesus monkey
Tu Xinming，Gao Hong，Wei Qiang，et al.
Institute of Laboratory Animal Science，CAMS and PUMC，Beijing100021.
【Abstract】 Objective To observe on dynamic of SARS antibody in experimental infection of SARS coronˉavirus on Rhesus monkey.Methods The SARS coronavirus isolated from SARS patient with Vero-E6cells，inocuˉlate into Chinese Rhesus monkeys and cynomolgus monkeys.Then detect antibody timely.Results SARS coronavirusspecial IgG and IgM antibody in both kind of monkeys were detected to be positive9days past-infection.It is similar to human SARS disease.Conclusion SARS Coronavirus was infectious to Chinese Rhesus monkeys as a model，It can help evaluatethe efficacy of SARS vaccines using the antibody titer.
, 百拇医药
Key words SARS coronavirus animal model sera-antibody titration
非典型肺炎是由一种崭新的病毒所致。冠状病毒(Corona Virus)是导致感冒的主要病原。1965年，人类首次确认冠状病毒能令人类出现感冒。其他冠状病毒，多数只存活在猪、牛、鸡等禽畜及哺乳类动物身上。本次出现的新型变种病毒，除了在人体内繁殖外，亦会使免疫系统出现强烈反应，伤害自身组织，出现淋巴细胞、白细胞、血小板减少，肝脏酶和肌酸激酶升高。
为检验疫苗效果，在P3实验室进行病毒攻击实验，即用SARS病毒攻击注射了疫苗的实验动物，如果注射了疫苗的动物能抵抗SARS病毒的攻击，说明获得的疫苗是有效的。评价疫苗效果的指标有许多，如:中和抗体、CTL反应、特异性IgG抗体等，SARS抗体检测方法很多 [3] ，有ELISA、IFA、WB等。本文仅将在建立模型和进行疫苗免疫过程中，动物体内IgG抗体和IgM的产生结果及相关性分析如下。
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1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 SARS毒株和疫苗
基金项目:国家“十五”863项目(编号:2003AA208205，2003AA208213)
通讯作者:中国医学科学院教授，博士生导师 Email:Chuangqin@vip.sina.com
1.1.1.1 CDC毒株 由中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所提供，分离自SARS病人，在Vero-E6细胞上培养传代，经RT-PCR和电镜形态观察确定为SARS冠状病毒。病毒TCID 50 为10 6 pfu/ml。
1.1.1.2 协和毒株 由中国医学科学院协和医院分离自SARS病人，在Vero-E6细胞上培养传代，经RT-PCR和电镜形态观察确定为SARS冠状病毒。
, 百拇医药
1.1.1.3 疫苗 科兴公司提供灭活全病毒疫苗。
1.1.2 动物 中国恒河猴、食蟹猴各10只:13月龄，雌性和雄性比例为2∶5，由中国医学科学院医学生物学研究所提供。接种前按实验用猴国家标准微生物SPF级进行复检，并检查SARS病毒抗体，检测结果无SRV、STLV-1、SIV、B病毒及SARS病毒抗体。
1.1.3 试剂 SARS冠状病毒IgG、IgM ELISA试剂盒，北京华大吉比爱生物技术有限公司提供。
1.2 方法
1.2.1 病毒接种 经鼻腔接种，病毒接种量为:1ml，含10 6 TCID 50 ，和1ml，含10 5TCID 50 。所有动物实验均按《实验动物所实验动物使用及实验规程》在SARS专用P3动物实验室中进行。
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1.2.2 疫苗免疫 疫苗经肌肉注射免疫。
1.2.3 抗体检测 SARS冠状病毒接种后，在不同的时间点，静脉采血分离血清，-80℃下保存备用。血清SARS冠状病毒特异性抗体(IgG、IgM)检测采用“SARS冠状病毒IgG、IgM抗体诊断试剂盒(酶联免疫法)”(北京华大吉比爱生物技术有限公司)。具体操作按说明书进行。
2 结果
2.1 SARS抗体阳性率 见表1。
表1 SARS抗体阳性率
2.2 IgM抗体与IgG抗体之间的关系 见表2。
表2 IgM抗体与IgG抗体之间的关系
由上表可知，IgG滴度与IgM滴度不成正比例关系，同时我们发现，IgG阳性，IgM可能是阳性，也可能是阴性;但IgG是阴性的，IgM也是阴性。IgG与IgM出现时间基本一致，9天后才能检出IgG和IgM抗体。IgM维持时间较IgG时间短。见图1。
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图1 IgM抗体与IgG抗体之间的关系
2.3 不同品种猴感染SARS冠状病毒后抗体产生情况比较 见表3。
表3 恒河猴与食蟹猴抗体产生的比较(平均滴度) 恒河猴产生抗体滴度较食蟹猴高，下降时间快，食蟹猴产生抗体上升较慢，但可长时间维持在一定的水平。见图2。
图2 恒河猴与食蟹猴抗体产生的比较
2.4抗体产生与毒株、疫苗之间的关系 见表4。表4 抗体产生与毒株、疫苗之间的关系
疫苗使动物产生抗体稳定上升，维持较高水平时间长;协和毒株产生抗体上升快，然而下降的也快，CDC毒株抗体上升慢，下降也慢。见图3。
图3 抗体产生与毒株、疫苗之间的关系
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从上图可知，抗体达高峰时间与病毒的免疫原性有关，活病毒使动物产生抗体较早达到高峰，而疫苗使动物产生抗体达高峰的时间较迟。
抗体开始下降时间与抗体达高峰的时间有关，一般情况下，抗体达高峰后，随即开始下降。但疫苗在抗体达高峰后，要维持一段时间才下降。
3 讨论
(1)抗体产生与毒种来源有关。CDC毒株与协和毒株相比，协和毒株使个别猴产生抗体水平高(1:640)，个别动物产生抗体时间早为7天(材料未列出)，CDC毒株使猴产生抗体水平为1∶320，产生抗体时间在第9天，并使2只猴无抗体产生。(2)抗体产生与接种次数有关。多次接种同一病毒，可使猴产生高滴度抗体。(3)病毒较疫苗更易使试验猴产生抗体。但疫苗产生的抗体维持时间长。(4)两批实验猴中，有3只动物始终没有抗体产生，既无IgG抗体，又无IgM抗体。(5)血清病毒特异性抗体在接种病毒10天以上者阳性率高，因此，在临床上抗体检测有助于确立发病10天以上SARS的血清学诊断。(6)抗体产生时间:我们用同样的毒株进行建模，第一批猴开始产生抗体的最早时间为第9天，抗体平均滴度为1∶10，第2批猴开始产生抗体的最早时间为第7天，平均滴度为1∶50(材料未列出)，由此可知，抗体产生及抗体滴度与动物个体有关。(7)抗体最高滴度与检测方法及试剂盒有关，用北京华大吉比爱生物技术有限公司提供的ELISA试剂盒检测SARS模型猴的IgG最高滴度为1∶640～1280之间。(8)用ELISA方法检测SARS病毒IgG、IgM抗体时，判定IgG、IgM阳性结果的临界值是不同的 [4] 。我们用北京华大吉比爱生物技术有限公司提供的 ELISA试剂盒进行检测时，其判定阳性结果的临界值是不同的。
, 百拇医药
参考文献
1 Wang YS，Shen H，Sun SH，et al.Analysis of false-positive associated withantibody tests for SARS-CoV in SLE patients.Shi Yan Sheng Wu Xue Bao，2003，36(4):314-317.
2 Xu G，Lu H，Li J，et al.Primary investigation on the changing mode of plasma specific IgG antibody in SARS patients and their physicians and nurses.Beijing Da Xue Xue Bao，2003，35(Suppl):23-25.
3 Che XY，Qiu LW，Pan YX，et al.Rapid and efficient preparation of monoclonal antibodies against SARS-associated coronavirus nucleocapˉsid protein by immunizing mice.Di Yi Jun Yi Da Xue Xue Bao，2003，23(7):640-642.
4 Fang LQ，Zhang PH，Yang BA，et al.The application of indirect immuno-fluorescence assay in the diagnosis of severe acute respiratory synˉdrome.Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi，2003，24(6):484-486.
作者单位:100021中国医学科学院实验动物研究所
(编辑秋 实), http://www.100md.com(涂新明)
关键词 SARS冠状病毒 动物模型血清抗体滴定
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)14-2081-03
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Observation on dynamic of SARS antibody in experimental
infection of SARS coronavirus on rhesus monkey
Tu Xinming，Gao Hong，Wei Qiang，et al.
Institute of Laboratory Animal Science，CAMS and PUMC，Beijing100021.
【Abstract】 Objective To observe on dynamic of SARS antibody in experimental infection of SARS coronˉavirus on Rhesus monkey.Methods The SARS coronavirus isolated from SARS patient with Vero-E6cells，inocuˉlate into Chinese Rhesus monkeys and cynomolgus monkeys.Then detect antibody timely.Results SARS coronavirusspecial IgG and IgM antibody in both kind of monkeys were detected to be positive9days past-infection.It is similar to human SARS disease.Conclusion SARS Coronavirus was infectious to Chinese Rhesus monkeys as a model，It can help evaluatethe efficacy of SARS vaccines using the antibody titer.
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Key words SARS coronavirus animal model sera-antibody titration
非典型肺炎是由一种崭新的病毒所致。冠状病毒(Corona Virus)是导致感冒的主要病原。1965年，人类首次确认冠状病毒能令人类出现感冒。其他冠状病毒，多数只存活在猪、牛、鸡等禽畜及哺乳类动物身上。本次出现的新型变种病毒，除了在人体内繁殖外，亦会使免疫系统出现强烈反应，伤害自身组织，出现淋巴细胞、白细胞、血小板减少，肝脏酶和肌酸激酶升高。
为检验疫苗效果，在P3实验室进行病毒攻击实验，即用SARS病毒攻击注射了疫苗的实验动物，如果注射了疫苗的动物能抵抗SARS病毒的攻击，说明获得的疫苗是有效的。评价疫苗效果的指标有许多，如:中和抗体、CTL反应、特异性IgG抗体等，SARS抗体检测方法很多 [3] ，有ELISA、IFA、WB等。本文仅将在建立模型和进行疫苗免疫过程中，动物体内IgG抗体和IgM的产生结果及相关性分析如下。
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1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 SARS毒株和疫苗
基金项目:国家“十五”863项目(编号:2003AA208205，2003AA208213)
通讯作者:中国医学科学院教授，博士生导师 Email:Chuangqin@vip.sina.com
1.1.1.1 CDC毒株 由中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所提供，分离自SARS病人，在Vero-E6细胞上培养传代，经RT-PCR和电镜形态观察确定为SARS冠状病毒。病毒TCID 50 为10 6 pfu/ml。
1.1.1.2 协和毒株 由中国医学科学院协和医院分离自SARS病人，在Vero-E6细胞上培养传代，经RT-PCR和电镜形态观察确定为SARS冠状病毒。
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1.1.1.3 疫苗 科兴公司提供灭活全病毒疫苗。
1.1.2 动物 中国恒河猴、食蟹猴各10只:13月龄，雌性和雄性比例为2∶5，由中国医学科学院医学生物学研究所提供。接种前按实验用猴国家标准微生物SPF级进行复检，并检查SARS病毒抗体，检测结果无SRV、STLV-1、SIV、B病毒及SARS病毒抗体。
1.1.3 试剂 SARS冠状病毒IgG、IgM ELISA试剂盒，北京华大吉比爱生物技术有限公司提供。
1.2 方法
1.2.1 病毒接种 经鼻腔接种，病毒接种量为:1ml，含10 6 TCID 50 ，和1ml，含10 5TCID 50 。所有动物实验均按《实验动物所实验动物使用及实验规程》在SARS专用P3动物实验室中进行。
, http://www.100md.com
1.2.2 疫苗免疫 疫苗经肌肉注射免疫。
1.2.3 抗体检测 SARS冠状病毒接种后，在不同的时间点，静脉采血分离血清，-80℃下保存备用。血清SARS冠状病毒特异性抗体(IgG、IgM)检测采用“SARS冠状病毒IgG、IgM抗体诊断试剂盒(酶联免疫法)”(北京华大吉比爱生物技术有限公司)。具体操作按说明书进行。
2 结果
2.1 SARS抗体阳性率 见表1。
表1 SARS抗体阳性率
2.2 IgM抗体与IgG抗体之间的关系 见表2。
表2 IgM抗体与IgG抗体之间的关系
由上表可知，IgG滴度与IgM滴度不成正比例关系，同时我们发现，IgG阳性，IgM可能是阳性，也可能是阴性;但IgG是阴性的，IgM也是阴性。IgG与IgM出现时间基本一致，9天后才能检出IgG和IgM抗体。IgM维持时间较IgG时间短。见图1。
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图1 IgM抗体与IgG抗体之间的关系
2.3 不同品种猴感染SARS冠状病毒后抗体产生情况比较 见表3。
表3 恒河猴与食蟹猴抗体产生的比较(平均滴度) 恒河猴产生抗体滴度较食蟹猴高，下降时间快，食蟹猴产生抗体上升较慢，但可长时间维持在一定的水平。见图2。
图2 恒河猴与食蟹猴抗体产生的比较
2.4抗体产生与毒株、疫苗之间的关系 见表4。表4 抗体产生与毒株、疫苗之间的关系
疫苗使动物产生抗体稳定上升，维持较高水平时间长;协和毒株产生抗体上升快，然而下降的也快，CDC毒株抗体上升慢，下降也慢。见图3。
图3 抗体产生与毒株、疫苗之间的关系
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从上图可知，抗体达高峰时间与病毒的免疫原性有关，活病毒使动物产生抗体较早达到高峰，而疫苗使动物产生抗体达高峰的时间较迟。
抗体开始下降时间与抗体达高峰的时间有关，一般情况下，抗体达高峰后，随即开始下降。但疫苗在抗体达高峰后，要维持一段时间才下降。
3 讨论
(1)抗体产生与毒种来源有关。CDC毒株与协和毒株相比，协和毒株使个别猴产生抗体水平高(1:640)，个别动物产生抗体时间早为7天(材料未列出)，CDC毒株使猴产生抗体水平为1∶320，产生抗体时间在第9天，并使2只猴无抗体产生。(2)抗体产生与接种次数有关。多次接种同一病毒，可使猴产生高滴度抗体。(3)病毒较疫苗更易使试验猴产生抗体。但疫苗产生的抗体维持时间长。(4)两批实验猴中，有3只动物始终没有抗体产生，既无IgG抗体，又无IgM抗体。(5)血清病毒特异性抗体在接种病毒10天以上者阳性率高，因此，在临床上抗体检测有助于确立发病10天以上SARS的血清学诊断。(6)抗体产生时间:我们用同样的毒株进行建模，第一批猴开始产生抗体的最早时间为第9天，抗体平均滴度为1∶10，第2批猴开始产生抗体的最早时间为第7天，平均滴度为1∶50(材料未列出)，由此可知，抗体产生及抗体滴度与动物个体有关。(7)抗体最高滴度与检测方法及试剂盒有关，用北京华大吉比爱生物技术有限公司提供的ELISA试剂盒检测SARS模型猴的IgG最高滴度为1∶640～1280之间。(8)用ELISA方法检测SARS病毒IgG、IgM抗体时，判定IgG、IgM阳性结果的临界值是不同的 [4] 。我们用北京华大吉比爱生物技术有限公司提供的 ELISA试剂盒进行检测时，其判定阳性结果的临界值是不同的。
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参考文献
1 Wang YS，Shen H，Sun SH，et al.Analysis of false-positive associated withantibody tests for SARS-CoV in SLE patients.Shi Yan Sheng Wu Xue Bao，2003，36(4):314-317.
2 Xu G，Lu H，Li J，et al.Primary investigation on the changing mode of plasma specific IgG antibody in SARS patients and their physicians and nurses.Beijing Da Xue Xue Bao，2003，35(Suppl):23-25.
3 Che XY，Qiu LW，Pan YX，et al.Rapid and efficient preparation of monoclonal antibodies against SARS-associated coronavirus nucleocapˉsid protein by immunizing mice.Di Yi Jun Yi Da Xue Xue Bao，2003，23(7):640-642.
4 Fang LQ，Zhang PH，Yang BA，et al.The application of indirect immuno-fluorescence assay in the diagnosis of severe acute respiratory synˉdrome.Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi，2003，24(6):484-486.
作者单位:100021中国医学科学院实验动物研究所
(编辑秋 实), http://www.100md.com(涂新明)