用于新型种植体实验研究的成骨细胞的体外培养
【摘要】 目的 为研究一种新型种植体对成骨细胞生长、增殖和分化的影响，进行成骨细胞的体外培养，为实验提供足够的成骨细胞。方法 取SD胎鼠颅盖骨组织，用组织块法培养原代成骨细胞，并对培养细胞进行鉴定、纯化和扩增传代。结果 细胞组织化学感染ALP阳性，早期检测到细胞分泌一定量ALP，细胞放射免疫定量分析可检测到一定量的BGP。结论 本实验所获得的细胞为成骨细胞，且纯度较高，活性较好。
关键词 成骨细胞 碱性磷酸酶 骨钙素 种植体
【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2003)17-1557-02
Culture of osteoblasts to be used in the experiment study of
a novel implant in vitro
, http://www.100md.com
Zhao Deping，Tan Xiaobing，Wu Enge，et al.
Clinical Medical Experiment Center，the First Affiliated Hospital of KunmingMedical College，Kunming650032.
【Abstract】 Objective To investigate the effect of a novel implant on the grwoth，proliferation and differentiaˉtion of osteoblasts，primary osteoblasts were cultured in vitro to provide enough cells forthe investigation.Methods Primary osteoblasts were derived from SD fetal rats’calvaria.The cells were identified，purified and passaged.Results ALP stain was positive.Some quantities of ALP and osteocalcin were observed.Conclusion The cells we obtained in this study were osteoblasts which had higher purity and better cell activity.
, http://www.100md.com
Key words osteoblasts alkaline phosphatase osteocalcin implant
近年来新型陶瓷的发展十分迅速，并逐渐应用于口腔医学领域。氧化锆增韧的复合生物陶瓷(ZrO 2 Reinforced Compound Bioceramics，ZrO 2 -CBC)是我们最近研制的一种新型生物陶瓷，主要用作牙科种植体修复牙齿缺失。为研究此种植体对成骨细胞生长的影响，本实验以SD胎鼠的颅盖骨组织为来源培养原代成骨细胞，并鉴定、纯化和传代所培养细胞，为实验提供足够成骨细胞。
1 材料和方法
1.1 主要材料 DMEM培养基(Gibco公司)，特级小牛血清(杭州四季青公司)，胰蛋白酶(Gibco，1∶300)，碱性磷酸酶测定(NAP细胞化学染色法)试剂盒(上海太阳生物技术公司)，骨钙素放射免疫分析试剂盒(天津协和医药科技有限公司)，碱性磷酸酶试剂盒(中生北控生物科技公司)，超净工作台，CO 2 孵箱，倒置相差显微镜(Olympus)，全自动生化分析仪(Olympus2700型)。
, http://www.100md.com
1.2 原代成骨细胞的培养、纯化及传代
1.2.1 材料 SD临产孕鼠(云南省天然药物药理重点实验室提供)，DMEM培养液(100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素，15%灭活小牛血清)。
1.2.2 方法 SD孕鼠脱颈处死，在75%乙醇中消毒2min，取出置于消毒培养皿中。无菌操作下打开孕鼠腹腔，取出子宫内胎鼠，取其颅盖骨组织，剥离内、外骨膜，去除附着结缔组织等，生理盐水冲洗3次，煎成1mm～2mm大小碎块，弯头吸管接种于培养瓶壁，反转培养瓶，加入3ml完全DMEM液，37.5℃，5%CO 2 孵箱中培养。2h后翻转培养 瓶继续培养。2～3d显微镜下可见细胞游出并贴壁生长。4～5d时丢弃脱壁组织块及旧液，加入适量消化液，镜下观察细胞收缩变圆时，中止消化，吹打形成单细胞悬液，移入离心管内离心(800r/min，2min)，倒去上清，加入2ml完全DMEM液，吹打后接种到培养瓶内，CO 2 孵箱内继续培养。纯化:细胞传代时，酶消化将先脱壁的细胞部分(主要是成纤维细胞)弃去，用剩余的贴壁细胞进行消化传代。重复上述操作2～3次。
, 百拇医药
1.3 成骨细胞的鉴定
1.3.1 形态学观察 每天在倒置显微镜下观察细胞形态变化及生长情况，并于原代及传代培养1、3、5、7d拍照。
1.3.2 碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)染色 取12 片盖玻片(11mm×9mm)，表面涂层多聚赖氨酸，38℃干燥后消毒。12孔培养板内每孔各放1片，再分别接种2ml、4×10 4 /ml第3代成骨细胞悬液，CO 2 孵箱内培养。3d后吸去原液，0.01%PBS清洗3遍，4%多聚甲醛固定，4℃冰箱过液。第2d按照ALP测定试剂盒说明对固定好的细胞标本进行染色并拍照。
1.3.3 ALP含量的测定 12孔培养板内接种成骨细胞(方法同上)。CO 2 孵箱内培养。1、5、10、15d时按以下方法分别处理3孔:每孔加入1ml消化液作用5min，再加入1ml完全DMEM终止消化，充分吹打后每孔再加入100μl Triton-X100(1%)，混匀后移入已编好号的小瓶中，-20℃保存。同时4个25ml细胞培养瓶内分别接种2ml、5.0×10 5 /ml第3代成骨细胞悬液，加入适量DMEM培养，根据细胞代谢情况补液，不要换液。分别在1、5、10、15d收集瓶内上清液于已编好号小瓶中。全自动生化分析仪检测两批样本的ALP含量(由昆明医学院第一附属医院检验科完成)。
, 百拇医药
1.3.4 骨钙素(Osteocalcin，OC)放射免疫学分析 12孔培养板的8孔分别接种2ml、4×10 4 /ml第3代成骨细胞悬液(实验组)，另4孔加入2ml无细胞完全DMEM液(空白对照组)，CO 2 孵箱培养。24h后吸去原液，加入等量新鲜无血清DMEM液，继续培养3d后收集上清，骨钙素放免试剂盒测定OC含量(昆明医学院第一附属医院核医学科)。
1.4 成骨细胞生长曲线的测绘 取21个10ml培养瓶，每瓶分别接种3ml、2×10 4 /ml的第3代成骨细胞悬液，CO 2 孵箱内培养7d。每天消化3瓶细胞，计数细胞浓度(每瓶重复计数3次，求平均值，再取3瓶的平均值作为最终值)。以培养时间(d)为横坐标，细胞浓度(×10 4 /ml)为纵坐标作图，即为细胞的生长曲线。
1.5 统计学处理 SPSS统计软件包(11.5版)。
, 百拇医药
2 结果
2.1 细胞形态观察 图1、2示培养初期组织块边缘爬出生长的细胞为长梭形，贴壁生长;随培养时间延长，细胞逐渐变为三角形或四方形，核圆，体积大，并出现融合生长，呈层叠排列，有的呈集落样生长，并在23d时形成钙化结节(图3)。
2.2 细胞ALP染色 碱性磷酸酶染色阳性是成骨细胞的特征，是鉴定成骨细胞的重要证据。图4示细胞胞浆内棕色小颗粒即为ALP染色颗粒。
2.3 细胞ALP含量的测定 图1、2显示培养细胞在早期就表达并向胞外分泌一定量的ALP，ALP水平随培养时间而升高，15d的值最大。
2.4 骨钙素放免分析结果 骨钙素在成骨细胞分化过程中表达较晚，是成骨细胞最具特征性的标志物。图3显示实验组细胞培养3d后向胞外分泌一定量的OC，对照组仅有极少量OC。两组间差异有显著性(成组t检验，P<0.01)。
, 百拇医药
2.5 成骨细胞的生长曲线 见图4。细胞生长曲线是观测细胞在一代生存期内增生过程的重要指标，是细胞生物学特性指标之一。图4可见成骨细胞数量逐渐增加，1d～3d为指数增殖期，细胞呈倍数增长，3d～6d进入平台期，细胞数基本稳定，7d时细胞又倍增。
3 讨论
成骨细胞原代培养时，取材范围比较广泛，国内外很多学者均成功地以多种动物及人体的骨组织、骨膜及骨髓为原料培养出了成骨细胞 [1～4] 。胎鼠颅盖骨正处于生长发育期，基质沉积尚未开始 [5] ，取材容易，技术成熟，比较经济，故本实验采用SD胎鼠的颅盖骨为原料，组织块法培养原代成骨细胞。成骨细胞又名骨母细胞。由间叶质干细胞分化而来，在分化过程中能序列表达Ⅰ型胶原、碱性磷酸酶(ALP)和骨钙素，然后是矿物的沉积 [6] 。成骨细胞能合成Ⅰ型胶原，表达骨钙素和骨桥蛋白(Osteopontin)，在条件培养基中能形成钙化结节(Von Kossa染色阳性)等重要特征。长期以来我们将这些特征作为成骨细胞鉴定的证据，称为成骨细胞的表型标志 [7] 。本实验培养的细胞在培养早期从组织块边缘爬出生长时为长梭形，贴壁生长。随着培养时间的延长，细胞逐渐变成立方形或多角形，并形成钙化结节，形态学上 符合大多数学者的观察结果[2，8，9] 。细胞组织化学染色显示ALP染色阳性，早期能检测到细胞分泌一定量ALP，放免分析结果显示细胞能分泌一定量的骨钙素，这些充分证明本实验所培养细胞为成骨细胞。
, 百拇医药
我们用二次消化法纯化成骨细胞。细胞传代时，先加入少量消化液初次消化，1min后弃去消化液。因成纤维细胞贴壁能力较成骨细胞弱，初次消化脱落下来的主要是成纤维细胞，二次消化时脱落下来的才是成骨细胞。
细胞成分混杂的培养物在生长过程中，所占比例大、生命力旺盛、增殖能力强的细胞会表现优势增长，能抑制培养物中其它生命力弱、比例较小、增殖力差的细胞。通过长期培养或传代培养，处于弱势的细胞成分将逐渐淘汰 [8] 。本法培养第3代时就得到较纯的成骨细胞，且细胞活性较好，因活性较差的成骨细胞贴壁不牢固，初次消化时就脱落，二次消化时贴壁的就是活性较好的成骨细胞。
近年来成骨细胞在口腔医学领域逐渐受到重视和应用。种植体植入体内后，成骨细胞是主要的骨组织形成细胞，用成骨细胞来评价种植材料的生物相容性更为可靠 [10] 。种植体与周围组织的骨形成是一个非常复杂的过程，种植体松动、脱落的主要原因就是种植体-骨界面的失败，其影响因素是多方面的，而周围组织中的成骨细胞能否迁移、粘附并生长到种植体表面对种植体-骨界面的形成具有至关重要的作用。因此，建立一种成熟可靠的成骨细胞体外培养的方法，用以评价种植体的生物相容性就显得十分必要。(本文图见附页1、2)
, 百拇医药
参考文献
1 李德华，刘宝林.人胚成骨细胞体外培养三维实验模型的建立.实用口腔医学杂志，2000，16(2):99-101.
2 唐昭，陈治清.大鼠成骨细胞体外培养的研究.华西口腔医学杂志，1997，15(1):70-72.
3 Holzer Gerold，EinhornThomas A，Majeska Robert J，Estrogen regulation of growth and alkaline phosphatase expression by cultured human bone marrow stromal cells.Journal of orthopaedic research，2002，20(2):281-288.
4 Yeh Lee-Chuan C，Zavala Michelle C，Lee John C.Osteogenic protein-1and interleukin-6with its soluble receptor synergistically stimulate rat osteoblastic cell differentiation.Journal of cellular physiology，2002，190(3):322-331.
, 百拇医药
5 Ho ML，Chang JK，Chuang LY，et al.Characteristics of primary osˉteoblast culture derived from rat fetal calvaria.Kaohsiung J Med Sci，1999，15(5):248-255.
6 Nishiya Y，Kosaka N，Uchii M，et al.A potent1，4-dihydropyridine L-type calcium channel blocker，benidipine，promotes osteoblast differˉentiation.Calcified tissue international，2002，70(1):30-39.
7 张立海，张其清.骨组织工程中成骨细胞与细胞因子的研究.中国医学科学院学报，2001，3(6):631-637.
8 薛庆善.体外培养的原理与技术，北京:科学出版社，2001.
9 司徒镇强，吴军正.细胞培养，西安:世界图书出版社西安公司，1996.
10 夏大弘.成骨细胞体外培养在种植体相关研究中的应用.国外医学·口腔医学分册，2001，28(2):73-75.
作者单位:1650032昆明医学院第一附属医院临床医学实验中心
2650031昆明医学院口腔学院
(编辑使 臻), 百拇医药(赵德萍 谭小兵 吴恩格 贾伟)
关键词 成骨细胞 碱性磷酸酶 骨钙素 种植体
【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2003)17-1557-02
Culture of osteoblasts to be used in the experiment study of
a novel implant in vitro
, http://www.100md.com
Zhao Deping，Tan Xiaobing，Wu Enge，et al.
Clinical Medical Experiment Center，the First Affiliated Hospital of KunmingMedical College，Kunming650032.
【Abstract】 Objective To investigate the effect of a novel implant on the grwoth，proliferation and differentiaˉtion of osteoblasts，primary osteoblasts were cultured in vitro to provide enough cells forthe investigation.Methods Primary osteoblasts were derived from SD fetal rats’calvaria.The cells were identified，purified and passaged.Results ALP stain was positive.Some quantities of ALP and osteocalcin were observed.Conclusion The cells we obtained in this study were osteoblasts which had higher purity and better cell activity.
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Key words osteoblasts alkaline phosphatase osteocalcin implant
近年来新型陶瓷的发展十分迅速，并逐渐应用于口腔医学领域。氧化锆增韧的复合生物陶瓷(ZrO 2 Reinforced Compound Bioceramics，ZrO 2 -CBC)是我们最近研制的一种新型生物陶瓷，主要用作牙科种植体修复牙齿缺失。为研究此种植体对成骨细胞生长的影响，本实验以SD胎鼠的颅盖骨组织为来源培养原代成骨细胞，并鉴定、纯化和传代所培养细胞，为实验提供足够成骨细胞。
1 材料和方法
1.1 主要材料 DMEM培养基(Gibco公司)，特级小牛血清(杭州四季青公司)，胰蛋白酶(Gibco，1∶300)，碱性磷酸酶测定(NAP细胞化学染色法)试剂盒(上海太阳生物技术公司)，骨钙素放射免疫分析试剂盒(天津协和医药科技有限公司)，碱性磷酸酶试剂盒(中生北控生物科技公司)，超净工作台，CO 2 孵箱，倒置相差显微镜(Olympus)，全自动生化分析仪(Olympus2700型)。
, http://www.100md.com
1.2 原代成骨细胞的培养、纯化及传代
1.2.1 材料 SD临产孕鼠(云南省天然药物药理重点实验室提供)，DMEM培养液(100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素，15%灭活小牛血清)。
1.2.2 方法 SD孕鼠脱颈处死，在75%乙醇中消毒2min，取出置于消毒培养皿中。无菌操作下打开孕鼠腹腔，取出子宫内胎鼠，取其颅盖骨组织，剥离内、外骨膜，去除附着结缔组织等，生理盐水冲洗3次，煎成1mm～2mm大小碎块，弯头吸管接种于培养瓶壁，反转培养瓶，加入3ml完全DMEM液，37.5℃，5%CO 2 孵箱中培养。2h后翻转培养 瓶继续培养。2～3d显微镜下可见细胞游出并贴壁生长。4～5d时丢弃脱壁组织块及旧液，加入适量消化液，镜下观察细胞收缩变圆时，中止消化，吹打形成单细胞悬液，移入离心管内离心(800r/min，2min)，倒去上清，加入2ml完全DMEM液，吹打后接种到培养瓶内，CO 2 孵箱内继续培养。纯化:细胞传代时，酶消化将先脱壁的细胞部分(主要是成纤维细胞)弃去，用剩余的贴壁细胞进行消化传代。重复上述操作2～3次。
, 百拇医药
1.3 成骨细胞的鉴定
1.3.1 形态学观察 每天在倒置显微镜下观察细胞形态变化及生长情况，并于原代及传代培养1、3、5、7d拍照。
1.3.2 碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)染色 取12 片盖玻片(11mm×9mm)，表面涂层多聚赖氨酸，38℃干燥后消毒。12孔培养板内每孔各放1片，再分别接种2ml、4×10 4 /ml第3代成骨细胞悬液，CO 2 孵箱内培养。3d后吸去原液，0.01%PBS清洗3遍，4%多聚甲醛固定，4℃冰箱过液。第2d按照ALP测定试剂盒说明对固定好的细胞标本进行染色并拍照。
1.3.3 ALP含量的测定 12孔培养板内接种成骨细胞(方法同上)。CO 2 孵箱内培养。1、5、10、15d时按以下方法分别处理3孔:每孔加入1ml消化液作用5min，再加入1ml完全DMEM终止消化，充分吹打后每孔再加入100μl Triton-X100(1%)，混匀后移入已编好号的小瓶中，-20℃保存。同时4个25ml细胞培养瓶内分别接种2ml、5.0×10 5 /ml第3代成骨细胞悬液，加入适量DMEM培养，根据细胞代谢情况补液，不要换液。分别在1、5、10、15d收集瓶内上清液于已编好号小瓶中。全自动生化分析仪检测两批样本的ALP含量(由昆明医学院第一附属医院检验科完成)。
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1.3.4 骨钙素(Osteocalcin，OC)放射免疫学分析 12孔培养板的8孔分别接种2ml、4×10 4 /ml第3代成骨细胞悬液(实验组)，另4孔加入2ml无细胞完全DMEM液(空白对照组)，CO 2 孵箱培养。24h后吸去原液，加入等量新鲜无血清DMEM液，继续培养3d后收集上清，骨钙素放免试剂盒测定OC含量(昆明医学院第一附属医院核医学科)。
1.4 成骨细胞生长曲线的测绘 取21个10ml培养瓶，每瓶分别接种3ml、2×10 4 /ml的第3代成骨细胞悬液，CO 2 孵箱内培养7d。每天消化3瓶细胞，计数细胞浓度(每瓶重复计数3次，求平均值，再取3瓶的平均值作为最终值)。以培养时间(d)为横坐标，细胞浓度(×10 4 /ml)为纵坐标作图，即为细胞的生长曲线。
1.5 统计学处理 SPSS统计软件包(11.5版)。
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2 结果
2.1 细胞形态观察 图1、2示培养初期组织块边缘爬出生长的细胞为长梭形，贴壁生长;随培养时间延长，细胞逐渐变为三角形或四方形，核圆，体积大，并出现融合生长，呈层叠排列，有的呈集落样生长，并在23d时形成钙化结节(图3)。
2.2 细胞ALP染色 碱性磷酸酶染色阳性是成骨细胞的特征，是鉴定成骨细胞的重要证据。图4示细胞胞浆内棕色小颗粒即为ALP染色颗粒。
2.3 细胞ALP含量的测定 图1、2显示培养细胞在早期就表达并向胞外分泌一定量的ALP，ALP水平随培养时间而升高，15d的值最大。
2.4 骨钙素放免分析结果 骨钙素在成骨细胞分化过程中表达较晚，是成骨细胞最具特征性的标志物。图3显示实验组细胞培养3d后向胞外分泌一定量的OC，对照组仅有极少量OC。两组间差异有显著性(成组t检验，P<0.01)。
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2.5 成骨细胞的生长曲线 见图4。细胞生长曲线是观测细胞在一代生存期内增生过程的重要指标，是细胞生物学特性指标之一。图4可见成骨细胞数量逐渐增加，1d～3d为指数增殖期，细胞呈倍数增长，3d～6d进入平台期，细胞数基本稳定，7d时细胞又倍增。
3 讨论
成骨细胞原代培养时，取材范围比较广泛，国内外很多学者均成功地以多种动物及人体的骨组织、骨膜及骨髓为原料培养出了成骨细胞 [1～4] 。胎鼠颅盖骨正处于生长发育期，基质沉积尚未开始 [5] ，取材容易，技术成熟，比较经济，故本实验采用SD胎鼠的颅盖骨为原料，组织块法培养原代成骨细胞。成骨细胞又名骨母细胞。由间叶质干细胞分化而来，在分化过程中能序列表达Ⅰ型胶原、碱性磷酸酶(ALP)和骨钙素，然后是矿物的沉积 [6] 。成骨细胞能合成Ⅰ型胶原，表达骨钙素和骨桥蛋白(Osteopontin)，在条件培养基中能形成钙化结节(Von Kossa染色阳性)等重要特征。长期以来我们将这些特征作为成骨细胞鉴定的证据，称为成骨细胞的表型标志 [7] 。本实验培养的细胞在培养早期从组织块边缘爬出生长时为长梭形，贴壁生长。随着培养时间的延长，细胞逐渐变成立方形或多角形，并形成钙化结节，形态学上 符合大多数学者的观察结果[2，8，9] 。细胞组织化学染色显示ALP染色阳性，早期能检测到细胞分泌一定量ALP，放免分析结果显示细胞能分泌一定量的骨钙素，这些充分证明本实验所培养细胞为成骨细胞。
, 百拇医药
我们用二次消化法纯化成骨细胞。细胞传代时，先加入少量消化液初次消化，1min后弃去消化液。因成纤维细胞贴壁能力较成骨细胞弱，初次消化脱落下来的主要是成纤维细胞，二次消化时脱落下来的才是成骨细胞。
细胞成分混杂的培养物在生长过程中，所占比例大、生命力旺盛、增殖能力强的细胞会表现优势增长，能抑制培养物中其它生命力弱、比例较小、增殖力差的细胞。通过长期培养或传代培养，处于弱势的细胞成分将逐渐淘汰 [8] 。本法培养第3代时就得到较纯的成骨细胞，且细胞活性较好，因活性较差的成骨细胞贴壁不牢固，初次消化时就脱落，二次消化时贴壁的就是活性较好的成骨细胞。
近年来成骨细胞在口腔医学领域逐渐受到重视和应用。种植体植入体内后，成骨细胞是主要的骨组织形成细胞，用成骨细胞来评价种植材料的生物相容性更为可靠 [10] 。种植体与周围组织的骨形成是一个非常复杂的过程，种植体松动、脱落的主要原因就是种植体-骨界面的失败，其影响因素是多方面的，而周围组织中的成骨细胞能否迁移、粘附并生长到种植体表面对种植体-骨界面的形成具有至关重要的作用。因此，建立一种成熟可靠的成骨细胞体外培养的方法，用以评价种植体的生物相容性就显得十分必要。(本文图见附页1、2)
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参考文献
1 李德华，刘宝林.人胚成骨细胞体外培养三维实验模型的建立.实用口腔医学杂志，2000，16(2):99-101.
2 唐昭，陈治清.大鼠成骨细胞体外培养的研究.华西口腔医学杂志，1997，15(1):70-72.
3 Holzer Gerold，EinhornThomas A，Majeska Robert J，Estrogen regulation of growth and alkaline phosphatase expression by cultured human bone marrow stromal cells.Journal of orthopaedic research，2002，20(2):281-288.
4 Yeh Lee-Chuan C，Zavala Michelle C，Lee John C.Osteogenic protein-1and interleukin-6with its soluble receptor synergistically stimulate rat osteoblastic cell differentiation.Journal of cellular physiology，2002，190(3):322-331.
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5 Ho ML，Chang JK，Chuang LY，et al.Characteristics of primary osˉteoblast culture derived from rat fetal calvaria.Kaohsiung J Med Sci，1999，15(5):248-255.
6 Nishiya Y，Kosaka N，Uchii M，et al.A potent1，4-dihydropyridine L-type calcium channel blocker，benidipine，promotes osteoblast differˉentiation.Calcified tissue international，2002，70(1):30-39.
7 张立海，张其清.骨组织工程中成骨细胞与细胞因子的研究.中国医学科学院学报，2001，3(6):631-637.
8 薛庆善.体外培养的原理与技术，北京:科学出版社，2001.
9 司徒镇强，吴军正.细胞培养，西安:世界图书出版社西安公司，1996.
10 夏大弘.成骨细胞体外培养在种植体相关研究中的应用.国外医学·口腔医学分册，2001，28(2):73-75.
作者单位:1650032昆明医学院第一附属医院临床医学实验中心
2650031昆明医学院口腔学院
(编辑使 臻), 百拇医药(赵德萍 谭小兵 吴恩格 贾伟)