乙型肝炎患者HBV-DNA定量检测与HBV血清学标志组合的关系
【摘要】 目的 了解HBV感染的不同血清学组合的HBV-DNA阳性情况。方法 对324例患者血清同时进行ELISA方法测定HBV-M及荧光定量PCR法检测HBV-DNA。结果 HBsAg(+)组HBV-DNA阳性率为78.4%(254/324)，HBsAg(-)组HBV-DNA阳性率为4.8%(5/103)，两者差异有显著性。HBsAg(+)、HBeAg(+)、HBcAb(+)血清HBV-DNA阳性率为100%(120/120)，平均含量为1.61×10E7拷贝/ml;HBsAg(+)、HBeAb(+)、HBcAb(+)血清HBV-DNA阳性率为47%(76/162)，平均含量为3.42×10E4拷贝/ml;HBsAg(+)、HBcAb(+)血清HBV-DNA阳性率为69%(29/42)，平均含量为6.32×10E3拷贝/ml;HBsAb(+)、HBeAb(+)、HBcAb(+)血清HBV-DNA阳性率为5.2%(5/96)，平均含量为4.12×10E1拷贝/ml。结论 定量PCR可真实反映HBV感染、复制及病程变化，对乙型肝炎临床诊断及治疗均有较大的指导意义。
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关键词 乙型肝炎病毒 DNA ELISA
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)13-1944-02
The relation of quantitative HBV-DNA to its serological markers
Xu Ruihuan，Huang Xingguo，Song Shijun，et al.
Shenzhen Longgang Center Hospital，Shenzhen518116.
【Abstract】 Objective To study HBV-DNA positve rates under its different serological groups.Methods 324HBV serum are detected by ELISA and quantitative PCR technique.Results The HBV-DNA positive rate is78.4%(254/324)，and4.8%(5/103)for its negative group.There were significantly differences between the two groups(P<0.05).100%positive rate of HBV-DNA is to HBsAg(+)HBeAg(+)HBcAb(+)serum about averˉage1.61×10E7copies/ml，47%(76/162)to HBsAg(+)HBeAb(+)HBcAb(+)about3.42×10E4copies/ml，69%(29/42)to HBsAg(+)HBcAb(+)about average6.32×10E3copies/ml，5.2%(5/96)to HBsAb(+)HBeAb(+)HBcAb(+)about average4.12×10E1copies/ml.Conclusion Quantitative PCR can really response HBV infection and duplication and disease progress，it provides much more information for HBV diagnosis and theraˉpy.
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Key words hepatitis B virus deoxyribonucleic acid enzyme linked immunosorbent assay
采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测乙型肝炎病毒HBV标志(HBV-M)简便易行，一直为许多临床科室使用。而近年来应用聚合酶链反应(PCR)技术定量的检测HBV-DNA进一步提高了检测的质量。有必要把此两种方法的检测结果联合起来进行分析，指导临床应用。
1 资料与方法
1.1 一般资料 2002年6～9月来我院住院及门诊的423例患者，年龄13～66岁。所有标本用无菌管留取血样3ml，于3h内分离血清，并冻存于-20℃冰箱。
1.2 主要试剂与仪器 HBV-DNA定量诊断试剂由深圳市匹基生物技术公司提供。HBV-M测定用ELISA法，试剂由上海科华生物工程公司提供。
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1.3 检测方法
1.3.1 ELISA试验 按试剂说明书进行。
1.3.2 荧光定量PCR法检测HBV-DNA (1)样本处理:取待测血清或血浆样本以及试剂及试剂盒中的对照各100μl，分别加到0.5ml离心管中，100μl DNA提取液1，振荡混匀，13000rpm离心10s，25μl DNA提取液2，振荡10s，200rpm离心10s，100℃干浴或沸水浴10s，13000rpm离心10s，保留上清备用。(2)反应体系为40μl:37.6μl PCR反应液、0.4μl Taq酶、0.06μl VNG及2μl提取物。(3)循环条件为:37℃5min、94℃1min、95℃5s，60℃30s42个循环。荧光信号收集在60℃。
1.3.3 污染的控制 标本的处理、试剂的配制、上样及PCR扩增检测严格分室进行，每次检测均设强阳性、临界阳性、阴性、质控试剂参照品。美国Bio-Rad公司生产的Icycler荧光定量PCR仪，芬兰Labsystems生产的Multiskan MK3酶标仪。
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1.4 统计学方法 采用SPSS软件进行χ 2 检验。
2 结果
2.1 HBsAg(+)组与HBsAg(-)组HBV-DNA阳性率的比较 324例血清标本HBV-DNA表达情况见表1。
表1 HBsAg(+)组与HBsAg(-)组HBV-DNA阳性率的比较 (略)
2.2 HBV-M不同模式的HBV-DNA的检测结果 324例血清标本HBV-M不同模式的HBV-DNA的检测结果见表2。
表2 HBV-M不同模式的HBV-DNA的检测结果
3 讨论
ELISA试验检测乙型肝炎病毒(HBV)已成为临床常规。乙肝5项的检测为临床提供一定的信息 [1，2] ，但对HBsAg阴性者，本实验发现有5%的HBV-DNA阳性，且拷贝数在10E4拷贝/ml左右，与某些文献报道相似 [3] 。其原因可能由于(1)HBV发生变异。其前S区变异率比S区高2倍;前C/C区变异研究较多。(2)HBsAg的表达可能较低或其抗原性改变较大，用现有的试剂检测不出。(3)形成免疫复合物。有人发现血中免疫复合物的存在可能影响HBsAg的检出 [4] 。
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HBV-DNA拷贝数可真实反映HBV感染的状况 [5，6] ，本试验结果为HBsAg(+)、HBeAg(+)、HBcAb(+)的患者血清，HBV-DNA全部阳性，平均含量为1.61×10E7拷贝/ml;HBsAg(+)、HBeAb(+)，HBcAb(+)的患者血清，HBV-DNA阳性率为47%，平均含量为3.42×10E4拷贝/ml;HBˉsAg(+)、HBcAb(+)的患者血清，HBV-DNA阳性率为69%，平均含量为6.32×10E3拷贝/ml，而HBsAb(+)、HBeAb(+)、HBcAb(+)的患者血清，HBV-DNA阳性率为5.2%，平均拷贝数为4.12×10E1拷贝/ml，由此可以看出血清中HBV-DNA拷贝数与其血清学指标组合是相匹配的，对乙型肝炎的临床诊断，特别是对其疗效有较大的指导 意义 [7] 。本实验发现HBsAg(+)、HBcAb(+)的阳性率为69%比HBsAg(+)、HBeAb(+)、HBcAb(+)的阳性率(47%)高，且差别显著(P<0.05)。有两种可能解释，一是HBV复制减少或停止;一是HBsAg前C基因发生变异。根据Ferˉruccio Bonino来华报告，急性乙型肝炎时HBV标志物的变化图显示HBsAg(+)、HBeAb(+)、HBcAb(+)时的HBV-DNA阳性率明显低于HBsAg(+)、HBcAb(+)时的HBV-DNA阳性率。
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本实验所用的BIO-RADicycler荧光定量PCR技术灵敏度高，操作简单，克服假阳性结果，无需PCR后处理，防污染效果好，可直接反映病毒在体内的存在情况，已为临床普遍应用。而血清学ELISA方法是检测病毒侵染机体产生的免疫反应，间接反映病毒的感染状况。本试验显示两者既有相关，又不尽一致，临床上需要将两者结合起来对患者进行诊断和治疗。
参考文献
1 Vrielink H，Reesink HW.Performance of three generations of anti-hepˉatitis C virus ELISA in donors and patients.Transfusion，1997，37:845-849.
2 吴杰.PCR法检测食品从业人员血清中的HBV-DNA与ELISA法检测结果比较.现代预防医学，1999，26(4):501-502.
, 百拇医药
3 王志钢，毕平安，金利民，等.乙肝患者血清HBV-DNA检出率分析.上海医学检验杂志，1999，14(6):350.
4 田庚善.传染病学.第三版.上海:上海科学技术出版社，1998，237-260.
5 王平忠，周永兴，白雪帆，等.乙型肝炎病毒DNA定量检测及意义.第四军医大学学报，2000，21(7):811-813.
6 Roth WK，Weber M，Seifried.Feasibility and efficacy of routine PCR screening of blood donations for hepatitis C virus，hepatitis B virus and HIV-1in a blood-bank setting.Lancet，1999，353:359-363.
7 张春平.施保利通合乙肝疫苗对乙型肝炎病毒标志物的影响.现代中西医结合杂志，2001，10(9):1844-1845.
作者单位:1518116广东省深圳市龙岗中心医院中心实验室
2广东省深圳市龙岗区妇幼保健院
(编辑小 川), http://www.100md.com(许瑞环)
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关键词 乙型肝炎病毒 DNA ELISA
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)13-1944-02
The relation of quantitative HBV-DNA to its serological markers
Xu Ruihuan，Huang Xingguo，Song Shijun，et al.
Shenzhen Longgang Center Hospital，Shenzhen518116.
【Abstract】 Objective To study HBV-DNA positve rates under its different serological groups.Methods 324HBV serum are detected by ELISA and quantitative PCR technique.Results The HBV-DNA positive rate is78.4%(254/324)，and4.8%(5/103)for its negative group.There were significantly differences between the two groups(P<0.05).100%positive rate of HBV-DNA is to HBsAg(+)HBeAg(+)HBcAb(+)serum about averˉage1.61×10E7copies/ml，47%(76/162)to HBsAg(+)HBeAb(+)HBcAb(+)about3.42×10E4copies/ml，69%(29/42)to HBsAg(+)HBcAb(+)about average6.32×10E3copies/ml，5.2%(5/96)to HBsAb(+)HBeAb(+)HBcAb(+)about average4.12×10E1copies/ml.Conclusion Quantitative PCR can really response HBV infection and duplication and disease progress，it provides much more information for HBV diagnosis and theraˉpy.
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Key words hepatitis B virus deoxyribonucleic acid enzyme linked immunosorbent assay
采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测乙型肝炎病毒HBV标志(HBV-M)简便易行，一直为许多临床科室使用。而近年来应用聚合酶链反应(PCR)技术定量的检测HBV-DNA进一步提高了检测的质量。有必要把此两种方法的检测结果联合起来进行分析，指导临床应用。
1 资料与方法
1.1 一般资料 2002年6～9月来我院住院及门诊的423例患者，年龄13～66岁。所有标本用无菌管留取血样3ml，于3h内分离血清，并冻存于-20℃冰箱。
1.2 主要试剂与仪器 HBV-DNA定量诊断试剂由深圳市匹基生物技术公司提供。HBV-M测定用ELISA法，试剂由上海科华生物工程公司提供。
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1.3 检测方法
1.3.1 ELISA试验 按试剂说明书进行。
1.3.2 荧光定量PCR法检测HBV-DNA (1)样本处理:取待测血清或血浆样本以及试剂及试剂盒中的对照各100μl，分别加到0.5ml离心管中，100μl DNA提取液1，振荡混匀，13000rpm离心10s，25μl DNA提取液2，振荡10s，200rpm离心10s，100℃干浴或沸水浴10s，13000rpm离心10s，保留上清备用。(2)反应体系为40μl:37.6μl PCR反应液、0.4μl Taq酶、0.06μl VNG及2μl提取物。(3)循环条件为:37℃5min、94℃1min、95℃5s，60℃30s42个循环。荧光信号收集在60℃。
1.3.3 污染的控制 标本的处理、试剂的配制、上样及PCR扩增检测严格分室进行，每次检测均设强阳性、临界阳性、阴性、质控试剂参照品。美国Bio-Rad公司生产的Icycler荧光定量PCR仪，芬兰Labsystems生产的Multiskan MK3酶标仪。
, 百拇医药
1.4 统计学方法 采用SPSS软件进行χ 2 检验。
2 结果
2.1 HBsAg(+)组与HBsAg(-)组HBV-DNA阳性率的比较 324例血清标本HBV-DNA表达情况见表1。
表1 HBsAg(+)组与HBsAg(-)组HBV-DNA阳性率的比较 (略)
2.2 HBV-M不同模式的HBV-DNA的检测结果 324例血清标本HBV-M不同模式的HBV-DNA的检测结果见表2。
表2 HBV-M不同模式的HBV-DNA的检测结果
3 讨论
ELISA试验检测乙型肝炎病毒(HBV)已成为临床常规。乙肝5项的检测为临床提供一定的信息 [1，2] ，但对HBsAg阴性者，本实验发现有5%的HBV-DNA阳性，且拷贝数在10E4拷贝/ml左右，与某些文献报道相似 [3] 。其原因可能由于(1)HBV发生变异。其前S区变异率比S区高2倍;前C/C区变异研究较多。(2)HBsAg的表达可能较低或其抗原性改变较大，用现有的试剂检测不出。(3)形成免疫复合物。有人发现血中免疫复合物的存在可能影响HBsAg的检出 [4] 。
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HBV-DNA拷贝数可真实反映HBV感染的状况 [5，6] ，本试验结果为HBsAg(+)、HBeAg(+)、HBcAb(+)的患者血清，HBV-DNA全部阳性，平均含量为1.61×10E7拷贝/ml;HBsAg(+)、HBeAb(+)，HBcAb(+)的患者血清，HBV-DNA阳性率为47%，平均含量为3.42×10E4拷贝/ml;HBˉsAg(+)、HBcAb(+)的患者血清，HBV-DNA阳性率为69%，平均含量为6.32×10E3拷贝/ml，而HBsAb(+)、HBeAb(+)、HBcAb(+)的患者血清，HBV-DNA阳性率为5.2%，平均拷贝数为4.12×10E1拷贝/ml，由此可以看出血清中HBV-DNA拷贝数与其血清学指标组合是相匹配的，对乙型肝炎的临床诊断，特别是对其疗效有较大的指导 意义 [7] 。本实验发现HBsAg(+)、HBcAb(+)的阳性率为69%比HBsAg(+)、HBeAb(+)、HBcAb(+)的阳性率(47%)高，且差别显著(P<0.05)。有两种可能解释，一是HBV复制减少或停止;一是HBsAg前C基因发生变异。根据Ferˉruccio Bonino来华报告，急性乙型肝炎时HBV标志物的变化图显示HBsAg(+)、HBeAb(+)、HBcAb(+)时的HBV-DNA阳性率明显低于HBsAg(+)、HBcAb(+)时的HBV-DNA阳性率。
, http://www.100md.com
本实验所用的BIO-RADicycler荧光定量PCR技术灵敏度高，操作简单，克服假阳性结果，无需PCR后处理，防污染效果好，可直接反映病毒在体内的存在情况，已为临床普遍应用。而血清学ELISA方法是检测病毒侵染机体产生的免疫反应，间接反映病毒的感染状况。本试验显示两者既有相关，又不尽一致，临床上需要将两者结合起来对患者进行诊断和治疗。
参考文献
1 Vrielink H，Reesink HW.Performance of three generations of anti-hepˉatitis C virus ELISA in donors and patients.Transfusion，1997，37:845-849.
2 吴杰.PCR法检测食品从业人员血清中的HBV-DNA与ELISA法检测结果比较.现代预防医学，1999，26(4):501-502.
, 百拇医药
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4 田庚善.传染病学.第三版.上海:上海科学技术出版社，1998，237-260.
5 王平忠，周永兴，白雪帆，等.乙型肝炎病毒DNA定量检测及意义.第四军医大学学报，2000，21(7):811-813.
6 Roth WK，Weber M，Seifried.Feasibility and efficacy of routine PCR screening of blood donations for hepatitis C virus，hepatitis B virus and HIV-1in a blood-bank setting.Lancet，1999，353:359-363.
7 张春平.施保利通合乙肝疫苗对乙型肝炎病毒标志物的影响.现代中西医结合杂志，2001，10(9):1844-1845.
作者单位:1518116广东省深圳市龙岗中心医院中心实验室
2广东省深圳市龙岗区妇幼保健院
(编辑小 川), http://www.100md.com(许瑞环)