高血压肝阳上亢大鼠模型单个核细胞蛋白质组的二维电泳分析
【摘要】 目的 探寻高血压肝阳上亢证候相关蛋白。方法 采用SD大鼠20只，随机分为实验组和正常对照组，实验组用以建立高血压肝阳上亢模型。分离大鼠脾单个核细胞，提取总蛋白，应用双向电泳技术进行分离，结果用PDQuest7.1.1分析。结果 两者蛋白斑点总体分布相似，大部分蛋白集中分布在PI5.0～8.0，Mr17.5～45.0kD区域。其中在高血压肝阳上亢大鼠检测到497个点，其中为其独自所有的点有387个。正常大鼠386个点，完全匹配的点有110个。在PI5.0～8.0，Mr20～36.6kD区域，实验组和正常对照组所检测到的蛋白斑点分别为219和175个，其中互相完全匹配的斑点为56个，其余为差异蛋白。结论 高血压肝阳上亢大鼠电泳图谱中独有的387个点可能与高血压肝阳上亢证候相关。此结果亦为下一步蛋白鉴定实验提供基础。
关键词 高血压 中医证候 蛋白质组 双向电泳
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)13-1929-03
, http://www.100md.com
Proteome research of mononuclear cell of hypertensive
rat model with Ganyangshangkang syndrome by
two-dimensional gel electrophoresis
Zhang Xian，Li Wei，Zeng Xing，et al.
The Central Laboratory，Guangdong Provincial Hospital of TCM，Guangzhou510120.
【Abstract】 Objective To explore the protein associated with Ganyangshangkang Syndrome(GYSKS)in hyˉpertension.Methods 10normal control rats and10hypertensive rats with Ganyangshangkang Syndrome were used.The total protein extracted from mononuclear cells in rats’spleen was separated by two-dimensional gel electrophoreˉsis.After the silver stained gles been scanned，the analysis including minifying background，spot detection，matching between gels was carried out by PDQuest7.1.1software.Results There were497protein spots in the2-DE map of the hypertensive rat with Ganyangshangkang syndrome including387spots unique to it，while386spots in the map of normal rat.There were110protein spots matched to both.Conclusion The387unique protein spots might be associˉated with Ganyangshangkang syndrome(GYSKS)in hypertension，and from these some protein can be picked to beiˉdentified by mass spectrometry.
, 百拇医药
Key words hypertension syndrome of traditional Chinese medicine proteome two-dimensional gel elecˉtrophoresis
1995年，Wilkins [1] 提出了“蛋白质组学”这一概念，其定义是由1个细胞或1种组织的基因组所表达的全部相应的蛋白质。目前，从蛋白质组的角度对生命活动中的某一生理或病理过程进行研究已成为热点。双向电泳技术作为蛋白质组分析的核心技术，是蛋白质组研究的主要手段。其可以同时有效地分离复杂蛋白质混合物，从而能全面分析某一特定状态下机体的蛋白表达情况，以及不同状态下蛋白表达差异。本文试图建立病证结合的高血压肝阳上亢大鼠模型，并用双向聚丙烯酰胺凝胶电泳技术分离大鼠的淋巴细胞总蛋白，用PDQuest7.1.12D分析软件分析电泳图谱，比较高血压肝阳上亢大鼠与正常大鼠的蛋白质表达差异。
1 实验材料
, http://www.100md.com
1.1 实验动物 20只纯种雄性SD大鼠，鼠龄60～90天，体重90～120g，由广州中医药大学动物中心提供。将20只大鼠随机分为2组:正常对照组10只，实验组10只，用以建立高血压肝阳上亢模型。
1.2 主要试剂 尿素、Ampholytes pH3～10、过硫酸胺、四甲基乙二胺(TEMED)、固相pH梯度干胶条(pH3～10，11cm)、十二烷基硫酸钠(SDS)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、CHAPS、标准蛋白均购自Bio-Rad公司。硫脲购自Fluka公司。丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、二硫苏糖醇(DTT)购自上海生工公司。碘乙酰胺购自ACROS，硝酸银、甲醛、氢氧化钠、柠檬酸、无水乙醇、乙酸均为国产分析纯。
1.3 主要仪器 MRB-ⅢA大鼠血压心率仪(上海高血压研究所产品)，低温高速离心机(GS-15R，BECKMEN)，紫外分光光度计，PROTEAN IEF CELL等电聚焦仪、PROTEAN TM XI CELL垂直电泳仪、POWER PAC3000电源(Bio-Rad)。DELL Dimension4600微机，Dolphin扫描仪(UMAX)。
, 百拇医药
1.4 软件 PDQuest7.1.1(Bio-Rad)。
2 方法与步骤
2.1 造模方法 模型组参照文献 [2～4] 用慢性束缚及悬吊应激法造成肝气郁结，肝肾阴虚后，采用双肾双夹法复制出肾血管性高血压模型;伤口愈合后继续慢性束缚及应激悬吊，造模时间共为90天。模型大鼠表现为血压升高，烦躁易怒，互相打斗、撕咬，饮水量增加，大便干结，舌质红，苔黄，与临床高血压肝阳上亢表现具有一定的相似性。
2.2 大鼠脾单个核细胞提取 造模成功后引颈处死大鼠，剖腹摘取脾脏，剪成2mm 3 大小，置研磨器研磨，静置片刻后，取上层细胞悬液，400目滤网过滤，1500r/min，离心10min，用低渗裂解法裂解红细胞后，PBS洗涤3次，离心洗涤，收集沉淀淋巴细胞。用滤纸轻轻吸干水分，于-70℃冰箱保存。
, http://www.100md.com
2.3 蛋白提取 按双向电泳操作手册(Bio-Rad)用一步法提取总蛋白。取约1.5mg湿重淋巴细胞，加入500μl裂解液(含7M尿素、2M硫脲、0.4%CHAPS、0.025%APH3-10，0.05%DTT、0.2%TBP)，振荡混匀，于液氮中反复冻融3次。加入2μl DNA酶及1μl RNA酶，于4℃作用20min，13000r/min，4℃下离心30min。取上清，转移至另一EP管中。用Bradford法蛋白定量[5] 。
2.4 第一向等电聚焦 取150μl样品缓冲液(含80μg蛋白)，加上痕量溴蓝泡涨固相梯度pH胶条12h，250V电压下去离子30min后在8000V、4000volt-hours条件下等电聚焦。
2.5 平衡 将等电聚焦的胶条转移到水化盘中，先后用DTT、碘乙酰胺平衡液6ml各平衡10min，6ml平衡液含有尿素2.16g，SDS0.24g，1.5MTris(pH8.8)0.4ml，甘油1.2ml;其中DTT平衡液加入DTT0.12g，碘乙酰胺平衡液加入碘乙酰胺0.15g。
, http://www.100md.com
2.6 第二向垂直SDS-PAGE 灌制16cm×16cm×1mm大小、浓度12%SDS-PAG，将平衡好的胶条转移到SDS-PAG上，用0.5%琼脂糖凝胶封边，用每一块胶15mA恒定电流下进行垂直分离，至距末端2cm处停止电泳。
2.7 银氨染色 采用前文献方法 [6] 并稍做改进。凝胶用5%乙酸、5%乙醇固定过夜;弃去固定液，水洗2次，5%戊二醛增敏，水洗4次;加入染色液(将10%硝酸银溶液40ml加入含有10ml氨水及0.1g氢氧化钠水溶液450ml，定容至500ml，混匀，防止沉淀生成)染色30min，水洗3次;加入显色液(取1%柠檬酸2.5ml、38%甲醛溶液400μl，加水至 500ml)显色;最后用5%乙酸停影。
2.8 图像采集及分析 用扫描仪在300BPI分辨率下扫描银染凝胶，用PDQuest7.1.1软件对图像进行背景削减，去除条纹、斑点检测，Gussian拟合后进行匹配分析。每组各分析5张，两组共10张凝胶，再用两组的代表凝胶进行比较。
, 百拇医药
3 结果
3.1 图谱总体分布 图1(A)(B)是正常大鼠和高血压肝阳上亢大鼠脾淋巴细胞总蛋白双向电泳分离、银染、扫描后，在同一条件下，用PDQuest7.1.1进行斑点检测，经Gussian拟合得到的图谱。两者蛋白斑点总体分布相似，大部分蛋白集中分布在PI5.0～8.0，Mr17.5～45.0kD区域。其中肝阳上亢大鼠的蛋白点明显比正常对照组多。其蛋白斑点数为334±132，正常对照的蛋白斑点为277±113。其中完全匹配的斑点有110个。差异蛋白主要分布在PI5.0～8.0，Mr20～36.6kD区域。
3.2 主要差异蛋白分布区域 图2所示为PI5.0～8.0，Mr20～36.6kD区域Gussian拟合图谱，在相同条件下，图2(A)和图2(B)所检测到的蛋白斑点分别为219和175个，其中互相完全匹配的斑点为56个，其余为差异蛋白。
4 讨论
, http://www.100md.com
目前认为高血压的发病与多种机制如神经—内分泌—体液因素，肾素—血管紧张素—醛固酮系统，血管内皮功能，免疫状态等相关 [7～9] 。多种效应分子如体液因子、血管活性物质、细胞因子参与其过程。其中与中医证候相关的分子有肾素、血管紧张素、肾上腺素、去甲肾上腺素、内皮素、血栓素、前列腺素、肿瘤坏死因子、白介素2等 [10～12] 。金益强等对肝阳上亢证进行多层次、多系统的研究，发现其病理生理学基础与外周交感—肾上腺髓质功能亢进相关 [13] ，并对原发性高血压患者及SHR肝阳上亢大鼠TH基因mRNA及TH蛋白进行研究，结果发现TH基因mRNA及TH蛋白明显高于正常对照及其他证型 [14]，说明高血压的发病及证候的形成与体内mRNA及蛋白质的表达有相关性。但是高血压的发病并非单一因素所致，中医证候的形成亦“因人、因时、因地”而异，是多因素同时参与和影响的结果。本文用慢性束缚及悬吊应激法造成肝气郁结和肝肾阴虚后，采用多肾双夹法复制出肾血管性高血压模型，由此图1 经Gussian拟合后的全图图2 主要差异蛋白分布区域Gussian拟合图谱模仿老年高血压病由肝肾阴虚到肝阳上亢发病过程。采用双向电泳分离总蛋白质，了解高血压肝阳上亢大鼠单个核细胞蛋白表达的总体情况。通过比较高血压肝阳上亢大鼠与正常大鼠的总蛋白质电泳图谱，寻找两者的表达差异蛋白，从而发现高血压肝阳上亢证候的标志分子，探寻其物质基础。经过严格的同一条件图像处理和分析包括图像获取、背景削减、条纹去除、斑点检测、斑点匹配，在高血压肝阳上亢大鼠2-DE图谱检测到497个点，在正常对照检测到386个点，其中两者完全匹配的点有110个，其余为差异表达点。在仅出现在肝阳上亢大鼠的387个差异点中，应该存在与高血压肝阳上亢证候相关的蛋白。但这些差异蛋白中的标志蛋白和它们之间的内在联系，需要并进行下一步的鉴定时可能会发现与证候相关的特定蛋白，从而为中医证候物质基础研究提供实验数据。
, 百拇医药
参考文献
1 Swinkans D.Government backs proteome proposal.Nature，1995，378:653.
2 Chung KK，Martinez J.Herbert J.C-fos expression，behavioral，enˉdocrine and autonomic responses to acute social stress in male rats after chronic restraint:modulation by serotonin.Neuroscience，2000，95(2):453-456.
3 包天桐.应激致“肾虚”动物模型介绍.药学学报，1998，33(9):717-718.
4 Zeng JS，Zhuang YQ，Mo JW，et al.Two-kidney，two clip renovascular hypertensive rats can be used as stroke-prone rats.Stroke，1998，29(8):1708-1714.
, http://www.100md.com
5 汪家政.蛋白质技术手册.北京:科学出版社，2001，42-46.
6 朱宏，王柏臣.蛋白质双向电泳双胺染色方法的改进.植物研究，2003，23(1):94-97，T011.
7 陈灏珠.实用内科学.第十版.北京:人民卫生出版社，2000，1430-1434.
8 Peeters AC，Netea MG.Pro-inflammatory cytokines in patients with esˉsential hypertension.Eur-J-Clin-Invest，2001，31(1):31-36.
9 Todorova M，Baleva M.Anticardiolipin antibodies in spontaneously hyˉpertensive rats(SHR)，stroke-prone SHR and normal Wistar rats.Clin-Exp-Pharmacol-Physiol，2000，27(9):705-708.
, 百拇医药
10 古炽明，丁有钦.高血压病中医证候的研究进展.中医杂志，2003，44(2):150-152.
11 张昱，王阶.高血压病中医证型的现代研究进展.中国中医药信息杂志，2002，9(1):78-80.
12 黄璐琦.二肾一夹高血压大鼠模型中医证候属性的探讨及药物作用的观察.中国中医基础杂志，2003，9(2):34-37.
13 金益强，黎杏群，陈国林，等.肝阳上亢证本质研究.中西医结合杂志，1998，28(3):136-140.
14 金益强，胡随珍.高血压肝阳上亢证的分子机理研究.中国中西医结合杂志，2000，20(2):87-90.
作者单位:510120广东省中医院中心实验室
(编辑维 兰), 百拇医药(张娴)
关键词 高血压 中医证候 蛋白质组 双向电泳
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)13-1929-03
, http://www.100md.com
Proteome research of mononuclear cell of hypertensive
rat model with Ganyangshangkang syndrome by
two-dimensional gel electrophoresis
Zhang Xian，Li Wei，Zeng Xing，et al.
The Central Laboratory，Guangdong Provincial Hospital of TCM，Guangzhou510120.
【Abstract】 Objective To explore the protein associated with Ganyangshangkang Syndrome(GYSKS)in hyˉpertension.Methods 10normal control rats and10hypertensive rats with Ganyangshangkang Syndrome were used.The total protein extracted from mononuclear cells in rats’spleen was separated by two-dimensional gel electrophoreˉsis.After the silver stained gles been scanned，the analysis including minifying background，spot detection，matching between gels was carried out by PDQuest7.1.1software.Results There were497protein spots in the2-DE map of the hypertensive rat with Ganyangshangkang syndrome including387spots unique to it，while386spots in the map of normal rat.There were110protein spots matched to both.Conclusion The387unique protein spots might be associˉated with Ganyangshangkang syndrome(GYSKS)in hypertension，and from these some protein can be picked to beiˉdentified by mass spectrometry.
, 百拇医药
Key words hypertension syndrome of traditional Chinese medicine proteome two-dimensional gel elecˉtrophoresis
1995年，Wilkins [1] 提出了“蛋白质组学”这一概念，其定义是由1个细胞或1种组织的基因组所表达的全部相应的蛋白质。目前，从蛋白质组的角度对生命活动中的某一生理或病理过程进行研究已成为热点。双向电泳技术作为蛋白质组分析的核心技术，是蛋白质组研究的主要手段。其可以同时有效地分离复杂蛋白质混合物，从而能全面分析某一特定状态下机体的蛋白表达情况，以及不同状态下蛋白表达差异。本文试图建立病证结合的高血压肝阳上亢大鼠模型，并用双向聚丙烯酰胺凝胶电泳技术分离大鼠的淋巴细胞总蛋白，用PDQuest7.1.12D分析软件分析电泳图谱，比较高血压肝阳上亢大鼠与正常大鼠的蛋白质表达差异。
1 实验材料
, http://www.100md.com
1.1 实验动物 20只纯种雄性SD大鼠，鼠龄60～90天，体重90～120g，由广州中医药大学动物中心提供。将20只大鼠随机分为2组:正常对照组10只，实验组10只，用以建立高血压肝阳上亢模型。
1.2 主要试剂 尿素、Ampholytes pH3～10、过硫酸胺、四甲基乙二胺(TEMED)、固相pH梯度干胶条(pH3～10，11cm)、十二烷基硫酸钠(SDS)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、CHAPS、标准蛋白均购自Bio-Rad公司。硫脲购自Fluka公司。丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、二硫苏糖醇(DTT)购自上海生工公司。碘乙酰胺购自ACROS，硝酸银、甲醛、氢氧化钠、柠檬酸、无水乙醇、乙酸均为国产分析纯。
1.3 主要仪器 MRB-ⅢA大鼠血压心率仪(上海高血压研究所产品)，低温高速离心机(GS-15R，BECKMEN)，紫外分光光度计，PROTEAN IEF CELL等电聚焦仪、PROTEAN TM XI CELL垂直电泳仪、POWER PAC3000电源(Bio-Rad)。DELL Dimension4600微机，Dolphin扫描仪(UMAX)。
, 百拇医药
1.4 软件 PDQuest7.1.1(Bio-Rad)。
2 方法与步骤
2.1 造模方法 模型组参照文献 [2～4] 用慢性束缚及悬吊应激法造成肝气郁结，肝肾阴虚后，采用双肾双夹法复制出肾血管性高血压模型;伤口愈合后继续慢性束缚及应激悬吊，造模时间共为90天。模型大鼠表现为血压升高，烦躁易怒，互相打斗、撕咬，饮水量增加，大便干结，舌质红，苔黄，与临床高血压肝阳上亢表现具有一定的相似性。
2.2 大鼠脾单个核细胞提取 造模成功后引颈处死大鼠，剖腹摘取脾脏，剪成2mm 3 大小，置研磨器研磨，静置片刻后，取上层细胞悬液，400目滤网过滤，1500r/min，离心10min，用低渗裂解法裂解红细胞后，PBS洗涤3次，离心洗涤，收集沉淀淋巴细胞。用滤纸轻轻吸干水分，于-70℃冰箱保存。
, http://www.100md.com
2.3 蛋白提取 按双向电泳操作手册(Bio-Rad)用一步法提取总蛋白。取约1.5mg湿重淋巴细胞，加入500μl裂解液(含7M尿素、2M硫脲、0.4%CHAPS、0.025%APH3-10，0.05%DTT、0.2%TBP)，振荡混匀，于液氮中反复冻融3次。加入2μl DNA酶及1μl RNA酶，于4℃作用20min，13000r/min，4℃下离心30min。取上清，转移至另一EP管中。用Bradford法蛋白定量[5] 。
2.4 第一向等电聚焦 取150μl样品缓冲液(含80μg蛋白)，加上痕量溴蓝泡涨固相梯度pH胶条12h，250V电压下去离子30min后在8000V、4000volt-hours条件下等电聚焦。
2.5 平衡 将等电聚焦的胶条转移到水化盘中，先后用DTT、碘乙酰胺平衡液6ml各平衡10min，6ml平衡液含有尿素2.16g，SDS0.24g，1.5MTris(pH8.8)0.4ml，甘油1.2ml;其中DTT平衡液加入DTT0.12g，碘乙酰胺平衡液加入碘乙酰胺0.15g。
, http://www.100md.com
2.6 第二向垂直SDS-PAGE 灌制16cm×16cm×1mm大小、浓度12%SDS-PAG，将平衡好的胶条转移到SDS-PAG上，用0.5%琼脂糖凝胶封边，用每一块胶15mA恒定电流下进行垂直分离，至距末端2cm处停止电泳。
2.7 银氨染色 采用前文献方法 [6] 并稍做改进。凝胶用5%乙酸、5%乙醇固定过夜;弃去固定液，水洗2次，5%戊二醛增敏，水洗4次;加入染色液(将10%硝酸银溶液40ml加入含有10ml氨水及0.1g氢氧化钠水溶液450ml，定容至500ml，混匀，防止沉淀生成)染色30min，水洗3次;加入显色液(取1%柠檬酸2.5ml、38%甲醛溶液400μl，加水至 500ml)显色;最后用5%乙酸停影。
2.8 图像采集及分析 用扫描仪在300BPI分辨率下扫描银染凝胶，用PDQuest7.1.1软件对图像进行背景削减，去除条纹、斑点检测，Gussian拟合后进行匹配分析。每组各分析5张，两组共10张凝胶，再用两组的代表凝胶进行比较。
, 百拇医药
3 结果
3.1 图谱总体分布 图1(A)(B)是正常大鼠和高血压肝阳上亢大鼠脾淋巴细胞总蛋白双向电泳分离、银染、扫描后，在同一条件下，用PDQuest7.1.1进行斑点检测，经Gussian拟合得到的图谱。两者蛋白斑点总体分布相似，大部分蛋白集中分布在PI5.0～8.0，Mr17.5～45.0kD区域。其中肝阳上亢大鼠的蛋白点明显比正常对照组多。其蛋白斑点数为334±132，正常对照的蛋白斑点为277±113。其中完全匹配的斑点有110个。差异蛋白主要分布在PI5.0～8.0，Mr20～36.6kD区域。
3.2 主要差异蛋白分布区域 图2所示为PI5.0～8.0，Mr20～36.6kD区域Gussian拟合图谱，在相同条件下，图2(A)和图2(B)所检测到的蛋白斑点分别为219和175个，其中互相完全匹配的斑点为56个，其余为差异蛋白。
4 讨论
, http://www.100md.com
目前认为高血压的发病与多种机制如神经—内分泌—体液因素，肾素—血管紧张素—醛固酮系统，血管内皮功能，免疫状态等相关 [7～9] 。多种效应分子如体液因子、血管活性物质、细胞因子参与其过程。其中与中医证候相关的分子有肾素、血管紧张素、肾上腺素、去甲肾上腺素、内皮素、血栓素、前列腺素、肿瘤坏死因子、白介素2等 [10～12] 。金益强等对肝阳上亢证进行多层次、多系统的研究，发现其病理生理学基础与外周交感—肾上腺髓质功能亢进相关 [13] ，并对原发性高血压患者及SHR肝阳上亢大鼠TH基因mRNA及TH蛋白进行研究，结果发现TH基因mRNA及TH蛋白明显高于正常对照及其他证型 [14]，说明高血压的发病及证候的形成与体内mRNA及蛋白质的表达有相关性。但是高血压的发病并非单一因素所致，中医证候的形成亦“因人、因时、因地”而异，是多因素同时参与和影响的结果。本文用慢性束缚及悬吊应激法造成肝气郁结和肝肾阴虚后，采用多肾双夹法复制出肾血管性高血压模型，由此图1 经Gussian拟合后的全图图2 主要差异蛋白分布区域Gussian拟合图谱模仿老年高血压病由肝肾阴虚到肝阳上亢发病过程。采用双向电泳分离总蛋白质，了解高血压肝阳上亢大鼠单个核细胞蛋白表达的总体情况。通过比较高血压肝阳上亢大鼠与正常大鼠的总蛋白质电泳图谱，寻找两者的表达差异蛋白，从而发现高血压肝阳上亢证候的标志分子，探寻其物质基础。经过严格的同一条件图像处理和分析包括图像获取、背景削减、条纹去除、斑点检测、斑点匹配，在高血压肝阳上亢大鼠2-DE图谱检测到497个点，在正常对照检测到386个点，其中两者完全匹配的点有110个，其余为差异表达点。在仅出现在肝阳上亢大鼠的387个差异点中，应该存在与高血压肝阳上亢证候相关的蛋白。但这些差异蛋白中的标志蛋白和它们之间的内在联系，需要并进行下一步的鉴定时可能会发现与证候相关的特定蛋白，从而为中医证候物质基础研究提供实验数据。
, 百拇医药
参考文献
1 Swinkans D.Government backs proteome proposal.Nature，1995，378:653.
2 Chung KK，Martinez J.Herbert J.C-fos expression，behavioral，enˉdocrine and autonomic responses to acute social stress in male rats after chronic restraint:modulation by serotonin.Neuroscience，2000，95(2):453-456.
3 包天桐.应激致“肾虚”动物模型介绍.药学学报，1998，33(9):717-718.
4 Zeng JS，Zhuang YQ，Mo JW，et al.Two-kidney，two clip renovascular hypertensive rats can be used as stroke-prone rats.Stroke，1998，29(8):1708-1714.
, http://www.100md.com
5 汪家政.蛋白质技术手册.北京:科学出版社，2001，42-46.
6 朱宏，王柏臣.蛋白质双向电泳双胺染色方法的改进.植物研究，2003，23(1):94-97，T011.
7 陈灏珠.实用内科学.第十版.北京:人民卫生出版社，2000，1430-1434.
8 Peeters AC，Netea MG.Pro-inflammatory cytokines in patients with esˉsential hypertension.Eur-J-Clin-Invest，2001，31(1):31-36.
9 Todorova M，Baleva M.Anticardiolipin antibodies in spontaneously hyˉpertensive rats(SHR)，stroke-prone SHR and normal Wistar rats.Clin-Exp-Pharmacol-Physiol，2000，27(9):705-708.
, 百拇医药
10 古炽明，丁有钦.高血压病中医证候的研究进展.中医杂志，2003，44(2):150-152.
11 张昱，王阶.高血压病中医证型的现代研究进展.中国中医药信息杂志，2002，9(1):78-80.
12 黄璐琦.二肾一夹高血压大鼠模型中医证候属性的探讨及药物作用的观察.中国中医基础杂志，2003，9(2):34-37.
13 金益强，黎杏群，陈国林，等.肝阳上亢证本质研究.中西医结合杂志，1998，28(3):136-140.
14 金益强，胡随珍.高血压肝阳上亢证的分子机理研究.中国中西医结合杂志，2000，20(2):87-90.
作者单位:510120广东省中医院中心实验室
(编辑维 兰), 百拇医药(张娴)