炭疽杆菌DNA的实验性诊断
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中华中西医杂志 2003年7月 第4卷 第14期
【文献标识码】 B 【文章编号】 1606-8106(2003)14-2234-01
炭疽是由炭疽杆菌所引发的一种人畜共患的急性传染病。祖国医学对炭疽的认识源远流长，早将其列为疔疽之类，《诸病原候论》，名曰疔疽。中兽医名曰黄。《素问疮黄论》对炭疽败血症也有认识。唐朝孙思邈《备急千金要方》谓病症之急曰“至于疔肿，若不预识，令人死不待衣;若著讫欲求方，其人已入木矣” [1] 。
现代医学认为炭疽是由炭疽杆菌病原体所致疾病，主要存在于食草动物和牲畜群落，能产生芽孢，对外界产生极强抵抗力，造成环境长期污染。人群感染后常为散发性疾病，病程急剧，死亡率高。同时炭疽杆菌被作为潜在性的生物武器早已为人们所认识，美国爆发的炭疽生物恐怖活动更突出了该菌对公众健康的巨大危害，因此对炭疽杆菌感染后作出及时诊断和治疗，对急救病人和控制疫病蔓延有重要意义。2001年11月本实验室用模拟炭疽杆菌样本，以聚合酶链反应(PCR)技术，对炭疽杆菌DNA进行了实验性检测。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料 (1)无毒型炭疽芽孢杆菌(以下简称炭疽杆菌)2株，即毒素质粒阳性(POX1)，荚膜质粒缺乏;荚膜质粒阳性(POX2)，毒素质粒缺乏株。由青海大学农牧学院微生物教研室提供。(2)小白鼠(昆明系)。(3)枯草杆菌、腊样芽孢杆菌、大肠杆菌实验室自备。(4)面粉、豌豆淀粉。
1.1.2 炭疽杆菌DNA引物 参照文献 [2] ，由中国微生物研究所合成。
PA P1 5′GAT GAA TTC ACC AGA GGC AAG AC3′
P2 5′CTG CTA GAG ATA GTG AAT GA3′CaP
P3 5′GCT GAT CTT GAC TAT GTG GGT G3′
, 百拇医药
P4 5′GGC TCA GGA TCT GTC CTT CGG31.
1.3 试剂 DNA提取液、DST裂解液、DNTP反应液，上海复旦大学医学院程新建教授提供;LB培养液、醋酸亚砣选择性培养基、酚氯仿抽提液实验室自备。
1.2 方法
1.2.1 小鼠接种 分2组，各4只，2株炭疽杆菌稀释液(10 3 /ml)0.2ml分别接种腹腔，72h解剖，取腹水、血液、肝、脾组织按PCR常规处理，DST裂解液提取DNA。
1.2.2 模拟的白色粉末面粉、豌豆粉 按5g分装，各8管，4管经高压灭菌，4管不作处理。每4管内分别加入10 4 /ml POX1、POX2稀释液0.25ml，混匀后密闭试管内，置冰箱存放。经15天、30天检测炭疽杆菌DNA。
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1.2.3 白色粉末面粉、豌豆粉处理 每份样本50ml 10mmol/L PBS液混匀，500g/min离心10min，上清液400g/min离心10min，PBS洗涤3次，200μl PBS稀释，100μl酚氯仿提取DNA，100μl接种LB培养液及选择培养基。
1.2.4 枯草杆菌、腊样芽孢杆菌、大肠杆菌肉汤培养物 各取一接种环加入0.5ml生理盐水，分别与POX1、 POX210μL混合，DST裂解液提取炭疽杆菌DNA。
1.2.5 痰液、脓汁混入POX1、POX2菌液 按PCR常规处理DST裂解液提取炭疽杆菌DNA。
1.3 PCR反应系统 每对引物各2μl、TaqDNA聚合酶1μl、DNTP15μl、炭疽杆菌提取物3μl，按PCR常规扩增，设POX1、POX2阳性对照。
1.4 观察反应 阳性POX1290bp、POX2288bp。如检测病例性炭疽杆菌，强阳性炭疽杆菌可同时扩增到PA基因290bp和Cap基因288bp。
, 百拇医药
2 结果
2.1 两组PCR扩增检测POX2 2组小白鼠腹水8份，血、肝、脾24份，PCR扩增检测POX1、POX2均为阳性。
2.2 两组炭疽杆菌混合物的DNA提取物PCR扩增检测结果 模拟白色粉末炭疽杆菌混合物，经消毒淀粉的2组炭疽杆菌混合物的DNA提取物，PCR扩增检测阴性;经LB培养液震荡培养6～8h，PCR扩增到DNA阳性;2组未经消毒淀粉组PCR扩增阴性。LB震荡培养8h，炭疽杆菌15天存放组出现1份阳性，其余均为阴性，但选择培养基可获菌落生长阳性。
2.3 PCR检测观察POX1、POX2 枯草杆菌、腊样芽孢杆菌、大肠杆菌及炭疽杆菌混合，未经过培养，虽然杂菌量大，PCR检测仍观察到POX1、POX2阳性。
2.4 痰液组、脓汁组PCR检测 POX1、POX2结果均为阳性。
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3 讨论
实验室选择PA基因、Cap基因的POX1、POX2在PCR检测炭疽杆菌具有特异性，与其他革兰阳性菌、革兰阴性菌未观察到交叉反应。
炭疽杆菌动物实验材料和病理物质的实验材料中，PCR检测均可观察到POX1、POX2阳性条带。提示如在临床病例中的皮肤型炭疽、肺炭疽和败血型炭疽，应用PCR检测可快速诊断感染性炭疽疾病。惟病理材料应及时送检。
模拟白色粉末组，放置15天、30天样本，经PBS处理，LB震荡培养，经消毒的面粉、豌豆粉组PCR检测POX1、POX2为阳性反应;未经消毒组为阴性反应，说明大量杂菌繁殖可以直接影响炭疽杆菌的成活。炭疽杆菌感染后人畜病例，可能会应用抗生素治疗，使菌体细胞壁受到破坏，成为L型菌体，一般常规培养法尚不能分离出炭疽杆菌 [3] 。但应用PCR方法可以直接检测到炭疽杆菌，对病例诊断可提供病原学依据。
参考文献
1 董树林.炭疽及其防治.银川:宁夏人民出版社，1997，2-4.
2 梁旭东.现代炭疽研究进展.北京:中国农业出版社，1998，304-305.
3 董树林.炭疽的临床和治疗现状.中国人畜共患病杂志，2000，16(6):91.
作者单位:810007青海省疾病预防控制中心
(编辑李年令), 百拇医药(刘桂香)
炭疽是由炭疽杆菌所引发的一种人畜共患的急性传染病。祖国医学对炭疽的认识源远流长，早将其列为疔疽之类，《诸病原候论》，名曰疔疽。中兽医名曰黄。《素问疮黄论》对炭疽败血症也有认识。唐朝孙思邈《备急千金要方》谓病症之急曰“至于疔肿，若不预识，令人死不待衣;若著讫欲求方，其人已入木矣” [1] 。
现代医学认为炭疽是由炭疽杆菌病原体所致疾病，主要存在于食草动物和牲畜群落，能产生芽孢，对外界产生极强抵抗力，造成环境长期污染。人群感染后常为散发性疾病，病程急剧，死亡率高。同时炭疽杆菌被作为潜在性的生物武器早已为人们所认识，美国爆发的炭疽生物恐怖活动更突出了该菌对公众健康的巨大危害，因此对炭疽杆菌感染后作出及时诊断和治疗，对急救病人和控制疫病蔓延有重要意义。2001年11月本实验室用模拟炭疽杆菌样本，以聚合酶链反应(PCR)技术，对炭疽杆菌DNA进行了实验性检测。
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1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料 (1)无毒型炭疽芽孢杆菌(以下简称炭疽杆菌)2株，即毒素质粒阳性(POX1)，荚膜质粒缺乏;荚膜质粒阳性(POX2)，毒素质粒缺乏株。由青海大学农牧学院微生物教研室提供。(2)小白鼠(昆明系)。(3)枯草杆菌、腊样芽孢杆菌、大肠杆菌实验室自备。(4)面粉、豌豆淀粉。
1.1.2 炭疽杆菌DNA引物 参照文献 [2] ，由中国微生物研究所合成。
PA P1 5′GAT GAA TTC ACC AGA GGC AAG AC3′
P2 5′CTG CTA GAG ATA GTG AAT GA3′CaP
P3 5′GCT GAT CTT GAC TAT GTG GGT G3′
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P4 5′GGC TCA GGA TCT GTC CTT CGG31.
1.3 试剂 DNA提取液、DST裂解液、DNTP反应液，上海复旦大学医学院程新建教授提供;LB培养液、醋酸亚砣选择性培养基、酚氯仿抽提液实验室自备。
1.2 方法
1.2.1 小鼠接种 分2组，各4只，2株炭疽杆菌稀释液(10 3 /ml)0.2ml分别接种腹腔，72h解剖，取腹水、血液、肝、脾组织按PCR常规处理，DST裂解液提取DNA。
1.2.2 模拟的白色粉末面粉、豌豆粉 按5g分装，各8管，4管经高压灭菌，4管不作处理。每4管内分别加入10 4 /ml POX1、POX2稀释液0.25ml，混匀后密闭试管内，置冰箱存放。经15天、30天检测炭疽杆菌DNA。
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1.2.3 白色粉末面粉、豌豆粉处理 每份样本50ml 10mmol/L PBS液混匀，500g/min离心10min，上清液400g/min离心10min，PBS洗涤3次，200μl PBS稀释，100μl酚氯仿提取DNA，100μl接种LB培养液及选择培养基。
1.2.4 枯草杆菌、腊样芽孢杆菌、大肠杆菌肉汤培养物 各取一接种环加入0.5ml生理盐水，分别与POX1、 POX210μL混合，DST裂解液提取炭疽杆菌DNA。
1.2.5 痰液、脓汁混入POX1、POX2菌液 按PCR常规处理DST裂解液提取炭疽杆菌DNA。
1.3 PCR反应系统 每对引物各2μl、TaqDNA聚合酶1μl、DNTP15μl、炭疽杆菌提取物3μl，按PCR常规扩增，设POX1、POX2阳性对照。
1.4 观察反应 阳性POX1290bp、POX2288bp。如检测病例性炭疽杆菌，强阳性炭疽杆菌可同时扩增到PA基因290bp和Cap基因288bp。
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2 结果
2.1 两组PCR扩增检测POX2 2组小白鼠腹水8份，血、肝、脾24份，PCR扩增检测POX1、POX2均为阳性。
2.2 两组炭疽杆菌混合物的DNA提取物PCR扩增检测结果 模拟白色粉末炭疽杆菌混合物，经消毒淀粉的2组炭疽杆菌混合物的DNA提取物，PCR扩增检测阴性;经LB培养液震荡培养6～8h，PCR扩增到DNA阳性;2组未经消毒淀粉组PCR扩增阴性。LB震荡培养8h，炭疽杆菌15天存放组出现1份阳性，其余均为阴性，但选择培养基可获菌落生长阳性。
2.3 PCR检测观察POX1、POX2 枯草杆菌、腊样芽孢杆菌、大肠杆菌及炭疽杆菌混合，未经过培养，虽然杂菌量大，PCR检测仍观察到POX1、POX2阳性。
2.4 痰液组、脓汁组PCR检测 POX1、POX2结果均为阳性。
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3 讨论
实验室选择PA基因、Cap基因的POX1、POX2在PCR检测炭疽杆菌具有特异性，与其他革兰阳性菌、革兰阴性菌未观察到交叉反应。
炭疽杆菌动物实验材料和病理物质的实验材料中，PCR检测均可观察到POX1、POX2阳性条带。提示如在临床病例中的皮肤型炭疽、肺炭疽和败血型炭疽，应用PCR检测可快速诊断感染性炭疽疾病。惟病理材料应及时送检。
模拟白色粉末组，放置15天、30天样本，经PBS处理，LB震荡培养，经消毒的面粉、豌豆粉组PCR检测POX1、POX2为阳性反应;未经消毒组为阴性反应，说明大量杂菌繁殖可以直接影响炭疽杆菌的成活。炭疽杆菌感染后人畜病例，可能会应用抗生素治疗，使菌体细胞壁受到破坏，成为L型菌体，一般常规培养法尚不能分离出炭疽杆菌 [3] 。但应用PCR方法可以直接检测到炭疽杆菌，对病例诊断可提供病原学依据。
参考文献
1 董树林.炭疽及其防治.银川:宁夏人民出版社，1997，2-4.
2 梁旭东.现代炭疽研究进展.北京:中国农业出版社，1998，304-305.
3 董树林.炭疽的临床和治疗现状.中国人畜共患病杂志，2000，16(6):91.
作者单位:810007青海省疾病预防控制中心
(编辑李年令), 百拇医药(刘桂香)