内皮素1在噬菌体表面的呈现及检测
【摘要】 目的 使内皮素1(endothlin1，ET1)在噬菌体表面呈现，尝试制备ET1抗体疫苗，治疗ET1病理性疾病。方法 利用噬菌体呈现技术，经辅助噬菌体超感染以得到大量的ET1重组噬菌体粒子，并利用酶联免疫吸附测定和点杂交检测重组噬菌体粒子的免疫反应性。结果 制备的ET1重组噬菌体的滴度可达4×10 16 CFU/ml，ET1重组噬菌体粒子具有ET1的免疫反应性。结论 研究ET1基因在噬菌体表面的呈现，不仅可以分析ET1与其他蛋白质之间的相互作用，受体识别位点的结构及其空间结构的关系，更为重要的是可以进行ET1重组噬菌体疫苗研制的尝试。
关键词 噬菌体呈现 内皮素1 酶联免疫吸附测定 点杂交
【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2003)20-1837-03
Phage display of human endothelin1and its analyses
, http://www.100md.com
Shi Jihong，Zhang Yingqi，Wan Yi，et al.
Biotechnology Center，The Fouth Military Medical University，Xi’an710032.
【Abstract】 Objective To display human Endothelin1(ET1)，comprised of21amino acid residues with a relativemolecular mass2492，is a potent vasoconstrictor and has important pathophysiological roles，on the surface of filamentous bacteriophage and to prepare ET1antibody vaccine.Methods Using a phagemid vector system(pCANTAB5E)，ET1was successfully displayed on the surface of filamentous bacteriophage，the ET1cDNAwas fused to a DNA sequence encoding the amino-terminaldomain of pШ，a minor coat protein exposed at one end of the phage.Fusion ET1gene was packeged into phagemid particles upon superinfection with M13kO7helper phage.Reˉsults Expression of ET1recombinant phage with a titer of4×10 16 CFU/ml，had immunoreactivity using ELISA and dot blotting methods.Conclution This is helpful to studing the relationships between ET1and its relative proteins，its receptor，and more helpful to trying to preprate ET1vaccine and its phage antibody.
, 百拇医药
Key words phage display endothelin1 ELISA dot blot
噬菌体表面呈现技术是将编码外源多肽或蛋白的基因片段与噬菌体衣壳蛋白的基因融合，使外源多肽或蛋白呈现于噬菌体衣壳蛋白表面的一项技术，1985年由Smith [1] 首先建立，该项技术已被广泛地应用于生物技术的许多领域。
内皮素1(endothelin1，ET1)是1988年由Yanagisawa等 [2] 从培养的猪主动脉内皮细胞上清液中分离纯化出的一种小分子血管收缩肽，其相对分子量为2492，由21个氨基酸组成，广泛分布于神经系统，循环系统和内分泌系统等。ET1具有广泛的生物学活性，作为强效的缩血管肽和血管平滑肌细胞有丝分裂原参与心肌缺血，高血压脑卒中以及肾衰等许多疾病的发病过程，在病理情况下，ET1的合成释放增加 [3] 。研究ET1基因在噬菌体表面的呈现，可以分析与其他蛋白质之间的相互作用，受体识别位点的结构及ET1空间结构的关系，为多肽类药物的设计、多肽疫苗及噬菌体疫苗的研制提供重要的方法。本文将ET1表达在噬菌体P3蛋白的N末端，并对重组噬菌体进行了鉴定，旨在制备出ET1重组噬菌体粒子，在体内产生其抗体以中和患者体内过量的ET1，达到治疗疾病之目的。
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1 材料与方法
1.1 菌株及质粒载体 TG1[基因型为SupE，hsd△5，thi△(lac-proAB)F’traD36，proAB，lacIq，LacZ△M15]为本中心保存，噬菌粒pCANTAB5E和辅助噬菌体M13kO7均购自 Pharmacia公司。
1.2 ET1基因片段的合成 委托上海博亚生物技术有限公司合成两端带有Not1和Sfi1酶切位点的片段F1CGGCˉCTGCTCCTGCTCTTCCCTGATGGATAAAGAGTGTGTCTACTTCTG CCACCTGGACATCATCTGGGC(70mer);F 2GGCCGCCCAˉGATGATGTCCAGGTGGCAGAAGTAGACACACTCTTTATCCATCA GGGA AGAGCAGGAGCAGGCCGGCT(77mer)。
1.3 主要试剂 质粒提取试剂盒为Omega bio-tek公司产品，鼠抗人ET1单克隆抗体为Oncogene公司产品，HRP标记的抗M13多抗购自Phamarcia公司，96孔酶标板为Nunc公司产品，内切酶Sfi1和Not1购自Takara公司，Tryptone和Yeast extract均为Oxoid公司产品，其余均为国产分析纯试剂。
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1.4 重组噬菌体的构建 参照文献 [4，5] 进行，用适量灭菌水把片段F1和F2配制成100pmol/μl，取稀释的F1和F2各2μl经100℃水浴2min，自然降温，获取含Sfi1和Not1粘性末端的ET1片段，插入到经Sfi1和Not1消化的pCANTAB5E载体，转化受体细胞TG1，37℃培养过夜。在2YTAG板(100μg/ml氨苄青霉素，2%葡萄糖)上随机挑取阳性克隆，命名为pCANTAB5E-ET1/TG1，提取质粒进行酶切鉴定及序列测定证实。
1.5 ET1重组噬菌体的制备 pCANTAB5E-ET1/TG1阳性克隆30℃过夜培养后，按1%转接于50ml2YTAG液体培养基中，30℃约2～3h培养至对数中期(OD 600 为0.5)，加入2×10 10 PFU/ml辅助噬菌体M13kO7，37℃感染1h后，离心弃上清，菌体重悬于装有250ml2YTAK(50μg/ml卡那霉素)的三角瓶中，30℃培养过夜，离心弃细胞。上清转入另一洁净离心管中，加入终浓度4%的PEG8000和3%NaCl，摇床上振荡5min促溶，冰浴30min，4℃离心20min沉淀噬菌体，弃上清。用2ml悬浮噬菌体沉淀，再离心进一步除去残留的细菌碎片，上清即为重组噬菌体。
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1.6 ET1重组噬菌体的滴度测定 按参考文献 [6] 进行，将TG1划线接种于M 9 平板上37℃培养16h，取单菌落转接于10ml2YT液体培养基中，于37℃振荡培养过夜，按1%转接同样条件下培养至OD 600 为0.5时，取各100μl菌液与制备的不同稀释度的ET1重组噬菌体分别混匀，置室温10min，铺于2YTAG平板上37℃培养16h，计算出所长的菌落数。1.7 ET1重组噬菌体的ELISA和免疫点杂交鉴定 用ELISA测定ET1重组噬菌体的免疫学性质，包被抗ET1单克隆抗体100μl(1∶250)4℃过夜，次日用1%的BSA/TBST封闭，100μl重组噬菌体混合100μl BSA/TBST2h后，加入包被孔中，37℃反应2h，加入HRP标记的噬菌体多克隆抗体1h，充分洗涤后经ABTS显色，测定410nm的吸收值。将ET1重组噬菌体1μl直接点于NC膜上，置室温下自然干燥，将NC膜浸于1%BSA-TBST进行封闭，TBST洗涤后加入鼠抗人ET1单克隆抗体IgG30～60min，TBST再次洗涤后，加AP标记的羊抗鼠IgG室温孵育30～60min，TBS洗涤后用AP底物显色，蒸馏水冲洗终止反应，自然干燥后闭光保存。
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2 结果
2.1 重组噬菌体载体pCANTAB5E-ET1的构建 通过退火形成的ET1基因片段克隆至pCANTAB5E载体中，构建了重组噬菌体pCANTAB5E-ET1。由于ET1的片段较小[Sfi1(2235)和Not1位点之间]，我们采用了pCANTAB5E启动子上游的HindⅢ位点(2323)和NotⅠ进行了双酶切鉴定，能够酶切出158bp的核酸片段，在pCANTAB5E的Sfi1和Not1之间有一个Pst1位点，故重组的噬菌粒pCANTAB5E-ET1用Pst1酶切作为阴性对照，EcoR1酶切使重组噬菌粒线形化(见图1)，表明ET1基因已正确插入到pCANTAB5E的Sfi1和Not1位点之间。同时对重组噬菌体载体进行了核酸序列的进一步测序证实，这些均与预期和设计的结果一致。 图1 重组噬菌粒的酶切鉴定1.pCANTAB5E(Not1+Sfi1) 2.DL-2000(Marker)3.pCANTAB5E-ET1(EcoR1)
4.pCANTAB5E-ET1(HindⅢ+Not1) 5.pCANTAB5E-ET1(Pst1阴性对照)
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2.2 重组噬菌体的ELISA测定 用鼠抗人ET1单抗隆抗体包被酶标板，加入制备的不同稀释浓度的ET1重组噬菌 体和HRP标记的噬菌体多克隆抗体等处理显色后测得的OD 410 值(见图2)，可见ET1重组噬菌体与ET1单抗隆抗体能够特异性结合，结合能力的大小与ET1重组噬菌体的浓度相关。 图2 ET1重组噬菌体的免疫活性
2.3 重组噬菌体滴度的测定 取OD 600 培养至0.5的100μl的TG1菌液与制备的10 11 和10 12 稀释度的重组噬菌体分别混匀，铺于2YTAG平板37℃过夜培养后，所长出的菌落数依次为284和56，由此可知重组噬菌体的滴度为4×10 16 CFU/ml。
2.4 重组噬菌体的免疫点杂交测定 ET1重组噬菌体点加于NC膜上，经鼠抗人ET1单克隆抗IgG和AP标记的羊抗鼠IgG处理显色后，辅助噬菌体M13kO7几乎不显色或显色较淡，而ET1重组噬菌体呈褐色(见图2)。可见ET1重组噬菌体与鼠抗人ET1单克隆抗IgG的结合是特异的。图3 重组噬菌体的点杂交结果1.重组噬菌体 2.辅助噬菌体M13kO7
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3 讨论
内皮素(ET)在心血管系统中具有重要的生理和病理作用。一方面，ET是一种迄今发现的作用最强的血管收缩肽，维持血管收缩和平滑肌增殖的正常生理功能;另一方面，ET又是动脉粥样硬化症、先天性心脏病伴肺动脉高血压和血压升高的致病因子。人们称ET系统为人类健康和疾病的双刃剑 [3] 。至今，ET与心血管疾病一直是临床医学与基础医学研究的热点。
人ET1是一仅有21个氨基酸组成的小分子肽，单独在细胞中的表达比较困难，制备其抗体就更加不易。本文构建的ET1重组噬菌粒能够在辅助噬菌体M13kO7的作用下从细菌中释放出ET1重组噬菌体，使ET1在噬菌体表面得到了表达。这种表达系统的最大优点在于将在大肠杆菌体内表达的外源基因产物有效地转移到了膜上进行直接研究，另外由于单链噬菌体的可分泌性，在培养细菌的上清中可获得大量扩增的噬菌体颗粒，只需一次简单的沉淀便可富集到含外源基因产物ET1的重组噬菌体颗粒。
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我们制备的ET1重组噬菌体滴度可达4×10 16 CFU/ml，为ET1重组噬菌体的制备提供了保障;ELISA和Dot Blot免疫方面的结果表明，制备的ET1重组噬菌体与ET1抗体结合的特异性较好，这就有可能利用纯化好的ET1重组噬菌体作为免疫源来免疫动物，使其在体内产生抗E
T1重组噬菌体抗体以中和体内过量的ET1，以寻求治疗心血管、高血压等病症的新疗法，该方面的研究工作正在进行之中。
参考文献
1 Smith G P.Filamentous fusion phage:novel expression vectors that disˉplay cloned antigens onthevironsurface.Science，1985，228:1315-1317.
2 Yanagisawa M，Kurihara H，Kimura S，et al.A novel potent vasoconstricˉtorpeptide produced by vascular endothelial cells.Nature，1988，332(31):411-415.
, http://www.100md.com
3 Kedzierski R M，Yanagisawa M.Endothelin system:the double-edged sword in health and disease.Annu Rev Pharmacol Toxicol.，2001，41:851-857.
4 石继红，韩苇，颜真，等.天然胸腺素α1基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达.中国生化药物杂志，2003，24(2):55-57.
5 石继红，张英起，赵永同，等.胸腺素α1基因的克隆表达极其生物活性.中国生物化学与分子生物学学报，2001，17(3):344-349.
6 Pasqualini R，Ruoslahti E.Organ targeting in vivo using phage display peptide libraries.Nature，1996，380:364-366.
作者单位:710032陕西西安第四军医大学生物技术中心
(编辑 心怡), 百拇医药
关键词 噬菌体呈现 内皮素1 酶联免疫吸附测定 点杂交
【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2003)20-1837-03
Phage display of human endothelin1and its analyses
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Shi Jihong，Zhang Yingqi，Wan Yi，et al.
Biotechnology Center，The Fouth Military Medical University，Xi’an710032.
【Abstract】 Objective To display human Endothelin1(ET1)，comprised of21amino acid residues with a relativemolecular mass2492，is a potent vasoconstrictor and has important pathophysiological roles，on the surface of filamentous bacteriophage and to prepare ET1antibody vaccine.Methods Using a phagemid vector system(pCANTAB5E)，ET1was successfully displayed on the surface of filamentous bacteriophage，the ET1cDNAwas fused to a DNA sequence encoding the amino-terminaldomain of pШ，a minor coat protein exposed at one end of the phage.Fusion ET1gene was packeged into phagemid particles upon superinfection with M13kO7helper phage.Reˉsults Expression of ET1recombinant phage with a titer of4×10 16 CFU/ml，had immunoreactivity using ELISA and dot blotting methods.Conclution This is helpful to studing the relationships between ET1and its relative proteins，its receptor，and more helpful to trying to preprate ET1vaccine and its phage antibody.
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Key words phage display endothelin1 ELISA dot blot
噬菌体表面呈现技术是将编码外源多肽或蛋白的基因片段与噬菌体衣壳蛋白的基因融合，使外源多肽或蛋白呈现于噬菌体衣壳蛋白表面的一项技术，1985年由Smith [1] 首先建立，该项技术已被广泛地应用于生物技术的许多领域。
内皮素1(endothelin1，ET1)是1988年由Yanagisawa等 [2] 从培养的猪主动脉内皮细胞上清液中分离纯化出的一种小分子血管收缩肽，其相对分子量为2492，由21个氨基酸组成，广泛分布于神经系统，循环系统和内分泌系统等。ET1具有广泛的生物学活性，作为强效的缩血管肽和血管平滑肌细胞有丝分裂原参与心肌缺血，高血压脑卒中以及肾衰等许多疾病的发病过程，在病理情况下，ET1的合成释放增加 [3] 。研究ET1基因在噬菌体表面的呈现，可以分析与其他蛋白质之间的相互作用，受体识别位点的结构及ET1空间结构的关系，为多肽类药物的设计、多肽疫苗及噬菌体疫苗的研制提供重要的方法。本文将ET1表达在噬菌体P3蛋白的N末端，并对重组噬菌体进行了鉴定，旨在制备出ET1重组噬菌体粒子，在体内产生其抗体以中和患者体内过量的ET1，达到治疗疾病之目的。
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1 材料与方法
1.1 菌株及质粒载体 TG1[基因型为SupE，hsd△5，thi△(lac-proAB)F’traD36，proAB，lacIq，LacZ△M15]为本中心保存，噬菌粒pCANTAB5E和辅助噬菌体M13kO7均购自 Pharmacia公司。
1.2 ET1基因片段的合成 委托上海博亚生物技术有限公司合成两端带有Not1和Sfi1酶切位点的片段F1CGGCˉCTGCTCCTGCTCTTCCCTGATGGATAAAGAGTGTGTCTACTTCTG CCACCTGGACATCATCTGGGC(70mer);F 2GGCCGCCCAˉGATGATGTCCAGGTGGCAGAAGTAGACACACTCTTTATCCATCA GGGA AGAGCAGGAGCAGGCCGGCT(77mer)。
1.3 主要试剂 质粒提取试剂盒为Omega bio-tek公司产品，鼠抗人ET1单克隆抗体为Oncogene公司产品，HRP标记的抗M13多抗购自Phamarcia公司，96孔酶标板为Nunc公司产品，内切酶Sfi1和Not1购自Takara公司，Tryptone和Yeast extract均为Oxoid公司产品，其余均为国产分析纯试剂。
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1.4 重组噬菌体的构建 参照文献 [4，5] 进行，用适量灭菌水把片段F1和F2配制成100pmol/μl，取稀释的F1和F2各2μl经100℃水浴2min，自然降温，获取含Sfi1和Not1粘性末端的ET1片段，插入到经Sfi1和Not1消化的pCANTAB5E载体，转化受体细胞TG1，37℃培养过夜。在2YTAG板(100μg/ml氨苄青霉素，2%葡萄糖)上随机挑取阳性克隆，命名为pCANTAB5E-ET1/TG1，提取质粒进行酶切鉴定及序列测定证实。
1.5 ET1重组噬菌体的制备 pCANTAB5E-ET1/TG1阳性克隆30℃过夜培养后，按1%转接于50ml2YTAG液体培养基中，30℃约2～3h培养至对数中期(OD 600 为0.5)，加入2×10 10 PFU/ml辅助噬菌体M13kO7，37℃感染1h后，离心弃上清，菌体重悬于装有250ml2YTAK(50μg/ml卡那霉素)的三角瓶中，30℃培养过夜，离心弃细胞。上清转入另一洁净离心管中，加入终浓度4%的PEG8000和3%NaCl，摇床上振荡5min促溶，冰浴30min，4℃离心20min沉淀噬菌体，弃上清。用2ml悬浮噬菌体沉淀，再离心进一步除去残留的细菌碎片，上清即为重组噬菌体。
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1.6 ET1重组噬菌体的滴度测定 按参考文献 [6] 进行，将TG1划线接种于M 9 平板上37℃培养16h，取单菌落转接于10ml2YT液体培养基中，于37℃振荡培养过夜，按1%转接同样条件下培养至OD 600 为0.5时，取各100μl菌液与制备的不同稀释度的ET1重组噬菌体分别混匀，置室温10min，铺于2YTAG平板上37℃培养16h，计算出所长的菌落数。1.7 ET1重组噬菌体的ELISA和免疫点杂交鉴定 用ELISA测定ET1重组噬菌体的免疫学性质，包被抗ET1单克隆抗体100μl(1∶250)4℃过夜，次日用1%的BSA/TBST封闭，100μl重组噬菌体混合100μl BSA/TBST2h后，加入包被孔中，37℃反应2h，加入HRP标记的噬菌体多克隆抗体1h，充分洗涤后经ABTS显色，测定410nm的吸收值。将ET1重组噬菌体1μl直接点于NC膜上，置室温下自然干燥，将NC膜浸于1%BSA-TBST进行封闭，TBST洗涤后加入鼠抗人ET1单克隆抗体IgG30～60min，TBST再次洗涤后，加AP标记的羊抗鼠IgG室温孵育30～60min，TBS洗涤后用AP底物显色，蒸馏水冲洗终止反应，自然干燥后闭光保存。
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2 结果
2.1 重组噬菌体载体pCANTAB5E-ET1的构建 通过退火形成的ET1基因片段克隆至pCANTAB5E载体中，构建了重组噬菌体pCANTAB5E-ET1。由于ET1的片段较小[Sfi1(2235)和Not1位点之间]，我们采用了pCANTAB5E启动子上游的HindⅢ位点(2323)和NotⅠ进行了双酶切鉴定，能够酶切出158bp的核酸片段，在pCANTAB5E的Sfi1和Not1之间有一个Pst1位点，故重组的噬菌粒pCANTAB5E-ET1用Pst1酶切作为阴性对照，EcoR1酶切使重组噬菌粒线形化(见图1)，表明ET1基因已正确插入到pCANTAB5E的Sfi1和Not1位点之间。同时对重组噬菌体载体进行了核酸序列的进一步测序证实，这些均与预期和设计的结果一致。 图1 重组噬菌粒的酶切鉴定1.pCANTAB5E(Not1+Sfi1) 2.DL-2000(Marker)3.pCANTAB5E-ET1(EcoR1)
4.pCANTAB5E-ET1(HindⅢ+Not1) 5.pCANTAB5E-ET1(Pst1阴性对照)
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2.2 重组噬菌体的ELISA测定 用鼠抗人ET1单抗隆抗体包被酶标板，加入制备的不同稀释浓度的ET1重组噬菌 体和HRP标记的噬菌体多克隆抗体等处理显色后测得的OD 410 值(见图2)，可见ET1重组噬菌体与ET1单抗隆抗体能够特异性结合，结合能力的大小与ET1重组噬菌体的浓度相关。 图2 ET1重组噬菌体的免疫活性
2.3 重组噬菌体滴度的测定 取OD 600 培养至0.5的100μl的TG1菌液与制备的10 11 和10 12 稀释度的重组噬菌体分别混匀，铺于2YTAG平板37℃过夜培养后，所长出的菌落数依次为284和56，由此可知重组噬菌体的滴度为4×10 16 CFU/ml。
2.4 重组噬菌体的免疫点杂交测定 ET1重组噬菌体点加于NC膜上，经鼠抗人ET1单克隆抗IgG和AP标记的羊抗鼠IgG处理显色后，辅助噬菌体M13kO7几乎不显色或显色较淡，而ET1重组噬菌体呈褐色(见图2)。可见ET1重组噬菌体与鼠抗人ET1单克隆抗IgG的结合是特异的。图3 重组噬菌体的点杂交结果1.重组噬菌体 2.辅助噬菌体M13kO7
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3 讨论
内皮素(ET)在心血管系统中具有重要的生理和病理作用。一方面，ET是一种迄今发现的作用最强的血管收缩肽，维持血管收缩和平滑肌增殖的正常生理功能;另一方面，ET又是动脉粥样硬化症、先天性心脏病伴肺动脉高血压和血压升高的致病因子。人们称ET系统为人类健康和疾病的双刃剑 [3] 。至今，ET与心血管疾病一直是临床医学与基础医学研究的热点。
人ET1是一仅有21个氨基酸组成的小分子肽，单独在细胞中的表达比较困难，制备其抗体就更加不易。本文构建的ET1重组噬菌粒能够在辅助噬菌体M13kO7的作用下从细菌中释放出ET1重组噬菌体，使ET1在噬菌体表面得到了表达。这种表达系统的最大优点在于将在大肠杆菌体内表达的外源基因产物有效地转移到了膜上进行直接研究，另外由于单链噬菌体的可分泌性，在培养细菌的上清中可获得大量扩增的噬菌体颗粒，只需一次简单的沉淀便可富集到含外源基因产物ET1的重组噬菌体颗粒。
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T1重组噬菌体抗体以中和体内过量的ET1，以寻求治疗心血管、高血压等病症的新疗法，该方面的研究工作正在进行之中。
参考文献
1 Smith G P.Filamentous fusion phage:novel expression vectors that disˉplay cloned antigens onthevironsurface.Science，1985，228:1315-1317.
2 Yanagisawa M，Kurihara H，Kimura S，et al.A novel potent vasoconstricˉtorpeptide produced by vascular endothelial cells.Nature，1988，332(31):411-415.
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3 Kedzierski R M，Yanagisawa M.Endothelin system:the double-edged sword in health and disease.Annu Rev Pharmacol Toxicol.，2001，41:851-857.
4 石继红，韩苇，颜真，等.天然胸腺素α1基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达.中国生化药物杂志，2003，24(2):55-57.
5 石继红，张英起，赵永同，等.胸腺素α1基因的克隆表达极其生物活性.中国生物化学与分子生物学学报，2001，17(3):344-349.
6 Pasqualini R，Ruoslahti E.Organ targeting in vivo using phage display peptide libraries.Nature，1996，380:364-366.
作者单位:710032陕西西安第四军医大学生物技术中心
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