大蒜素对膀胱癌的抗肿瘤效果
【摘要】 目的 探讨大蒜素对膀胱肿瘤的治疗效果。方法 小鼠膀胱肿瘤细胞(MBT-2)由日本癌症资源库提供。我们采用了MTT法评估大蒜素对肿瘤细胞体外生长的直接影响。为测定大蒜素在体内的抗肿瘤效果，在实验前将C3H/HeN小鼠随机分组。在实验当日将1×105 MBT-2肿瘤细胞注射到小鼠右后侧腹皮下。次日将大蒜素注射到肿瘤附近的皮下。每周两次用测量器测定肿瘤的两径以检查肿瘤的发展。结果 MTT实验表明大蒜素对膀胱肿瘤细胞有明显的直接细胞毒作用。皮下注射大蒜素与生理盐水对照组相比，大蒜素治疗组明显延迟了肿瘤发生和生长。这些抗肿瘤效果与剂量呈正比。结论 大蒜素对膀胱肿瘤有明显的抑制作用。这种作用可能与其直接细胞毒作用和激活免疫反应有关。其可能作为一种表浅膀胱癌的腔内治疗药物而应用于临床。
关键词 大蒜素 治疗效果 膀胱肿瘤
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)16-2409-03
, 百拇医药
The effect of allicin on resisting
urinary bladder cancer
Wang Jian，He Huijun，He Chengwei，et al.
Dept of Urology of Affiliated Hospital of Guang-dong Medical College，Guangzhou524001.
【Abstract】 Objective To discuss the treatment effect of allicin on bladder tumor.Methods Murine bladder tumor cells(MBT-2)are kindly provided by JCRB cell bank.We evaluated the direct effects of allicin in vitro by MTT assay.To determine anti-tumor effect of allicin，in vivo，C3H/HeN mice were randomized priorto initiation of experiment.Mice received1×10 5 MBT2cells administered subcutaneously(s.c)into the right posterio flank.Allicin was injected at the site near tumor transplantation on next day.The mice were examined for tumor developmentand the tumors were measured in two dimensions with calipers twice weekly.Results Our experience with the MTT assay sugˉgest that allicin has significant direct cytotoxicity to bladder cancer cells.It showed a marked delay in the appearance and growth of tumors after s.c.injection compared to control group.This anti-tumor effect was direct ratio with the allicin’s dose.Conclusion Allicin has a marked anti-tumor effect on bladder tumor.This effect may be related to direct cytotoxicity and immune response.It may be an effective intravesical treatment agent for superficial bladder canˉcer.
, 百拇医药
Key words allicin treatment effect bladder tumor
膀胱癌在我国是泌尿外科最常见的恶性肿瘤，占男性全身恶性肿瘤发病率的第七位，并且有逐渐增加的趋势 [1，2] 。在初始阶段大约70%肿瘤是表浅性，余下的30%则有肌肉侵犯和(或)转移。经尿道肿瘤切除后，辅以灌注化疗能减少肿瘤复发。多项研究表明腔内卡介苗(BCG)治疗优于化学治疗。现在BCG免疫治疗是膀胱原位癌和浸润型Ta，T1移行细胞癌的标准治疗。但是BCG的毒性妨碍了一些患者的使用，有时甚至威胁生命;因此，促使我们去寻找治疗表浅膀胱癌的其它治疗药物。
大蒜在我国民间药用已有三千多年的历史。现代研究提示大蒜有良好的防癌、抑癌作用[3] 。有报道显示大蒜提取液对膀胱肿瘤生长有明显抑制作用，但是一些实验动物死于治疗相关的毒性 [4] 。ˇ 基金项目:广东医学院附属医院博士启动基金资助(编号74号)
, 百拇医药
MBT-2肿瘤细胞是美国田纳西大学(Tennessee Univerˉsity)M.S.Soloway利用口服N-甲酰胺(FANFT)从C3H小鼠诱发而来 [5] 。这种低分化移行细胞癌所表现的转移特性与人移行细胞癌相类似。为了解大蒜素对膀胱肿瘤的治疗效果和机理，我们测定了大蒜素在体外对肿瘤细胞生长的影响，并且评估了其在体内的抗肿瘤效果。
1 材料与方法
1.1 肿瘤细胞和大蒜素 MBT-2肿瘤细胞由日本癌症资源库(JCRB)的细胞库提供(细胞编号:IFO50041)。培养于含10%小牛血清(FBS)的DMEM(GIBCO BRL，Life Technoloˉgies Inc.，Rockville，MD，USA)和37℃以及5%CO 2 中。大蒜素是由金龙福药业有限公司生产(中国，湖北)。
1.2 MTT实验 为测定大蒜素在体外对肿瘤细胞生长率的影响，将不同剂量的大蒜素(250μg，50μg，10μg，2μg和0)与MBT-2细胞共同培养48h。加入MTT试剂培养最后4h。DMSO能还原MTT试剂成兰色溶液。酶标仪上波长560nm测定OD值。
, 百拇医药
1.3 动物实验 6～8周龄雌性C3H/He鼠是从北京维通利华实验技术有限公司购得。所有实验均根据广东医学院动物实验指南进行。
为测定大蒜素对膀胱肿瘤的治疗效果，我们将C3H/He小鼠分成三组，一组注射生理盐水，一组注射12.5mg大蒜素作为低剂量，而另一组则注射25mg大蒜素作为高剂量。每一组含10只小鼠。注射时所使用的细胞均用细胞铲从培养瓶中收集悬浮于5ml生理盐水中。用生理盐水洗2次。并将其悬浮于生理盐水中。浓度为1×10 6 细胞/ml。将肿瘤细胞种植到C3H小鼠右后侧腹皮下，剂量为0.1ml。次日将大蒜素注射到肿瘤附近的皮下。每周两次用测量器测定肿瘤的直径，观察肿瘤的生长。3周后将鼠杀死，切取对照组和大剂量治疗组的肿瘤组织做病理切片。
2 结果
2.1 大蒜素对肿瘤细胞的体外影响 MTT实验表明，当大蒜素剂量为2.5mg/ml时对膀胱癌细胞有显著的直接细胞毒作用(99%细胞死亡)。当剂量为100μg/ml时，即有中度细胞毒作用，肿瘤的抑制率可达到56%。见表1。
, http://www.100md.com
表1 大蒜素对MBT-2肿瘤细胞体外生长的抑制(MTT实验)
2.2 大蒜素的在体抗肿瘤效果 为测定大蒜素对膀胱肿瘤的抗肿瘤效果，我们将1×10 5MBT-2肿瘤细胞注射到鼠右后侧腹皮下，在次日将大蒜素注射到肿瘤附近的皮下。与对照组相比，大蒜素明显延迟了肿瘤的发生。在注射3周后，对照组的肿瘤发生率即高达80%;而小剂量组(12.5mg)的肿瘤发生率为50%;但是大剂量组(25mg)的肿瘤发生率却仅为20%(图1)。大剂量治疗组与其它组相比，肿瘤的生长速度明显减慢，见表2。这些结果表明大蒜素的抗肿瘤作用与剂量有关。
图1 大蒜素治疗后肿瘤发生率
表2 大蒜素治疗后肿瘤的面积(平均面积cm 2 ，ˉx±s)
3 讨论
, 百拇医药
大蒜素是大蒜的主要成分。1997年D.R.Riggs等发现大蒜提取液浓度为31.3mg/ml时，对MBT-2肿瘤细胞的抑制率是29.9%;当浓度为62.5mg/ml或高于此时，大蒜提取液对膀胱癌细胞有明显直接的细胞毒活性(抑制率98%) [6] 。
我们研究发现大蒜素的浓度为20μg/ml时，即有中度直接细胞毒作用，抑制率可达到40%;当浓度为2.5mg/ml时可见到重大的直接细胞毒活性(99%细胞死亡)。大蒜素的生物学活性比老蒜提取液强25倍。
动物实验显示大蒜素在体内有明显的治疗效果。大蒜素明显延迟了肿瘤的发生。大剂量治疗组与其它组相比，肿瘤的生长速度也明显减慢。大蒜素的这种治疗效果与剂量有关。大蒜素对肿瘤细胞直接抑制的机理目前还不清楚。这种作用可能与刺激肿瘤细胞内活性氧的产生，激活肿瘤细胞NF-B转录因子的核易位有关。引起氧化活性改变的大蒜素通过激活NF-B而导致细胞凋亡 [6] 。
, 百拇医药
大蒜素也能抑制肿瘤细胞内芳香胺-N-乙酰基转移酶的活性并使2-氨基芴-DNA内收 [7] 。也许大蒜素抗肿瘤的另一个重要机制是刺激免疫系统。一些研究表明大蒜能引起IL-2，TNF-α以及IFN-γ大量释放，并提高吞噬作用 [8] 。大蒜的其他活性包括增进杀伤细胞活性以及淋巴细胞对丝裂原刺激的免疫增殖反应 [8] 。这些效应，特别是细胞因子释放的模式，表明大蒜激活Th1细胞免疫反应，这种反应是有效抗肿瘤免疫治疗所特有。
综上所述，我们的结果表明其对膀胱肿瘤有明显的治疗作用。这种作用可能与其直接细胞毒作用和免疫反应有关。本研究说明了大蒜素对膀胱肿瘤的生物学活性，并支持这样一个观点，即大蒜素是一种有效的化学预防或化学治疗药物。大蒜素可能作为一种有效的表浅膀胱癌腔内治疗或术后防复发药物而应用于临床。
在此感谢广东医学院附属医院中心实验室允许我们使用其设备。感谢广东医学院动物实验中心的友好协作。
, 百拇医药
参考文献
1 上海市肿瘤研究所流行病学研究室.1998年上海市市区恶性肿瘤发病率.肿瘤，2001，21(4):312.
2 王坚，谭明天，吴宏，等.泌尿外科恶性肿瘤住院患者的情况调查.广东医学，2001，22(10):964.
3 Dausch JG，Nixon DW.Garlic:A review of its relationship to malignant disease.Prev Med，1990，19(3):346-361.
4 Riggs DR，DeHaven JI，Lamm DL.Allium sativum(garlic)treatment for murinetransitional cell carcinoma.Cancer，1997，79(10):1987-1994.
, http://www.100md.com
5 Mickey DD，Mickey GH，Murphy WM，et al.In vitro characterization of four N-[4-(5-nitro-2-furyl)-2-thiazolyl]formamide(FANˉFT)induced mouse bladder tumors.J Urol，1982127(6):1233-1237.
6 Dirsch VM，Gerbes AL，Vollmar AM.Ajoene，a compound of garlic，inˉduces apoptosis in human promyeloleukemic cells，accompanied by genˉerationof reactive oxygen species and activation of nuclear factor kapˉpaB.Mol Pharmacol，1998，53(3):402-407.
, http://www.100md.com
7 Lin JG，Chen GW，Su CC，et al.Effects of garlic components diallyl sulˉ fide and diallyl disulfide on arylamine N-acetyltransferase activity and2-aminofluorene-DNA adducts in human promyelocytic leukemia cells.Am J Chin Med，2002，30(2-3):315-325.
8 Kyo E.，Suzuki A.，Kakimoto M，et al.Immunomodulation and antituˉmor activities of age garlic extract.Phyto medicine，1998，5(4):259-267.
(编辑李年令)
作者单位:524001广东医学院附属医院泌尿外科(中心实验室)
广东医学院生物化学与分子生物学教研室, 百拇医药(王 坚 何惠娟 何承伟 吴平 柳建军)
关键词 大蒜素 治疗效果 膀胱肿瘤
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)16-2409-03
, 百拇医药
The effect of allicin on resisting
urinary bladder cancer
Wang Jian，He Huijun，He Chengwei，et al.
Dept of Urology of Affiliated Hospital of Guang-dong Medical College，Guangzhou524001.
【Abstract】 Objective To discuss the treatment effect of allicin on bladder tumor.Methods Murine bladder tumor cells(MBT-2)are kindly provided by JCRB cell bank.We evaluated the direct effects of allicin in vitro by MTT assay.To determine anti-tumor effect of allicin，in vivo，C3H/HeN mice were randomized priorto initiation of experiment.Mice received1×10 5 MBT2cells administered subcutaneously(s.c)into the right posterio flank.Allicin was injected at the site near tumor transplantation on next day.The mice were examined for tumor developmentand the tumors were measured in two dimensions with calipers twice weekly.Results Our experience with the MTT assay sugˉgest that allicin has significant direct cytotoxicity to bladder cancer cells.It showed a marked delay in the appearance and growth of tumors after s.c.injection compared to control group.This anti-tumor effect was direct ratio with the allicin’s dose.Conclusion Allicin has a marked anti-tumor effect on bladder tumor.This effect may be related to direct cytotoxicity and immune response.It may be an effective intravesical treatment agent for superficial bladder canˉcer.
, 百拇医药
Key words allicin treatment effect bladder tumor
膀胱癌在我国是泌尿外科最常见的恶性肿瘤，占男性全身恶性肿瘤发病率的第七位，并且有逐渐增加的趋势 [1，2] 。在初始阶段大约70%肿瘤是表浅性，余下的30%则有肌肉侵犯和(或)转移。经尿道肿瘤切除后，辅以灌注化疗能减少肿瘤复发。多项研究表明腔内卡介苗(BCG)治疗优于化学治疗。现在BCG免疫治疗是膀胱原位癌和浸润型Ta，T1移行细胞癌的标准治疗。但是BCG的毒性妨碍了一些患者的使用，有时甚至威胁生命;因此，促使我们去寻找治疗表浅膀胱癌的其它治疗药物。
大蒜在我国民间药用已有三千多年的历史。现代研究提示大蒜有良好的防癌、抑癌作用[3] 。有报道显示大蒜提取液对膀胱肿瘤生长有明显抑制作用，但是一些实验动物死于治疗相关的毒性 [4] 。ˇ 基金项目:广东医学院附属医院博士启动基金资助(编号74号)
, 百拇医药
MBT-2肿瘤细胞是美国田纳西大学(Tennessee Univerˉsity)M.S.Soloway利用口服N-甲酰胺(FANFT)从C3H小鼠诱发而来 [5] 。这种低分化移行细胞癌所表现的转移特性与人移行细胞癌相类似。为了解大蒜素对膀胱肿瘤的治疗效果和机理，我们测定了大蒜素在体外对肿瘤细胞生长的影响，并且评估了其在体内的抗肿瘤效果。
1 材料与方法
1.1 肿瘤细胞和大蒜素 MBT-2肿瘤细胞由日本癌症资源库(JCRB)的细胞库提供(细胞编号:IFO50041)。培养于含10%小牛血清(FBS)的DMEM(GIBCO BRL，Life Technoloˉgies Inc.，Rockville，MD，USA)和37℃以及5%CO 2 中。大蒜素是由金龙福药业有限公司生产(中国，湖北)。
1.2 MTT实验 为测定大蒜素在体外对肿瘤细胞生长率的影响，将不同剂量的大蒜素(250μg，50μg，10μg，2μg和0)与MBT-2细胞共同培养48h。加入MTT试剂培养最后4h。DMSO能还原MTT试剂成兰色溶液。酶标仪上波长560nm测定OD值。
, 百拇医药
1.3 动物实验 6～8周龄雌性C3H/He鼠是从北京维通利华实验技术有限公司购得。所有实验均根据广东医学院动物实验指南进行。
为测定大蒜素对膀胱肿瘤的治疗效果，我们将C3H/He小鼠分成三组，一组注射生理盐水，一组注射12.5mg大蒜素作为低剂量，而另一组则注射25mg大蒜素作为高剂量。每一组含10只小鼠。注射时所使用的细胞均用细胞铲从培养瓶中收集悬浮于5ml生理盐水中。用生理盐水洗2次。并将其悬浮于生理盐水中。浓度为1×10 6 细胞/ml。将肿瘤细胞种植到C3H小鼠右后侧腹皮下，剂量为0.1ml。次日将大蒜素注射到肿瘤附近的皮下。每周两次用测量器测定肿瘤的直径，观察肿瘤的生长。3周后将鼠杀死，切取对照组和大剂量治疗组的肿瘤组织做病理切片。
2 结果
2.1 大蒜素对肿瘤细胞的体外影响 MTT实验表明，当大蒜素剂量为2.5mg/ml时对膀胱癌细胞有显著的直接细胞毒作用(99%细胞死亡)。当剂量为100μg/ml时，即有中度细胞毒作用，肿瘤的抑制率可达到56%。见表1。
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表1 大蒜素对MBT-2肿瘤细胞体外生长的抑制(MTT实验)
2.2 大蒜素的在体抗肿瘤效果 为测定大蒜素对膀胱肿瘤的抗肿瘤效果，我们将1×10 5MBT-2肿瘤细胞注射到鼠右后侧腹皮下，在次日将大蒜素注射到肿瘤附近的皮下。与对照组相比，大蒜素明显延迟了肿瘤的发生。在注射3周后，对照组的肿瘤发生率即高达80%;而小剂量组(12.5mg)的肿瘤发生率为50%;但是大剂量组(25mg)的肿瘤发生率却仅为20%(图1)。大剂量治疗组与其它组相比，肿瘤的生长速度明显减慢，见表2。这些结果表明大蒜素的抗肿瘤作用与剂量有关。
图1 大蒜素治疗后肿瘤发生率
表2 大蒜素治疗后肿瘤的面积(平均面积cm 2 ，ˉx±s)
3 讨论
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大蒜素是大蒜的主要成分。1997年D.R.Riggs等发现大蒜提取液浓度为31.3mg/ml时，对MBT-2肿瘤细胞的抑制率是29.9%;当浓度为62.5mg/ml或高于此时，大蒜提取液对膀胱癌细胞有明显直接的细胞毒活性(抑制率98%) [6] 。
我们研究发现大蒜素的浓度为20μg/ml时，即有中度直接细胞毒作用，抑制率可达到40%;当浓度为2.5mg/ml时可见到重大的直接细胞毒活性(99%细胞死亡)。大蒜素的生物学活性比老蒜提取液强25倍。
动物实验显示大蒜素在体内有明显的治疗效果。大蒜素明显延迟了肿瘤的发生。大剂量治疗组与其它组相比，肿瘤的生长速度也明显减慢。大蒜素的这种治疗效果与剂量有关。大蒜素对肿瘤细胞直接抑制的机理目前还不清楚。这种作用可能与刺激肿瘤细胞内活性氧的产生，激活肿瘤细胞NF-B转录因子的核易位有关。引起氧化活性改变的大蒜素通过激活NF-B而导致细胞凋亡 [6] 。
, 百拇医药
大蒜素也能抑制肿瘤细胞内芳香胺-N-乙酰基转移酶的活性并使2-氨基芴-DNA内收 [7] 。也许大蒜素抗肿瘤的另一个重要机制是刺激免疫系统。一些研究表明大蒜能引起IL-2，TNF-α以及IFN-γ大量释放，并提高吞噬作用 [8] 。大蒜的其他活性包括增进杀伤细胞活性以及淋巴细胞对丝裂原刺激的免疫增殖反应 [8] 。这些效应，特别是细胞因子释放的模式，表明大蒜激活Th1细胞免疫反应，这种反应是有效抗肿瘤免疫治疗所特有。
综上所述，我们的结果表明其对膀胱肿瘤有明显的治疗作用。这种作用可能与其直接细胞毒作用和免疫反应有关。本研究说明了大蒜素对膀胱肿瘤的生物学活性，并支持这样一个观点，即大蒜素是一种有效的化学预防或化学治疗药物。大蒜素可能作为一种有效的表浅膀胱癌腔内治疗或术后防复发药物而应用于临床。
在此感谢广东医学院附属医院中心实验室允许我们使用其设备。感谢广东医学院动物实验中心的友好协作。
, 百拇医药
参考文献
1 上海市肿瘤研究所流行病学研究室.1998年上海市市区恶性肿瘤发病率.肿瘤，2001，21(4):312.
2 王坚，谭明天，吴宏，等.泌尿外科恶性肿瘤住院患者的情况调查.广东医学，2001，22(10):964.
3 Dausch JG，Nixon DW.Garlic:A review of its relationship to malignant disease.Prev Med，1990，19(3):346-361.
4 Riggs DR，DeHaven JI，Lamm DL.Allium sativum(garlic)treatment for murinetransitional cell carcinoma.Cancer，1997，79(10):1987-1994.
, http://www.100md.com
5 Mickey DD，Mickey GH，Murphy WM，et al.In vitro characterization of four N-[4-(5-nitro-2-furyl)-2-thiazolyl]formamide(FANˉFT)induced mouse bladder tumors.J Urol，1982127(6):1233-1237.
6 Dirsch VM，Gerbes AL，Vollmar AM.Ajoene，a compound of garlic，inˉduces apoptosis in human promyeloleukemic cells，accompanied by genˉerationof reactive oxygen species and activation of nuclear factor kapˉpaB.Mol Pharmacol，1998，53(3):402-407.
, http://www.100md.com
7 Lin JG，Chen GW，Su CC，et al.Effects of garlic components diallyl sulˉ fide and diallyl disulfide on arylamine N-acetyltransferase activity and2-aminofluorene-DNA adducts in human promyelocytic leukemia cells.Am J Chin Med，2002，30(2-3):315-325.
8 Kyo E.，Suzuki A.，Kakimoto M，et al.Immunomodulation and antituˉmor activities of age garlic extract.Phyto medicine，1998，5(4):259-267.
(编辑李年令)
作者单位:524001广东医学院附属医院泌尿外科(中心实验室)
广东医学院生物化学与分子生物学教研室, 百拇医药(王 坚 何惠娟 何承伟 吴平 柳建军)
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