姜黄素对白血病耐药细胞HL 60ADR多药耐药逆转作用的研究
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中华中西医杂志 2003年8月 第4卷 第16期
【摘要】 目的 研究姜黄素对白血病耐药细胞HL 60 /ADR多药耐药的逆转作用。方法 应用MTT法检测药物对细胞的细胞毒作用;流式细胞仪检测细胞内药物浓度。结果 姜黄素能降低ADR对HL 60 /ADR细胞的IC 50 ，提高ADR在细胞内的浓度。结论 姜黄素能部分逆转HL 60 /ADR细胞的多药耐药。
关键词 姜黄素 HL 60 /ADR细胞 多药耐药 逆转
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)16-2414-02
Reversal effect of curcumin on HL 60 /ADR cell line
Huang Junqiong，Sun Wanbang
, http://www.100md.com
Department of Immunology，Zunyi Medical College，Zunyi563003.
【Abstract】 Objective To investigate the reversal effect of curcumin on HL 60 /ADR cell line.Methods The cytotoxic effect of chemotherapeutic agents wasstudied by MTT;the fluorescence intensity of ADR was assayed by flow cytometry.Results Curcumin decreased the IC 50 of ADR in HL 60 /ADR cells and increased the intracellular concenˉtration of ADR.Conclusion Curcumin can reverse multidrug resistance of HL 60 /ADR cell line partly.
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Key words curcumin HL 60 /ADR cellline multidrug resistance reverse
多药耐药(multidrug resistance，MDR)是白血病病人化疗失败的主要原因，逆转白血病MDR已成为提高白血病化疗疗效的一种重要手段。大多数研究中的耐药逆转剂都存在各种严重缺点，主要是与逆转活性相伴的内在毒性过大，如心血管系统毒性、免疫抑制、肾毒性等，同时在耐受剂量下活性不高。本研究以HL 60 /ADR细胞为靶细胞，观察姜黄素(curcumin，cur)对白血病细胞多药耐药的逆转作用。
1 材料与方法
1.1 主要试剂 姜黄素为瑞士Alexis公司产品，纯度>99%;阿霉素(adriamycin，ADR)购自浙江海正药业股份有限公司;溴化二甲噻唑二苯四氮唑(MTT)和RPMI1640培养液为美国Amresco公司产品;二甲基亚砜为国产分析纯;小牛血清购自上海第二医科大学科技中心实验室二室。
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1.2 细胞株 HL 60 、HL 60 /ADR细胞购自中国医学科学院血液学研究所，HL 60 /ADR为阿霉素诱导HL 60 细胞建立的MDR细胞株，用含0.5μg/ml ADR的RPMI1640完全培养液长期培养，实验前3天换用无药物的培养液培养。
1.3 MTT实验 实验共分为4组:(1)对照组:未加姜黄素;(2)0.2μg/ml姜黄素组;(3)0.4μg/ml姜黄素组;此三组细胞为HL 60 /ADR，用新配制的RPMI1640培养液漂洗细胞1次，并用此培养液将细胞配成5×10 5 /ml，每瓶3ml，加入不同浓度姜黄素，阴性对照组加等量培养液，5%CO 2 37℃条件下培养24h。离心去上清，RPMI1640培养液洗2次。(4)HL 60 细胞组。用培养液将上述4组细胞稀释至5×10 4 /ml，接种于96孔板，每孔加入100μl细胞悬液和不同浓度的阿霉素，每个浓度设4个平行孔，5%CO 2 37℃条件下培养72h，实验终止前4h加入10mg/ml的MTT10μl，同样条件下保温 ˇ 基金项目:贵州省卫生厅重点课题(编号:C-123)4h。取出后，离心，去上清，每孔加入200μl的二甲基亚砜，混匀，在酶标仪上测570nm吸光值。抑制率(IR)=(1-试验组吸光值/对照组吸光值)×100%。以细胞抑制率的概率单位为纵坐标，化疗药物浓度的对数为横坐标，绘制浓度效应曲线，求IC 50 (半数细胞抑制剂量)值。耐药倍数=耐药细胞IC 50 /敏感细胞IC 50 。逆转倍数=IC 50 (单用ADR)/IC 50 (ADR+Cur)。
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1.4 流式细胞仪检测细胞内药物浓度 用新配制的RPMI1640培养液漂洗细胞1次，并用此培养液将细胞配成5×10 5 /ml，每瓶3ml，加入不同浓度姜黄素，37℃5%CO 2 培养24h。取出后，RPMI1640培养液洗2次，用培养液将细胞稀释至1×10 5 /ml，取24孔板，每孔加入稀释好的细胞1ml，加入阿霉素。阿霉素浓度为1.25μg/ml、2.5μg/ml、5.0μg/ml、10μg/ml，同样条件下培养24h。收集细胞，冷PBS洗2次，流式细胞仪分析阿霉素荧光强度。
2 结果
2.1 姜黄素对HL 60 /ADR细胞MDR的逆转作用 HL 60 、HL 60 /ADR细胞经不同浓度阿霉素作用72h后，以MTT比色法观察其细胞生长抑制作用，结果(见表1)显示，阿霉素对HL 60 、HL 60 /ADR细胞作用72h的IC 50 分别为0.10μg/ml、15.33μg/ml，HL 60 /ADR细胞对阿霉素的耐药倍数为153.3。 0.2μg/ml、0.4μg/ml姜黄素处理HL 60 /ADR72h，抑制率分别为3.6%、4.1%(见表3)，存活率大于95%，说明该浓度姜黄素对HL 60 /ADR细胞无生长抑制作用。用此浓度姜黄素预先处理细胞24h后，其阿霉素的IC 50 分别为13.74g/ml、12.03/ml，逆转倍数为1.12、1.27(结果见表2)。
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2.2 姜黄素对细胞内ADR浓度的影响 结果见图1，用0.2μg/ml、0.4μg/ml姜黄素处理HL 60 /ADR24h后，细胞内ADR荧光强度增强，说明姜黄素可增加细胞内ADR的浓度。
表1 HL 60 /ADR细胞对Cur的药物敏感性
表2 姜黄素对HL 60 /ADR细胞多药耐药逆转作用
图1 姜黄素对细胞内ADR浓度的影响
3 讨论
白血病耐药性是指白血病细胞对化疗药物的不敏感 性，多药耐药是其最重要的耐药形式之一，它是指肿瘤细胞对结构、功能及杀伤机制迥异的多种抗癌药物同时产生耐药。多药耐药是白血病病人化疗失败的主要原因。目前提出的多药耐药发生机制主要包括膜糖蛋白介导的药物外排增加、凋亡调控基因加bcl-2、P53、ras、c-myc等表达失控及与凋亡相关的酶如谷胱甘肽-S-转移酶、酪氨酸蛋白激酶、蛋白激酶C等异常。姜黄素是从姜科姜黄属植物姜黄根茎中提取的一种酚性色素，由于其色泽稳定且毒性低，目前已广泛用于食品添加剂中。它还具有广泛的药理作用，如抗氧化、抗炎、抗肿瘤等作用。林溪等 [1] 研究表明姜黄素有化疗增敏作用。研究表明，姜黄素可抑制蛋白激酶C(PKC) [2] 、酪氨酸蛋白激酶 [3] 的活性。蛋白激酶C(PKC)在肿瘤多药耐药的发生中起作用，上调PKC可增加P-gp或MRP磷酸化，调节其泵功能，减少细胞内药物积聚。梁蓉等 [4] 报道蛋白激酶C抑制剂H7对HL 60 /VCR细胞多药耐药有部分逆转作用。Kakar等 [5] 研究发现，局部应用姜黄素可抑制c-jun、c-fos、c-myc等原癌基因的表达。Verma等 [6] 在研究环境物质及杀虫剂对乳腺癌细胞MCF-7的影响中发现，姜黄素可抑制环境物质及杀虫剂的雌激素样作用。部分雌激素拮抗剂可逆转肿瘤细胞多药耐药。本研究发现，阿霉素对HL 60 /ADR细胞的IC 50为15.33μg/ml，用0.2μg/ml、0.4μg/ml姜黄素预先处理HL 60 /ADR24h后，阿霉素对HL 60 /ADR细胞的IC 50 分别降至13.74μg/ml、12.07μg/ml，逆转倍数为1.12、1.27;细胞内阿霉素的浓度增加。姜黄素可部分逆转白血病耐药细胞HL 60 /ADR多药耐药。关于姜黄素通过何种方式逆转其耐药性，有待进一步研究。
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参考文献
1 林溪，许建华，柯丹如，等.姜黄素与阿霉素联合用药的体外抗肿瘤作用.中国药理学通报，2000，16(5):522-525.
2 Liu JY，Lin SJ，Lin JK.Inhibitory effects of curcumin on protein kinase C activity induced by12-O-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate in NIH3T3cells.Carcinogenesis.1993，14(5):857-861.
3 Hong RL，Spohn WH，Hung MC.Curcumin inhibits tyrosine kinase acˉtivity ofp185neu and also depletes p185neu.Clin-Cancer-Res，1999，5(7):1884-1891.
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4 梁蓉，陈协群，扬平地，等.蛋白激酶C抑制剂H7对HL-60/VCR细胞多药耐药的部分逆转.癌症，2001，20(12):1432-1433.
5 Kakar SS，Roy D.Curcumin inhibits TPA induced expression c-fos，c-jun and c-myc protooncogenes messenger RNAs in mouse skin.Canˉcer-Lett，1994，87(1):85-89.
6 Verma SP，Goldin BR，Lin PS.The inhibition of the estrogenic effects of pesticides and environmental chemicals by curcumin and isoflavonoids.Environ-Health-Perspect，1998，106(12):807-812.
(编辑曲 全)
作者单位:563003贵州遵义医学院免疫学教研室, 百拇医药(黄俊琼 孙万邦)
关键词 姜黄素 HL 60 /ADR细胞 多药耐药 逆转
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)16-2414-02
Reversal effect of curcumin on HL 60 /ADR cell line
Huang Junqiong，Sun Wanbang
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Department of Immunology，Zunyi Medical College，Zunyi563003.
【Abstract】 Objective To investigate the reversal effect of curcumin on HL 60 /ADR cell line.Methods The cytotoxic effect of chemotherapeutic agents wasstudied by MTT;the fluorescence intensity of ADR was assayed by flow cytometry.Results Curcumin decreased the IC 50 of ADR in HL 60 /ADR cells and increased the intracellular concenˉtration of ADR.Conclusion Curcumin can reverse multidrug resistance of HL 60 /ADR cell line partly.
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Key words curcumin HL 60 /ADR cellline multidrug resistance reverse
多药耐药(multidrug resistance，MDR)是白血病病人化疗失败的主要原因，逆转白血病MDR已成为提高白血病化疗疗效的一种重要手段。大多数研究中的耐药逆转剂都存在各种严重缺点，主要是与逆转活性相伴的内在毒性过大，如心血管系统毒性、免疫抑制、肾毒性等，同时在耐受剂量下活性不高。本研究以HL 60 /ADR细胞为靶细胞，观察姜黄素(curcumin，cur)对白血病细胞多药耐药的逆转作用。
1 材料与方法
1.1 主要试剂 姜黄素为瑞士Alexis公司产品，纯度>99%;阿霉素(adriamycin，ADR)购自浙江海正药业股份有限公司;溴化二甲噻唑二苯四氮唑(MTT)和RPMI1640培养液为美国Amresco公司产品;二甲基亚砜为国产分析纯;小牛血清购自上海第二医科大学科技中心实验室二室。
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1.2 细胞株 HL 60 、HL 60 /ADR细胞购自中国医学科学院血液学研究所，HL 60 /ADR为阿霉素诱导HL 60 细胞建立的MDR细胞株，用含0.5μg/ml ADR的RPMI1640完全培养液长期培养，实验前3天换用无药物的培养液培养。
1.3 MTT实验 实验共分为4组:(1)对照组:未加姜黄素;(2)0.2μg/ml姜黄素组;(3)0.4μg/ml姜黄素组;此三组细胞为HL 60 /ADR，用新配制的RPMI1640培养液漂洗细胞1次，并用此培养液将细胞配成5×10 5 /ml，每瓶3ml，加入不同浓度姜黄素，阴性对照组加等量培养液，5%CO 2 37℃条件下培养24h。离心去上清，RPMI1640培养液洗2次。(4)HL 60 细胞组。用培养液将上述4组细胞稀释至5×10 4 /ml，接种于96孔板，每孔加入100μl细胞悬液和不同浓度的阿霉素，每个浓度设4个平行孔，5%CO 2 37℃条件下培养72h，实验终止前4h加入10mg/ml的MTT10μl，同样条件下保温 ˇ 基金项目:贵州省卫生厅重点课题(编号:C-123)4h。取出后，离心，去上清，每孔加入200μl的二甲基亚砜，混匀，在酶标仪上测570nm吸光值。抑制率(IR)=(1-试验组吸光值/对照组吸光值)×100%。以细胞抑制率的概率单位为纵坐标，化疗药物浓度的对数为横坐标，绘制浓度效应曲线，求IC 50 (半数细胞抑制剂量)值。耐药倍数=耐药细胞IC 50 /敏感细胞IC 50 。逆转倍数=IC 50 (单用ADR)/IC 50 (ADR+Cur)。
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1.4 流式细胞仪检测细胞内药物浓度 用新配制的RPMI1640培养液漂洗细胞1次，并用此培养液将细胞配成5×10 5 /ml，每瓶3ml，加入不同浓度姜黄素，37℃5%CO 2 培养24h。取出后，RPMI1640培养液洗2次，用培养液将细胞稀释至1×10 5 /ml，取24孔板，每孔加入稀释好的细胞1ml，加入阿霉素。阿霉素浓度为1.25μg/ml、2.5μg/ml、5.0μg/ml、10μg/ml，同样条件下培养24h。收集细胞，冷PBS洗2次，流式细胞仪分析阿霉素荧光强度。
2 结果
2.1 姜黄素对HL 60 /ADR细胞MDR的逆转作用 HL 60 、HL 60 /ADR细胞经不同浓度阿霉素作用72h后，以MTT比色法观察其细胞生长抑制作用，结果(见表1)显示，阿霉素对HL 60 、HL 60 /ADR细胞作用72h的IC 50 分别为0.10μg/ml、15.33μg/ml，HL 60 /ADR细胞对阿霉素的耐药倍数为153.3。 0.2μg/ml、0.4μg/ml姜黄素处理HL 60 /ADR72h，抑制率分别为3.6%、4.1%(见表3)，存活率大于95%，说明该浓度姜黄素对HL 60 /ADR细胞无生长抑制作用。用此浓度姜黄素预先处理细胞24h后，其阿霉素的IC 50 分别为13.74g/ml、12.03/ml，逆转倍数为1.12、1.27(结果见表2)。
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2.2 姜黄素对细胞内ADR浓度的影响 结果见图1，用0.2μg/ml、0.4μg/ml姜黄素处理HL 60 /ADR24h后，细胞内ADR荧光强度增强，说明姜黄素可增加细胞内ADR的浓度。
表1 HL 60 /ADR细胞对Cur的药物敏感性
表2 姜黄素对HL 60 /ADR细胞多药耐药逆转作用
图1 姜黄素对细胞内ADR浓度的影响
3 讨论
白血病耐药性是指白血病细胞对化疗药物的不敏感 性，多药耐药是其最重要的耐药形式之一，它是指肿瘤细胞对结构、功能及杀伤机制迥异的多种抗癌药物同时产生耐药。多药耐药是白血病病人化疗失败的主要原因。目前提出的多药耐药发生机制主要包括膜糖蛋白介导的药物外排增加、凋亡调控基因加bcl-2、P53、ras、c-myc等表达失控及与凋亡相关的酶如谷胱甘肽-S-转移酶、酪氨酸蛋白激酶、蛋白激酶C等异常。姜黄素是从姜科姜黄属植物姜黄根茎中提取的一种酚性色素，由于其色泽稳定且毒性低，目前已广泛用于食品添加剂中。它还具有广泛的药理作用，如抗氧化、抗炎、抗肿瘤等作用。林溪等 [1] 研究表明姜黄素有化疗增敏作用。研究表明，姜黄素可抑制蛋白激酶C(PKC) [2] 、酪氨酸蛋白激酶 [3] 的活性。蛋白激酶C(PKC)在肿瘤多药耐药的发生中起作用，上调PKC可增加P-gp或MRP磷酸化，调节其泵功能，减少细胞内药物积聚。梁蓉等 [4] 报道蛋白激酶C抑制剂H7对HL 60 /VCR细胞多药耐药有部分逆转作用。Kakar等 [5] 研究发现，局部应用姜黄素可抑制c-jun、c-fos、c-myc等原癌基因的表达。Verma等 [6] 在研究环境物质及杀虫剂对乳腺癌细胞MCF-7的影响中发现，姜黄素可抑制环境物质及杀虫剂的雌激素样作用。部分雌激素拮抗剂可逆转肿瘤细胞多药耐药。本研究发现，阿霉素对HL 60 /ADR细胞的IC 50为15.33μg/ml，用0.2μg/ml、0.4μg/ml姜黄素预先处理HL 60 /ADR24h后，阿霉素对HL 60 /ADR细胞的IC 50 分别降至13.74μg/ml、12.07μg/ml，逆转倍数为1.12、1.27;细胞内阿霉素的浓度增加。姜黄素可部分逆转白血病耐药细胞HL 60 /ADR多药耐药。关于姜黄素通过何种方式逆转其耐药性，有待进一步研究。
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6 Verma SP，Goldin BR，Lin PS.The inhibition of the estrogenic effects of pesticides and environmental chemicals by curcumin and isoflavonoids.Environ-Health-Perspect，1998，106(12):807-812.
(编辑曲 全)
作者单位:563003贵州遵义医学院免疫学教研室, 百拇医药(黄俊琼 孙万邦)