抗基质金属蛋白酶对肝癌细胞侵袭性的影响
【摘要】 目的 探讨全反式维甲酸(ATRA)对影响肝癌细胞侵袭性的途径。方法 通过体外和动物实验的方法，探讨ATRA对肝细胞癌高转移瘤株(Hca-F)人工基底膜粘附能力以及对Ⅳ型胶原酶分泌能力的影响。结果 ATRA对Hca-F细胞的人工基底膜粘附能力，以及对Ⅳ型胶原酶的分泌均有明显的抑制作用，其抑制能力在一定范围，随ATRA浓度成正比。结论 ATRA通过多途径对Hca-F侵袭性行为产生影响。
关键词 肝癌细胞 维甲酸 金属蛋白酶
【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2003)04-0293-02
The effect of all trans-retinoic acid on the invasion of
hepatocellular carcinomas
, 百拇医药
Li Bing，Tian BoThe First Hospital Affiliated to Dalian Medical University，Dalian116011.
【Abstract】 Objective To elucidate the effect of all trans-retinoic acid(ATRA)on the invasion of hepatoˉcellular carcinomas.Methods By the use of cell culture and experimental animal models，the influence of ATRA in Hca-F liver cancer cells invasion were studied in terms of the adhesion capacity to artificial basal membrane and proˉduction of collagenase typeⅣ.Results It was found that ATRA could inhibit the adhesion capacity as well as collaˉgenaseⅣsecretion of Hca-F cells in a dose related fashion.Conclusion ATRA can exert multiple effects on the invasion of Hca-F cells.
, 百拇医药
Key words hepatocellular carcinoma retinoic acid matrix metalprotienase
肝癌术后的复发和转移其主要原因在于肝癌细胞侵袭性的生物学行为，本研究通过动物实验观察全反式维甲酸(ATRA)抗基质金属蛋白酶(MMPs)，探讨对肝细胞癌高转移瘤株(Hca-F)侵袭性的生物学行为的影响。
1 材料与方法
1.1 材料 近交系615小鼠(由本校病理教研室动物室繁育)，普通级，雄性，6～8周龄，体重20～22g，小鼠腹水型Hca-F(本校病理教研室提供)。RPMI1640及小牛血清为Gibco公司提供:ATRA、Ⅳ型胶原为Sigma公司产品。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 液氮冻存的Hca-F细胞快速解冻，接种于615小鼠的腹腔，7天后无菌条件下抽取腹水，PBS液洗涤3次。将肿瘤细胞加入1640完全培养基(含20%的小牛血清)培养24h以除去巨噬细胞，离心收获肿瘤细胞。
, http://www.100md.com
1.2.2 ATRA对Hca-F细胞与人工基底膜粘附能力的影响 Ⅳ型胶原10mg滴加至24孔板内，ATRA孵育7天后的Hca-F细胞，用少量的PBS液洗涤数次，计算ATRA对Hca-F细胞的粘附抑制率。
1.2.3 ATRA对Hca-F细胞分泌Ⅳ型胶原酶的影响 孵育7天的Hca-F细胞以PBS液洗涤3次，利用Leica Q550IW图像处理软件对电泳结果进行灰度扫描，对各组标本的Ⅳ型胶原酶进行定量分析。
2 结果
ATRA对基底膜粘附能力有显著的抑制作用，在一定的浓度范围内，随着ATRA浓度的递增，其抑制作用逐渐增 强。ATRA在10 -7 mol/L，10 -6 mol/L，10 -5 mol/L浓度时，对粘附能力的抑制率分别为13.3%，26.9%，49.9%。明胶酶谱法检测表明，Hca-F细胞体外与体内均可以分泌大量的Ⅳ型胶原酶，主要为MMP-2(72KDⅣ型胶原酶)，MMP-9(92KDⅣ型胶原酶)和MMP-2的活性形式(66KD胶原酶)ATRA对Hca-F细胞在体内和体外分泌Ⅳ型胶原酶的能力和酶活性均有显著抑制作用。见表1。
, 百拇医药
表1 ATRA对Hca-F细胞分泌Ⅳ型胶原酶的能力及酶活性的影响 注: ˇ P<0.05， Δ P<0.01
3 讨论
目前肝癌治疗仍以手术为主要治疗手段，但肝癌术后的复发率高是影响疗效的重要因素，肝癌细胞的侵袭性是病人术后复发的主要原因。肝癌细胞在侵袭转移过程中至少数次穿过基底膜，因此基底膜是抑制肝癌细胞转移的天然屏障。肝癌细胞在侵袭转移的过程中分泌的MMPs对基底膜的溶解和破坏作用，极大地增强了肝癌的侵袭性，对肝癌的转移起到了重要的作用。因此寻找有效的对抗MMPs的药物对减少肝癌的复发和转移有积极的意义。
美国国立癌症研究所提出了肿瘤侵袭的三步学说，即粘附、降解和移动。其中肝癌细胞分泌金属蛋白酶是肝癌细胞与基底膜粘附、降解以及向基质内移动的前提和条件。本实验通过体外实验证明，通过抗金属蛋白酶ATRA可显著降低Hca-F与基底膜和Ⅳ型胶原的粘附能力。因此AˉTRA打破了粘附—降解—移动这个肿瘤侵袭中的重要环节，抑制了肿瘤的侵袭能力，进而降低肿瘤转移的发生 [1] 。基底膜是防止恶性肿瘤细胞侵袭、转移的重要生物学屏障 [2] 。Ⅳ型胶原是基底膜的主要结构蛋白，其超螺旋结构区能特异性地被Ⅳ型胶原酶所降解，与肿瘤的恶性表型密切相关，其水平是肿瘤恶性程度的标志之一 [3，4] ，因此Ⅳ型胶原酶在肿瘤侵袭过程中发挥十分重要的作用。本实验结果证明，ATRA在体外、体内均可显著抑制Hca-F细胞分泌Ⅳ型胶原酶的能力，并降低其活性。给药组中，肿瘤细胞周围Ⅳ型胶原酶降解减轻，此作用对于保留组织基底膜的完整具有重要作用。
, 百拇医药
综上所述，ATRA抗MMPs对肝癌细胞Hca-F的侵袭转移能力有显著的抑制作用 [5] 。但它并非只特异性地作用于肿瘤转移过程中的某一环节，而是对转移过程中的多个 环节显示抑制作用，至少作用于细胞与基底膜的粘附与降解等环节，对肝癌细胞生物学行为多途径干扰，明显的降低了肝癌细胞的侵袭性，是一种很有希望和应用前途的抗肝癌细胞的药物。
参考文献
1 Okuno M，Kojima S，Akita K，et al.Retinoids in liver fibrosis and canˉcer.Front Biosci，2002，1:204-218.
2 Berend KR，Toth AP，Harrelson JM，et al.Association between ratio of matrix metalloproteinase-1to tissue inhibitor of metalloproteinase-1and local recurrence，metastasis，and survival in human chondrosarcoma.J Bone Jiont Surg Am，1998，80:11-17.
, http://www.100md.com
3 Zurker S，Mancuso P，Harrelson JM.Comparation of the technique for measurement of gelatinase/typeⅣcollagenase :enzyme-linked imˉmunoassay versus substrate degradation assays.Clin Exp Metastasis，1994，12:13-20.
4 Kleiner DE，Stetler-Stevenson WG.Quantitative zymography detection of picogram quantities of gelatinases.And Biochenl，1994，218:325-329.
5 Feng Y，Wang LY，Cai T，et al.All-trans-retinoic acid increased the expression of induced“anoikis”in SMMC-7721hepatocarcinoma cell.J Exp Clin Cancer Res，2001，20(3):429-438.
(收稿日期:2003-01-17)
作者单位:116011大连医科大学附属一院
(编辑晓 勇), 百拇医药(李冰 田波)
关键词 肝癌细胞 维甲酸 金属蛋白酶
【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2003)04-0293-02
The effect of all trans-retinoic acid on the invasion of
hepatocellular carcinomas
, 百拇医药
Li Bing，Tian BoThe First Hospital Affiliated to Dalian Medical University，Dalian116011.
【Abstract】 Objective To elucidate the effect of all trans-retinoic acid(ATRA)on the invasion of hepatoˉcellular carcinomas.Methods By the use of cell culture and experimental animal models，the influence of ATRA in Hca-F liver cancer cells invasion were studied in terms of the adhesion capacity to artificial basal membrane and proˉduction of collagenase typeⅣ.Results It was found that ATRA could inhibit the adhesion capacity as well as collaˉgenaseⅣsecretion of Hca-F cells in a dose related fashion.Conclusion ATRA can exert multiple effects on the invasion of Hca-F cells.
, 百拇医药
Key words hepatocellular carcinoma retinoic acid matrix metalprotienase
肝癌术后的复发和转移其主要原因在于肝癌细胞侵袭性的生物学行为，本研究通过动物实验观察全反式维甲酸(ATRA)抗基质金属蛋白酶(MMPs)，探讨对肝细胞癌高转移瘤株(Hca-F)侵袭性的生物学行为的影响。
1 材料与方法
1.1 材料 近交系615小鼠(由本校病理教研室动物室繁育)，普通级，雄性，6～8周龄，体重20～22g，小鼠腹水型Hca-F(本校病理教研室提供)。RPMI1640及小牛血清为Gibco公司提供:ATRA、Ⅳ型胶原为Sigma公司产品。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 液氮冻存的Hca-F细胞快速解冻，接种于615小鼠的腹腔，7天后无菌条件下抽取腹水，PBS液洗涤3次。将肿瘤细胞加入1640完全培养基(含20%的小牛血清)培养24h以除去巨噬细胞，离心收获肿瘤细胞。
, http://www.100md.com
1.2.2 ATRA对Hca-F细胞与人工基底膜粘附能力的影响 Ⅳ型胶原10mg滴加至24孔板内，ATRA孵育7天后的Hca-F细胞，用少量的PBS液洗涤数次，计算ATRA对Hca-F细胞的粘附抑制率。
1.2.3 ATRA对Hca-F细胞分泌Ⅳ型胶原酶的影响 孵育7天的Hca-F细胞以PBS液洗涤3次，利用Leica Q550IW图像处理软件对电泳结果进行灰度扫描，对各组标本的Ⅳ型胶原酶进行定量分析。
2 结果
ATRA对基底膜粘附能力有显著的抑制作用，在一定的浓度范围内，随着ATRA浓度的递增，其抑制作用逐渐增 强。ATRA在10 -7 mol/L，10 -6 mol/L，10 -5 mol/L浓度时，对粘附能力的抑制率分别为13.3%，26.9%，49.9%。明胶酶谱法检测表明，Hca-F细胞体外与体内均可以分泌大量的Ⅳ型胶原酶，主要为MMP-2(72KDⅣ型胶原酶)，MMP-9(92KDⅣ型胶原酶)和MMP-2的活性形式(66KD胶原酶)ATRA对Hca-F细胞在体内和体外分泌Ⅳ型胶原酶的能力和酶活性均有显著抑制作用。见表1。
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表1 ATRA对Hca-F细胞分泌Ⅳ型胶原酶的能力及酶活性的影响 注: ˇ P<0.05， Δ P<0.01
3 讨论
目前肝癌治疗仍以手术为主要治疗手段，但肝癌术后的复发率高是影响疗效的重要因素，肝癌细胞的侵袭性是病人术后复发的主要原因。肝癌细胞在侵袭转移过程中至少数次穿过基底膜，因此基底膜是抑制肝癌细胞转移的天然屏障。肝癌细胞在侵袭转移的过程中分泌的MMPs对基底膜的溶解和破坏作用，极大地增强了肝癌的侵袭性，对肝癌的转移起到了重要的作用。因此寻找有效的对抗MMPs的药物对减少肝癌的复发和转移有积极的意义。
美国国立癌症研究所提出了肿瘤侵袭的三步学说，即粘附、降解和移动。其中肝癌细胞分泌金属蛋白酶是肝癌细胞与基底膜粘附、降解以及向基质内移动的前提和条件。本实验通过体外实验证明，通过抗金属蛋白酶ATRA可显著降低Hca-F与基底膜和Ⅳ型胶原的粘附能力。因此AˉTRA打破了粘附—降解—移动这个肿瘤侵袭中的重要环节，抑制了肿瘤的侵袭能力，进而降低肿瘤转移的发生 [1] 。基底膜是防止恶性肿瘤细胞侵袭、转移的重要生物学屏障 [2] 。Ⅳ型胶原是基底膜的主要结构蛋白，其超螺旋结构区能特异性地被Ⅳ型胶原酶所降解，与肿瘤的恶性表型密切相关，其水平是肿瘤恶性程度的标志之一 [3，4] ，因此Ⅳ型胶原酶在肿瘤侵袭过程中发挥十分重要的作用。本实验结果证明，ATRA在体外、体内均可显著抑制Hca-F细胞分泌Ⅳ型胶原酶的能力，并降低其活性。给药组中，肿瘤细胞周围Ⅳ型胶原酶降解减轻，此作用对于保留组织基底膜的完整具有重要作用。
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综上所述，ATRA抗MMPs对肝癌细胞Hca-F的侵袭转移能力有显著的抑制作用 [5] 。但它并非只特异性地作用于肿瘤转移过程中的某一环节，而是对转移过程中的多个 环节显示抑制作用，至少作用于细胞与基底膜的粘附与降解等环节，对肝癌细胞生物学行为多途径干扰，明显的降低了肝癌细胞的侵袭性，是一种很有希望和应用前途的抗肝癌细胞的药物。
参考文献
1 Okuno M，Kojima S，Akita K，et al.Retinoids in liver fibrosis and canˉcer.Front Biosci，2002，1:204-218.
2 Berend KR，Toth AP，Harrelson JM，et al.Association between ratio of matrix metalloproteinase-1to tissue inhibitor of metalloproteinase-1and local recurrence，metastasis，and survival in human chondrosarcoma.J Bone Jiont Surg Am，1998，80:11-17.
, http://www.100md.com
3 Zurker S，Mancuso P，Harrelson JM.Comparation of the technique for measurement of gelatinase/typeⅣcollagenase :enzyme-linked imˉmunoassay versus substrate degradation assays.Clin Exp Metastasis，1994，12:13-20.
4 Kleiner DE，Stetler-Stevenson WG.Quantitative zymography detection of picogram quantities of gelatinases.And Biochenl，1994，218:325-329.
5 Feng Y，Wang LY，Cai T，et al.All-trans-retinoic acid increased the expression of induced“anoikis”in SMMC-7721hepatocarcinoma cell.J Exp Clin Cancer Res，2001，20(3):429-438.
(收稿日期:2003-01-17)
作者单位:116011大连医科大学附属一院
(编辑晓 勇), 百拇医药(李冰 田波)