血清乙肝病毒DNA的快速提取及其在定量PCR测定中的应用
【摘要】 目的 寻找简单、快速地提取血清乙型肝炎病毒(HBV)DNA并能应用于定量PCR测定的方法。方法 使用碱裂解法、酚氯仿法和煮沸裂解法同时提取血清HBV-DNA，比较荧光定量PCR测定的重复性和测定值的差异。结果 碱裂解法所得HBV-DNA量高于酚氯仿法和煮沸裂解法(P<0.05)，并且碱裂解法所得结果的重复性好于酚氯仿法和煮沸裂解法(CV分别为0.21，0.28和0.33)。结论 碱裂解法提取HBV-DNA简单、快速，适用于HBV-DNA荧光定量测定。
关键词 病毒 DNA 提取 PCR
【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2003)18-1680-02
A simple and rapid method for serum hepatitis B virus(HBV)DNA
extractionand its application on HBV-DNA detection
, 百拇医药
by fluorescence quantitative PCR Luo Xinjing，Xu Keqian
The faculty of medical laborary science in taizhou medical college，Taizhou318000.
【Abstract】 Objective To develop a simple and rapid method for extractingnucleic acid from serum on HBV-DNA detection by PCR.Methods an Alkaline lysis method was used to isolate serum HBV-DNA for fluorescence quantitative PCR and compared with conventional phenol-chloroform extraction method and boiling lysis method.Reˉsults The HBV-DNA quantitative values by PCR using the alkaline lysis were higher than the phenol-chloroform extraction method and boiling lysis method(P<0.05).Morever，The HBV-DNA quantitative values by PCR using the alkaline lysis were more reproducible than the phenol-chloroform extraction method and boiling lysis method(CV:0.21，0.28and0.33，respectively).Conclusion The alkaline lysis method is simple，rapid and efficient method for extraction of serum HBV-DNA and suitable for HBV-DNA quantitative PCR detection.
, 百拇医药
Key words viral DNA extraction PCR
乙型肝炎病毒(HBV)感染是乙型肝炎的主要病因。目前临床上对HBV的检测主要是靠血清学方法，但其检测率相对较低，对HBV早期感染不能有效的检测。而聚合酶链反应(PCR)则由于其特异性高、快速、灵敏，故在对HBV检测中迅速得到应用。特别荧光定量PCR技术，能对HBV-DNA实时定量测定，在乙型肝炎病人的临床治疗监测中具有重要参考价值，是国内用于HBV-DNA定量测定的基本方法。其中样本处理，即HBV-DNA的提取，是影响PCR测定准确性和重复性的重要因素。强碱溶液(如NaOH溶液)能裂解细胞膜和核膜，使DNA释放出来，并使核酸酶变性失活，保持DNA一级结构的稳定性 [1] ，故碱裂解法已广泛用于细菌中质粒DNA的分离 [2] 和植物组织中DNA的分离 [3] 。我们在Kaneko等人 [4] 的基础上对碱裂解法进行改良，提取慢性乙肝病人血清HBV-DNA并应用于荧光定量PCR，取得了很好的效果。同时与传统的HBV-DNA提取方法，即酚氯仿法和目前国内临床常用HBV-DNA测定的PCR试剂盒，即煮沸裂解法进行同步对比研究，结果报告如下。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样本 取临床乙型肝炎患者血清，并选择其中经ELISA法检测为“大三阳”的标本，即:HBsAg(+);HBeAg(+);anti-HBcAg(+)。
1.1.2 试剂 NaOH(上海生工)、HBV-DNA荧光定量PCR试剂盒(华美生物技术公司)。
1.1.3 仪器 5700型荧光定量PCR仪(PE，美国)、离心机(湖南仪表总厂)。
1.2 方法
1.2.1 DNA的提取 (1)碱裂解法:在Kaneko等 [4] 基础上进行改良。50μl血清中加入50μl0.4M NaOH，80℃保温10min。15000r离心30s，取上清，加入25μl0.4M trisHCl pH7.5，-4℃贮存备用。(2)酚氯仿抽提法 [5] :备用血清50ml加入0.5%SDS和蛋白酶K(终浓度为100μg/ml)70℃消化3h。加等体积的苯酚、氯仿、异戌醇混合物(体积比为25:24:1)和氯仿-异戌醇混合物(体积比为24:1)各抽提1次，留水相，加入1/10体积约3mol/L醋酸钠和2～2.5倍体积的冰无水乙醇离心沉淀，再用70%的乙醇洗1次，自然干燥，37℃下在50μl TE中溶解，-4℃贮存备用。(3)煮沸裂解法:按试剂盒说明操作简述如下:50μl血清中加入等体积裂解液，煮沸10min。15000r离心5min，然后取上清，-4℃贮存备用。
, 百拇医药
1.2.2 HBV-DNA定量测定 取20份乙型肝炎患者血清，每一份样本分别经上述3种方法处理后，然后进行荧光定量测定。操作和条件参照HBV-DNA荧光定量PCR试剂盒说明。
1.2.3 样本处理方法对测定的重复性的影响 取1份样本分别用上述3种方法各提取10次，然后进行荧光定量测定，比较3种不同方法的测定重复性。
1.2.4 统计学分析 3种不同方法处理样本后所测得HBV-DNA含量的均值比较采用单因素方差分析。
2 结果
2.1 HBV-DNA荧光定量的结果 从表1可见，碱裂解法提取的DNA含量(9.86×10 6 拷贝数/ml)高于酚氯仿法(7.24×10 6 拷贝数/ml)和煮沸裂解法(6.32×10 6 拷贝数/ml(P<0.05)，但所用时间与煮沸裂解法相似，明显低于酚氯仿法。
, 百拇医药
表1 3种样本处理方法对HBV-DNA的定量的影响
2.2 对HBV-DNA定量测定重复性的结果 从表2可见，同一样本分别用3种方法各提取10次，碱裂解法处理样本，测定HBV-DNA的重复性(CV:0.21)明显好于酚氯仿法(CV:0.28)和煮沸裂解法(CV:0.33)。
表2 3种样本处理方法对HBV-DNA 定量测定重复性的影响
3 讨论
HBV-DNA定量测定在乙型肝炎病人临床诊断和治疗监测有重要参考价值，这就要求HBV-DNA荧光定量PCR要有很好的敏感性和重复性。影响PCR测定敏感性和重复性的因素，除PCR本身以外，还有一个常被忽略但也十分重要的因素，即血清HBV-DNA的提取。传统的HBV-DNA提取方法，如酚氯仿法，提取HBV-DNA纯度较高，但这种方法步骤繁琐，且需多次转移，容易造成样品DNA的丢失，使荧光定量PCR测定HBV-DNA的敏感性和准确性降低;煮沸裂解法提取DNA较酚氯仿法简单、快速，因而国内大部分试剂盒均采用此方法处理样品。但是煮沸处理样品只是将病毒核酸从病毒颗粒中释放出来，因而在吸取离心后的样本上清用于扩增时样本中很可能或多或少地含有 一些标本成分，如血红素和其他一些蛋白质等。研究表明，血红素可与Taq酶发生不可逆结合而抑制Taq酶活性，从而影响PCR测定 [6] ，特别对HBV-DNA荧光定量测定重复性较差。碱裂解法提取DNA，虽然也没经过纯化处理，但强碱溶液可使PCR抑制物如血红素和其他一些蛋白质变性失活，从而解除对Taq酶的抑制作用 [7] ，因而HBV-DNA荧光定量测定重复性较好。我们的结果也表明，碱裂解法处理样本后，HBV-DNA荧光定量测定的批内CV明显小于煮沸裂解法和酚氯仿法。碱裂解法提取DNA，一是碱裂解细胞能力强，二是基本在一个试管中进行，无多次转移，避免了样本DNA的丢失，故HBV-DNA荧光定量测定敏感性和准确性较高。我们的研究也表明，碱裂解法处理标本，测量HBV-DNA的含量明显高于酚氯仿法和煮沸裂解法。
, 百拇医药
Keneko等 [4] 报道了从血清中提取HBV-DNA的试验并进行了成功的扩增。我们在此基础上做了改进，发现当NaOH浓度增大到0.4M，扩增效率显著增高;当裂解的时间不变，温度37～80℃时，扩增效率较高;当裂解温度为80℃时，扩增效率最高，HBV-DNA定量测定重复性最好。同时裂解温度为80℃，提取HBV-DNA所需时间可明显缩短。
碱裂解法处理样本还有以下许多优点:(1)步骤少，操作简单，省时，整个过程不超过15min;(2)基本在一个试管中进行，无需多次转移，降低了外源性HBV-DNA污染的可能性，从而消除了PCR分析的潜在错误;(3)耗费极低，无需贵重试剂和特殊仪器。
综上所述，碱裂解法提取血清HBV-DNA，简单、快速、耗费低，用于HBV-DNA荧光定量测定敏感性高、重复性好，适用于临床实验室推广和使用。
参考文献
, 百拇医药
1 Klintschar M and Neuhuber F.Evaluation of an Alkaline lysis Method for the Extraction of DNA fromWhole Blood and Forensic stains for STR Analysis.J Forensic sci，2000，45(3):669-673.
2 Birnboim HL，Doly J.A rapid alkine extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA.Nucleic Acids，1979，7:1513-1523.
3 Wang H，Qi M，Culter AJ，et al.A simple method of preparing plant sample for PCR.Nucleic Acids Res，1993，21:4155-4164.
, 百拇医药
4 Kaneko S，Feinstone SM，Miller RH，et al.Rapid and sensitive Method for the Detection of serum Hepatitis B virus DNA using the polymerase Chain Reaction Technique.J Clin MicroBio，1989，27(9):1930-1933.
5 Kamoto H.Hepatitis B virus with precore region defects prevail in perˉsistently infected hosts along with seroconversion to the antibody against e antigen.J Virol，1990，64(3):1298-1303.
6 Neumaier M，Braun A，Wagener C.Fundamentals of quality assessment of molecular amplication methods in clinical diagnostics.Clin Chem，1998，44:1-26.
7 Bourke MT，Scherczinger CA，Ladel，et al.NaOH Treatment to Neutralˉize inhabitors of Taq polymerase.J Forensic Sci，1999，44(5):1046-1050.
(编辑子 萱)
作者单位:318000浙江省台州学院医学院检验系
410008中南大学湘雅医学院检验系, http://www.100md.com(罗心静)
关键词 病毒 DNA 提取 PCR
【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2003)18-1680-02
A simple and rapid method for serum hepatitis B virus(HBV)DNA
extractionand its application on HBV-DNA detection
, 百拇医药
by fluorescence quantitative PCR Luo Xinjing，Xu Keqian
The faculty of medical laborary science in taizhou medical college，Taizhou318000.
【Abstract】 Objective To develop a simple and rapid method for extractingnucleic acid from serum on HBV-DNA detection by PCR.Methods an Alkaline lysis method was used to isolate serum HBV-DNA for fluorescence quantitative PCR and compared with conventional phenol-chloroform extraction method and boiling lysis method.Reˉsults The HBV-DNA quantitative values by PCR using the alkaline lysis were higher than the phenol-chloroform extraction method and boiling lysis method(P<0.05).Morever，The HBV-DNA quantitative values by PCR using the alkaline lysis were more reproducible than the phenol-chloroform extraction method and boiling lysis method(CV:0.21，0.28and0.33，respectively).Conclusion The alkaline lysis method is simple，rapid and efficient method for extraction of serum HBV-DNA and suitable for HBV-DNA quantitative PCR detection.
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Key words viral DNA extraction PCR
乙型肝炎病毒(HBV)感染是乙型肝炎的主要病因。目前临床上对HBV的检测主要是靠血清学方法，但其检测率相对较低，对HBV早期感染不能有效的检测。而聚合酶链反应(PCR)则由于其特异性高、快速、灵敏，故在对HBV检测中迅速得到应用。特别荧光定量PCR技术，能对HBV-DNA实时定量测定，在乙型肝炎病人的临床治疗监测中具有重要参考价值，是国内用于HBV-DNA定量测定的基本方法。其中样本处理，即HBV-DNA的提取，是影响PCR测定准确性和重复性的重要因素。强碱溶液(如NaOH溶液)能裂解细胞膜和核膜，使DNA释放出来，并使核酸酶变性失活，保持DNA一级结构的稳定性 [1] ，故碱裂解法已广泛用于细菌中质粒DNA的分离 [2] 和植物组织中DNA的分离 [3] 。我们在Kaneko等人 [4] 的基础上对碱裂解法进行改良，提取慢性乙肝病人血清HBV-DNA并应用于荧光定量PCR，取得了很好的效果。同时与传统的HBV-DNA提取方法，即酚氯仿法和目前国内临床常用HBV-DNA测定的PCR试剂盒，即煮沸裂解法进行同步对比研究，结果报告如下。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样本 取临床乙型肝炎患者血清，并选择其中经ELISA法检测为“大三阳”的标本，即:HBsAg(+);HBeAg(+);anti-HBcAg(+)。
1.1.2 试剂 NaOH(上海生工)、HBV-DNA荧光定量PCR试剂盒(华美生物技术公司)。
1.1.3 仪器 5700型荧光定量PCR仪(PE，美国)、离心机(湖南仪表总厂)。
1.2 方法
1.2.1 DNA的提取 (1)碱裂解法:在Kaneko等 [4] 基础上进行改良。50μl血清中加入50μl0.4M NaOH，80℃保温10min。15000r离心30s，取上清，加入25μl0.4M trisHCl pH7.5，-4℃贮存备用。(2)酚氯仿抽提法 [5] :备用血清50ml加入0.5%SDS和蛋白酶K(终浓度为100μg/ml)70℃消化3h。加等体积的苯酚、氯仿、异戌醇混合物(体积比为25:24:1)和氯仿-异戌醇混合物(体积比为24:1)各抽提1次，留水相，加入1/10体积约3mol/L醋酸钠和2～2.5倍体积的冰无水乙醇离心沉淀，再用70%的乙醇洗1次，自然干燥，37℃下在50μl TE中溶解，-4℃贮存备用。(3)煮沸裂解法:按试剂盒说明操作简述如下:50μl血清中加入等体积裂解液，煮沸10min。15000r离心5min，然后取上清，-4℃贮存备用。
, 百拇医药
1.2.2 HBV-DNA定量测定 取20份乙型肝炎患者血清，每一份样本分别经上述3种方法处理后，然后进行荧光定量测定。操作和条件参照HBV-DNA荧光定量PCR试剂盒说明。
1.2.3 样本处理方法对测定的重复性的影响 取1份样本分别用上述3种方法各提取10次，然后进行荧光定量测定，比较3种不同方法的测定重复性。
1.2.4 统计学分析 3种不同方法处理样本后所测得HBV-DNA含量的均值比较采用单因素方差分析。
2 结果
2.1 HBV-DNA荧光定量的结果 从表1可见，碱裂解法提取的DNA含量(9.86×10 6 拷贝数/ml)高于酚氯仿法(7.24×10 6 拷贝数/ml)和煮沸裂解法(6.32×10 6 拷贝数/ml(P<0.05)，但所用时间与煮沸裂解法相似，明显低于酚氯仿法。
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表1 3种样本处理方法对HBV-DNA的定量的影响
2.2 对HBV-DNA定量测定重复性的结果 从表2可见，同一样本分别用3种方法各提取10次，碱裂解法处理样本，测定HBV-DNA的重复性(CV:0.21)明显好于酚氯仿法(CV:0.28)和煮沸裂解法(CV:0.33)。
表2 3种样本处理方法对HBV-DNA 定量测定重复性的影响
3 讨论
HBV-DNA定量测定在乙型肝炎病人临床诊断和治疗监测有重要参考价值，这就要求HBV-DNA荧光定量PCR要有很好的敏感性和重复性。影响PCR测定敏感性和重复性的因素，除PCR本身以外，还有一个常被忽略但也十分重要的因素，即血清HBV-DNA的提取。传统的HBV-DNA提取方法，如酚氯仿法，提取HBV-DNA纯度较高，但这种方法步骤繁琐，且需多次转移，容易造成样品DNA的丢失，使荧光定量PCR测定HBV-DNA的敏感性和准确性降低;煮沸裂解法提取DNA较酚氯仿法简单、快速，因而国内大部分试剂盒均采用此方法处理样品。但是煮沸处理样品只是将病毒核酸从病毒颗粒中释放出来，因而在吸取离心后的样本上清用于扩增时样本中很可能或多或少地含有 一些标本成分，如血红素和其他一些蛋白质等。研究表明，血红素可与Taq酶发生不可逆结合而抑制Taq酶活性，从而影响PCR测定 [6] ，特别对HBV-DNA荧光定量测定重复性较差。碱裂解法提取DNA，虽然也没经过纯化处理，但强碱溶液可使PCR抑制物如血红素和其他一些蛋白质变性失活，从而解除对Taq酶的抑制作用 [7] ，因而HBV-DNA荧光定量测定重复性较好。我们的结果也表明，碱裂解法处理样本后，HBV-DNA荧光定量测定的批内CV明显小于煮沸裂解法和酚氯仿法。碱裂解法提取DNA，一是碱裂解细胞能力强，二是基本在一个试管中进行，无多次转移，避免了样本DNA的丢失，故HBV-DNA荧光定量测定敏感性和准确性较高。我们的研究也表明，碱裂解法处理标本，测量HBV-DNA的含量明显高于酚氯仿法和煮沸裂解法。
, 百拇医药
Keneko等 [4] 报道了从血清中提取HBV-DNA的试验并进行了成功的扩增。我们在此基础上做了改进，发现当NaOH浓度增大到0.4M，扩增效率显著增高;当裂解的时间不变，温度37～80℃时，扩增效率较高;当裂解温度为80℃时，扩增效率最高，HBV-DNA定量测定重复性最好。同时裂解温度为80℃，提取HBV-DNA所需时间可明显缩短。
碱裂解法处理样本还有以下许多优点:(1)步骤少，操作简单，省时，整个过程不超过15min;(2)基本在一个试管中进行，无需多次转移，降低了外源性HBV-DNA污染的可能性，从而消除了PCR分析的潜在错误;(3)耗费极低，无需贵重试剂和特殊仪器。
综上所述，碱裂解法提取血清HBV-DNA，简单、快速、耗费低，用于HBV-DNA荧光定量测定敏感性高、重复性好，适用于临床实验室推广和使用。
参考文献
, 百拇医药
1 Klintschar M and Neuhuber F.Evaluation of an Alkaline lysis Method for the Extraction of DNA fromWhole Blood and Forensic stains for STR Analysis.J Forensic sci，2000，45(3):669-673.
2 Birnboim HL，Doly J.A rapid alkine extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA.Nucleic Acids，1979，7:1513-1523.
3 Wang H，Qi M，Culter AJ，et al.A simple method of preparing plant sample for PCR.Nucleic Acids Res，1993，21:4155-4164.
, 百拇医药
4 Kaneko S，Feinstone SM，Miller RH，et al.Rapid and sensitive Method for the Detection of serum Hepatitis B virus DNA using the polymerase Chain Reaction Technique.J Clin MicroBio，1989，27(9):1930-1933.
5 Kamoto H.Hepatitis B virus with precore region defects prevail in perˉsistently infected hosts along with seroconversion to the antibody against e antigen.J Virol，1990，64(3):1298-1303.
6 Neumaier M，Braun A，Wagener C.Fundamentals of quality assessment of molecular amplication methods in clinical diagnostics.Clin Chem，1998，44:1-26.
7 Bourke MT，Scherczinger CA，Ladel，et al.NaOH Treatment to Neutralˉize inhabitors of Taq polymerase.J Forensic Sci，1999，44(5):1046-1050.
(编辑子 萱)
作者单位:318000浙江省台州学院医学院检验系
410008中南大学湘雅医学院检验系, http://www.100md.com(罗心静)