腺病毒载体的发展与应用
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)16-2459-03
用人的一些病毒为载体来治疗诸如癌症和遗传疾病的观念是在20世纪80年代初提出的。腺病毒载体是其中的一种，此外还有逆转录病毒等。
腺病毒基因组约为35kb，分为7个血清型，采用其中较为安全的血清型2和5作为载体。腺病毒做为载体有很多优点:它能感染广泛的细胞类型;能感染分裂细胞或不分裂细胞;腺病毒的疫苗已为人们使用，具有较好的安全性，腺病毒基因组不会整合到细胞基因组中(某些血清型除外);腺病毒感染细胞后能产生较高的滴度等。
1 腺病毒载体的发展
腺病毒载体在起初的时候主要用做基因表达系统，近年来更多的用于基因转移和基因治疗。
腺病毒是1953年Rowe等从健康人腺样组织的细胞培养中发现的。与此同时，Hilleman等人从急性呼吸道疾病患者的咽喉洗液中也分离到同样的病毒。腺病毒有以下几个特点:它可引起人类许多急性感染，包括流感样疾病，急性咽炎，婴幼儿致死性肺炎，结合膜炎，角膜结合膜炎，膀胱炎以及严重的肠炎等，它还可引起人扁桃体炎，腺样体和其它淋巴组织的持续性感染。迄今研究的腺病毒均可使非许可性鼠样细胞发生转化，有些型别在新生地鼠和小鼠有致癌性的腺病毒的基因具有中等的复杂性，其转录与复制依赖细胞的聚合酶，腺病毒的基因组类似一个微型染色体，它是缺损性DNA病毒，即腺病毒伴随病毒AAV的辅助病毒。腺病毒在自然界分布广泛，迄今所知至少有93个型别，腺病毒科分为两个属:哺乳动物腺病毒属(Mastadenˉovirus)和禽腺病毒属(Aviadenovirus)。
, 百拇医药
人腺病毒的亚属之间有高度的重组率，不是一个稳定的种。
腺病毒无包膜，20面体对称，直径为70～90nm，有252壳粒，其中20面顶角壳粒为12个五邻体(penton)，每个五邻体有2条纤维，长度相同或不同纤维上带有主要的种特异性抗原决定簇和次要的亚属特异性抗原决定簇。除五邻体外有240个非顶角壳粒，称为六邻体(Hexon)，后者带有主要的属和亚属特异性抗原决定簇和次要的种特异性抗原决定簇 [1] 。
病毒基因组为一个dsDNA分子病毒毒粒含有14个蛋白腺病毒，含116%～170%的双链DNA，其余为蛋白质，无类脂质，含有1%的糖纤维。哺乳动物腺病毒的DNA约36kb，Ad5的沉淀常数为31S，Ad2为32S DNA分子为线状，长11～13μm CsCl的浮力密度为133～135g/cm 3 。
起初发展腺病毒载体是为了用于真核基因表达和疫苗研究，主要使用人Ad2和Ad5构建。重组腺病毒载体能容纳105%的外源基因。用于表达的rAd分为两类，一类是缺乏生长必需区，需要完整病毒的辅助的rAd，构建于80年代初期。另一类则不需辅助，即E1区缺失、E3区缺失或沉默区缺失的pAd。E1区缺失影响病毒复制，必须在表达E1蛋白的细胞系中包装，E3区缺失影响病毒的免疫逃避。所以，E1区缺失的rAd更为安全;而E3区缺失的rAd不影响病毒复制，可设计为重组活疫苗，并且适于体外重组蛋白的表达。E1区的包装容量可达75kb，E3区的包装容量可达40kb，E1、E3双缺失可容纳50kb的插入片段。E1缺失的载体，外源基因可双向表达，右向启动子具有较高的表达水平，E3缺失的载体若无强启动子，外源基因主要为右向表达[2，5，8～11] 。
, 百拇医药
许多抗原已成功的克隆到腺病毒载体，并且刺激实验动物产生体液或细胞免疫反应。如:HBV的HBsAg和HBcAg [9] ;多瘤病毒mT抗原 [6] ;HIV I型的env，gag，gp120，p24，gp41蛋白 [7] ;单纯疱疹病毒tk蛋白 [3] ;gB蛋白 [13] 等。表达效率受各个表达体系的具体条件影响很大，如表达细胞的分化程度。
2 腺病毒载体的应用
随着研究的进展，近年来，腺病毒载体主要用于基因治疗和基因转移。基因治疗主要使用E1区缺失的Ad5型载体，已用于帕金森氏病、乳腺癌、食管癌 [14～16] 、杜式肌营养不良症DMD [17] 、肥胖症、关节炎、软骨损伤、原发性肝癌等疾病的基因治疗。其中，1B55缺失的重组载体Adv-AFP-E1AdB能有效的摧毁HCC细胞，使裸小鼠的肝肿瘤减小 [18]。
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重组腺病毒载体用于基因治疗存在3个主要问题:即转录水平低、毒力回复及不能多次接种。因此研究者对rAd进行了改造，包括:在E4区增加缺失区域 [19] ;使E2A区发生突变 [20] ;使壳体化信号失效 [21] ;使用免疫抑制剂，如FK506 [22] ;采用单克隆抗体anti-CD4 [22，23] ;构建E1、E3、E2A缺损的载体或E1和E4缺损的载体。修改293包装细 胞系，构建新的细胞系，如911、pTG6564-17及pTG6559-5。其中，911细胞系的使用阻止了毒力回复，单克隆抗体的使用也有一定的效果，但其它尝试收效甚微。
肌肉或静脉注射rAd能刺激相应的中和抗体产生，肌肉注射在14～21天产生中和抗体高峰，但重复的肌肉注射却不受血清中抗体的影响，静脉注射却被中和抗体阻碍。在Gunn大鼠中，表达E3区的一部分减低了抗腺病毒载体的体液免疫反应，并且使rAd能重复使用 [33] 。为使转基因定位表达，用抗rAd IgG复合物介导Ad基因定位转导，有利于提高治疗效果，避免副作用的产生 [34] 。或将腺病毒的突触纤维加以改造或替换 [35] 。
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在一些细胞的表面无CAR，如骨骼肌细胞，因此构建了共表达外源基因和CAR的rAd，发现外源基因的表达十分有效，hCAR的表达不影响病毒的整合 [24] 。构建纤维结HI环肽段的重组Ad载体，使感染无CAR细胞的效率提高了100～1000倍 [25] 。
研究发现膀胱中的两类聚酰胺物质能提高rAd介导的外源基因的表达 [27] 。
起初腺病毒载体的大量制备及重组病毒的筛选，是一个耗时并需要一定操作技术的过程，近年来，国外学者对腺病毒载体进行了一系列改进，包括在大肠杆菌里发生同源重组和通过重组酶FLP及Cre介导的同源重组，提高重组效率，节约筛选时间。
构建腺病毒载体的主要思路是删除其早期基因(主要是E1A和E3A)的部分或全部，使外源基因能够通过同源重组的方式进入病毒基因的框架。外源基因主要进入E1区，因为E1区是病毒复制所必需的，缺失E1区的腺病毒可以在反式提供E1区编码产物的细胞系中，如293细胞系中复制。而E3区的缺失主要是为了扩大病毒的包装容量。E3区的编码产物gp19K能够螯和MHCI类分子，使其滞留在内质网中，从而减弱了针对腺病毒的细胞免疫。因此，在E3区中插入外源基因或是E3缺失，使gp19K不能表达，可能影响腺病毒载体所携带外源基因的持续表达和腺病毒载体的多次使用。就腺病毒载体的目的而言，使用它作为表达系统，如果腺病毒携带的外源基因是一个抗原，即将腺病毒载体用作疫苗，那么机体的免疫情况就十分复杂，如果携带的外源基因是一个治疗性蛋白，即将腺病毒载体用做基因治疗或基因转移，那么如何降低机体对腺病毒的免疫是十分重要的。总之，如何降低腺病毒载体本身的免疫作用是腺病毒载体发展中的一个关键问题。针对这个问题，首先是删除了腺病毒的晚期基因编码部分，研究发现，晚期基因E2、E4的编码产物是主要的抗原性蛋白，后构建了一个gut-less腺病毒，即删除了腺病毒的所有基因编码区，只剩下包装信号和两头的ITR序列，中间填充一些报告基因序列或标记序列，这种载体必须有辅助病毒存在才能在特定的细胞系中获拯救。可是拯救病毒的污染又成为问题，拯救病毒的污染可减小到0.5%。另外采用不同血清型的腺病毒反复注射也能降低机体的免疫排斥。从实验研究走向成熟稳定的临床应用，还需要在腺病毒的分子生物学、载体优化设计、安全性评估等方面张开深入的广泛的研究。
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参考文献
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(编辑秋 实)
作者单位:650118昆明中国医学科学院中国协和医科大学医学生物学研究所, 百拇医药(刘)
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病毒基因组为一个dsDNA分子病毒毒粒含有14个蛋白腺病毒，含116%～170%的双链DNA，其余为蛋白质，无类脂质，含有1%的糖纤维。哺乳动物腺病毒的DNA约36kb，Ad5的沉淀常数为31S，Ad2为32S DNA分子为线状，长11～13μm CsCl的浮力密度为133～135g/cm 3 。
起初发展腺病毒载体是为了用于真核基因表达和疫苗研究，主要使用人Ad2和Ad5构建。重组腺病毒载体能容纳105%的外源基因。用于表达的rAd分为两类，一类是缺乏生长必需区，需要完整病毒的辅助的rAd，构建于80年代初期。另一类则不需辅助，即E1区缺失、E3区缺失或沉默区缺失的pAd。E1区缺失影响病毒复制，必须在表达E1蛋白的细胞系中包装，E3区缺失影响病毒的免疫逃避。所以，E1区缺失的rAd更为安全;而E3区缺失的rAd不影响病毒复制，可设计为重组活疫苗，并且适于体外重组蛋白的表达。E1区的包装容量可达75kb，E3区的包装容量可达40kb，E1、E3双缺失可容纳50kb的插入片段。E1缺失的载体，外源基因可双向表达，右向启动子具有较高的表达水平，E3缺失的载体若无强启动子，外源基因主要为右向表达[2，5，8～11] 。
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随着研究的进展，近年来，腺病毒载体主要用于基因治疗和基因转移。基因治疗主要使用E1区缺失的Ad5型载体，已用于帕金森氏病、乳腺癌、食管癌 [14～16] 、杜式肌营养不良症DMD [17] 、肥胖症、关节炎、软骨损伤、原发性肝癌等疾病的基因治疗。其中，1B55缺失的重组载体Adv-AFP-E1AdB能有效的摧毁HCC细胞，使裸小鼠的肝肿瘤减小 [18]。
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重组腺病毒载体用于基因治疗存在3个主要问题:即转录水平低、毒力回复及不能多次接种。因此研究者对rAd进行了改造，包括:在E4区增加缺失区域 [19] ;使E2A区发生突变 [20] ;使壳体化信号失效 [21] ;使用免疫抑制剂，如FK506 [22] ;采用单克隆抗体anti-CD4 [22，23] ;构建E1、E3、E2A缺损的载体或E1和E4缺损的载体。修改293包装细 胞系，构建新的细胞系，如911、pTG6564-17及pTG6559-5。其中，911细胞系的使用阻止了毒力回复，单克隆抗体的使用也有一定的效果，但其它尝试收效甚微。
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构建腺病毒载体的主要思路是删除其早期基因(主要是E1A和E3A)的部分或全部，使外源基因能够通过同源重组的方式进入病毒基因的框架。外源基因主要进入E1区，因为E1区是病毒复制所必需的，缺失E1区的腺病毒可以在反式提供E1区编码产物的细胞系中，如293细胞系中复制。而E3区的缺失主要是为了扩大病毒的包装容量。E3区的编码产物gp19K能够螯和MHCI类分子，使其滞留在内质网中，从而减弱了针对腺病毒的细胞免疫。因此，在E3区中插入外源基因或是E3缺失，使gp19K不能表达，可能影响腺病毒载体所携带外源基因的持续表达和腺病毒载体的多次使用。就腺病毒载体的目的而言，使用它作为表达系统，如果腺病毒携带的外源基因是一个抗原，即将腺病毒载体用作疫苗，那么机体的免疫情况就十分复杂，如果携带的外源基因是一个治疗性蛋白，即将腺病毒载体用做基因治疗或基因转移，那么如何降低机体对腺病毒的免疫是十分重要的。总之，如何降低腺病毒载体本身的免疫作用是腺病毒载体发展中的一个关键问题。针对这个问题，首先是删除了腺病毒的晚期基因编码部分，研究发现，晚期基因E2、E4的编码产物是主要的抗原性蛋白，后构建了一个gut-less腺病毒，即删除了腺病毒的所有基因编码区，只剩下包装信号和两头的ITR序列，中间填充一些报告基因序列或标记序列，这种载体必须有辅助病毒存在才能在特定的细胞系中获拯救。可是拯救病毒的污染又成为问题，拯救病毒的污染可减小到0.5%。另外采用不同血清型的腺病毒反复注射也能降低机体的免疫排斥。从实验研究走向成熟稳定的临床应用，还需要在腺病毒的分子生物学、载体优化设计、安全性评估等方面张开深入的广泛的研究。
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(编辑秋 实)
作者单位:650118昆明中国医学科学院中国协和医科大学医学生物学研究所, 百拇医药(刘)