c-met和ki67在大肠癌中的意义
【摘要】 目的 探讨c-met和ki67在大肠癌中的意义。方法 免疫组化S-P法测定大肠癌石蜡切片中c-met和ki67的表达，并结合临床病理指标分析。结果 c-met在大肠癌的阳性表达率为75.0%(30/40)，c-met表达和组织分化、淋巴结转移、Dukes分期有关，和患者的性别、年龄、肿瘤大小无相关性。c-met阳性表达组ki67指数高于c-met阴性表达组。结论 c-met蛋白的异常表达与大肠癌的发生及大肠癌的分化不良有关，并有促进大肠癌细胞增殖的作用。
关键词 大肠癌 免疫组化 c-met蛋白 ki67抗原
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-077X(2003)06-0489-02
Significance of c-met and ki67overexpression in colorectal cancer
, 百拇医药
Du Zhijian，Zhang Yuyin，Cai Jianhui
Department of Gastrointestinal Surgery of the Second Hospital of Hebei University，Shijiazhuang050000.
【Abstract】 Objective The aims of this study were to investigate the expression of c-met protein and ki67antigen in colorectal cancer and their relationship with clinicopathological factors.Methods The expression of c-met and ki67were studied by means of a specific and sensitive immunological assay.(S-P method).The results of the expression were correlated with clinicopathological factors.Results The positive expression rate of c-met in colorecˉtal cancer was75.0%(30/40).c-met positive expression had a correlation with the tissue differentiation，lymph node metastasis and Dukes stage.It had no correlation with age，sex，andthe size of the tumor.Conclusion The overˉexpression of c-met was correlated with the genesis of colorectal cancer，and its tissue differenation.The abnormal c-met protein had potential ability to promote proliferation.
, 百拇医药
Key words colorectal cancer immunohistochemistry c-me protein ki67antigen
大肠癌是消化道常见的恶性肿瘤之一，每年全世界约有50万人发病，在西方国家大肠癌死亡率仅次于肺癌和乳腺瘤，居恶性肿瘤死亡率第3位 [1] 。据1990～1992年中国1/10人口死因抽样调查结果 [1] 显示，中国大肠癌的年死亡率为5.30/10万。居恶性肿瘤死因第五位[2] 。近年来我国大肠癌发病率呈升高趋势。在临床就诊的大肠癌病人，大致分为两大类，约1/3病人在就诊时肿瘤已至晚期不能切除或有弥漫性转移，这类病人预后很差，平均生存期约7个月。另外2/3的病人能切除原发肿瘤。即使能行“根治性切除”，约50%的病人生存期不超过5年。大部分患者死于肝转移，但有证据表明，这些患者同时存在广泛的肝外转移 [1] 。研究表明 [3] ，许多大肠癌发生肝转移较早，但有些大肠癌并不发生转移，可能是一些分子机制决定了大肠癌是否发生转移。研究大肠癌发生、发展过程中的分子机制及其与临床病理的联系，对提高大肠癌的预后预测和采取更有效的治疗方法都有重要意义。
, http://www.100md.com
c-met原癌基因产物c-met蛋白是肝细胞生长因子受体，肝细胞生长因子和过度表达的c-met蛋白结合，在肿瘤的发生、进展和血管形成中都起着重要作用 [4] ki67是应用最广泛的增殖细胞标记之一，它的检测是评估人类各种组织增殖组分的可靠和简单的方法。
1 材料与方法
1.1 标本 所有大肠癌标本均选自河北医科大学附属第 二医院胃肠外科2000年5月～2001年7月手术切除原发性大肠癌标本共40例，其中男25例，女15例，男女比例1.67∶1，年龄28～82岁，平均年龄55.5岁，术前均未接受任何抗肿瘤治疗。手术后病理组织学类型为:管状腺癌20例、乳头状腺癌6例、粘液腺癌10例、印戒细胞癌4例。分化程度:中、高分化腺癌26例、低、未分化腺癌14例。有淋巴结转移13例，无淋巴结转移27例。按Dukes分期:A级12例、B级15例、C级13例。
1.2 免疫组织化学染色 采用链霉素亲生物素-过氧化物酶法(SP法)。c-met多克隆抗体、ki67和SP试剂盒为Santa Cruz公司产品。染色步骤如下:石蜡切片常规二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，PBS洗2min×3;3%H 2 O 2 10min;PBS洗2min×3;山羊血清封闭15min;一抗(1∶50)室温过夜;PBS洗2min×3;生物素标记二抗15min;PBS洗2min×3;加SP15min，PBS洗2min×3，DAB(中山公司)显色5～10min，自来水充分冲洗，苏木素复染;脱水、透明，封片。
, 百拇医药
1.3 对照 以PBS代替一抗做空白对照，用已知胃癌阳性切片做阳性对照。
1.4 结果判断 c-met在光镜下观片，结果以细胞膜出现棕黄色颗料为c-met蛋白染色阳性细胞，可伴有细胞浆着色。以同一切片阳性细胞≥30%同类病变细胞为阳性病例。ki67以细胞核出现棕黄色颗粒为阳性，随机选取10个高倍镜视野共计数1000个细胞，以ki67阳性细胞所占百分数，计做ki67指数。
1.5 统计学方法 计数资料用卡方检验，计量资料用t检验。用SPSS10.0统计软件处理。
2 结果
c-met蛋白在大肠癌中的表达部位在癌细胞的细胞膜特别是腺细胞的腔面膜上，在低分化腺癌呈弥漫分布，表达强度高于高分化腺癌。与临床病理的关系见表1。C-met阳性组ki67指数为35.59±4.57，c-met阴性表达ki67指数为26.7±1.90，两组比较差异有显著性(P<0.05)。
, 百拇医药
表1 c-met与临床病理的关系
3 讨论
c-met蛋白是由原癌基因c-met编码的一类蛋白质。c-met基因位于人类7号染色体长臂(7q31) [5] 。其成熟的c-met蛋白位于细胞膜上，是一种细胞膜受体，有α亚基和β亚基。β亚基有胞外区、跨膜区和胞内区。α亚基只有胞外部分，借助于二硫键附于β亚基上。α亚基和β亚基的胞外区是配体识别部位，而胞内部分具有酪氨酸激酶活性。c-met受体的配体是肝细胞生长因子(hepatocyte growth facˉtor，HGF)，也称为离散因子(scatter factor)。HGF和c-met结合导致受体自身磷酸化，增强了c-met酪氨酸激酶的活 性，导致多种底物蛋白的酪氨酸磷酸化。如磷脂酶Cr、P13-K、生长因子受体结合蛋白-1、生长因子受体结合蛋白-2和信号转导与转录因子-3等 [6] 。庄小强等 [7] 研究了169例经病理学检查证实的不同胃粘膜病变c-met蛋白表达情况，结果发现浅表性胃炎c-met蛋白表达率较低，而随着病变从肠化生→异型增生→癌变演变，阳性表达逐步升高，以进展期胃癌更显著，同时，胃粘膜增殖程度与c-met蛋白阳性表达强度密切关系分析，两者显著相关，表明c-met蛋白表达反映胃粘膜细胞的增殖状态并具有恶变倾向，同时50例胃癌术后5年随访，证实c-met蛋白阳性表达者生存率明显低于c-met蛋白表达阴性者，认为c-met蛋白的表达情况可以作为判断胃癌预后的一个新指标。
, http://www.100md.com
本组病例研究发现c-met蛋白表达与大肠癌的浸润深度有关，侵及浆膜的c-met蛋白阳性表达率明显高于未侵及浆膜者，说明c-met蛋白参与了大肠癌的进展。淋巴结转移组c-met蛋白阳性表达率明显高于淋巴结未转移组，说明c-met蛋白可能参与了大肠癌的转移。这与Aˉjisaka等 [8] 的研究结果一致。我们用ki67指数对c-met在大肠癌中的增殖作用进行了评价，统计学分析显示，c-met阳性表达组ki67指数较高。说明c-met有促进大肠癌增殖的作用。1997年，Date等通过对重组HGF进行裂解发现了一种新的HGF拮抗剂，命名为NK4，NK4可以与c-met结合，竞争性完全抑制HGF/c-met系统的信号转导，从而抑制HGF所诱导的细胞增殖、运动和形态形成等，体外研究证实NK4可抑制HGF诱导的结肠癌细胞的运动和侵袭。这为大肠癌的辅助治疗提供了新的方法。
参考文献
1 Houlston R S.What could we do now:molecular pathology of colorectal cancer.J Clin Pathol Mol，2001，54:206-214.
, 百拇医药
2 李连第，鲁风珠，张思维，等.1990～1992中国恶性肿瘤死亡率流行分布情况分析.中华肿瘤杂志，1996，18(6):403-407.
3 Finlay IG，Meck D，Bruton F，et al.Growth rate of hepatic metastases in colorectal cancer.Br J Surg，1988，75:641-644.
4 Nakamura T，Matsumoto K，Kiritoshi A，et al.Induction of hepatocyte growthfactor in fibroblasts by tumor-derived factors affects invasive growth of tumorcells:in vitro analysis of tumor-stromal interactions.Cancer Res，1997，57:3305-3313.
, 百拇医药
5 Liu Y.The human hepatocyte growth factor receptor gene:complete structuralorganization and promoter characterization.Gene，1998，215(1):159-169.
6 Weidoer KM，Dicesare S，Sachs M，et al.Interaction between GabI and the c-met receptor tyrosine kinase is responsible for epithelial morphoˉgenesis.Nature，1996，38(6605):173-176.
7 庄小强，郑杰，林三仁，等.胃癌及癌前粘膜病变与c-met原癌基因表达的关系及预后研究.中华普通外科杂志，2002，17(2):107-109.
8 Ajisaka H，Nishimura G，Tsuneda A，et al.The expression of c-met/hepatocyte growth factor receptor in colorectal cancer.Nippon Shokakˉibyo Gakkai Zasshi，1998，95(7):750-754.
(收稿日期:2003-02-01)
作者单位:050000河北医科大学第二医院胃肠外科
(编辑晓 亮), http://www.100md.com(杜志坚 张玉印 蔡建辉)
关键词 大肠癌 免疫组化 c-met蛋白 ki67抗原
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-077X(2003)06-0489-02
Significance of c-met and ki67overexpression in colorectal cancer
, 百拇医药
Du Zhijian，Zhang Yuyin，Cai Jianhui
Department of Gastrointestinal Surgery of the Second Hospital of Hebei University，Shijiazhuang050000.
【Abstract】 Objective The aims of this study were to investigate the expression of c-met protein and ki67antigen in colorectal cancer and their relationship with clinicopathological factors.Methods The expression of c-met and ki67were studied by means of a specific and sensitive immunological assay.(S-P method).The results of the expression were correlated with clinicopathological factors.Results The positive expression rate of c-met in colorecˉtal cancer was75.0%(30/40).c-met positive expression had a correlation with the tissue differentiation，lymph node metastasis and Dukes stage.It had no correlation with age，sex，andthe size of the tumor.Conclusion The overˉexpression of c-met was correlated with the genesis of colorectal cancer，and its tissue differenation.The abnormal c-met protein had potential ability to promote proliferation.
, 百拇医药
Key words colorectal cancer immunohistochemistry c-me protein ki67antigen
大肠癌是消化道常见的恶性肿瘤之一，每年全世界约有50万人发病，在西方国家大肠癌死亡率仅次于肺癌和乳腺瘤，居恶性肿瘤死亡率第3位 [1] 。据1990～1992年中国1/10人口死因抽样调查结果 [1] 显示，中国大肠癌的年死亡率为5.30/10万。居恶性肿瘤死因第五位[2] 。近年来我国大肠癌发病率呈升高趋势。在临床就诊的大肠癌病人，大致分为两大类，约1/3病人在就诊时肿瘤已至晚期不能切除或有弥漫性转移，这类病人预后很差，平均生存期约7个月。另外2/3的病人能切除原发肿瘤。即使能行“根治性切除”，约50%的病人生存期不超过5年。大部分患者死于肝转移，但有证据表明，这些患者同时存在广泛的肝外转移 [1] 。研究表明 [3] ，许多大肠癌发生肝转移较早，但有些大肠癌并不发生转移，可能是一些分子机制决定了大肠癌是否发生转移。研究大肠癌发生、发展过程中的分子机制及其与临床病理的联系，对提高大肠癌的预后预测和采取更有效的治疗方法都有重要意义。
, http://www.100md.com
c-met原癌基因产物c-met蛋白是肝细胞生长因子受体，肝细胞生长因子和过度表达的c-met蛋白结合，在肿瘤的发生、进展和血管形成中都起着重要作用 [4] ki67是应用最广泛的增殖细胞标记之一，它的检测是评估人类各种组织增殖组分的可靠和简单的方法。
1 材料与方法
1.1 标本 所有大肠癌标本均选自河北医科大学附属第 二医院胃肠外科2000年5月～2001年7月手术切除原发性大肠癌标本共40例，其中男25例，女15例，男女比例1.67∶1，年龄28～82岁，平均年龄55.5岁，术前均未接受任何抗肿瘤治疗。手术后病理组织学类型为:管状腺癌20例、乳头状腺癌6例、粘液腺癌10例、印戒细胞癌4例。分化程度:中、高分化腺癌26例、低、未分化腺癌14例。有淋巴结转移13例，无淋巴结转移27例。按Dukes分期:A级12例、B级15例、C级13例。
1.2 免疫组织化学染色 采用链霉素亲生物素-过氧化物酶法(SP法)。c-met多克隆抗体、ki67和SP试剂盒为Santa Cruz公司产品。染色步骤如下:石蜡切片常规二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，PBS洗2min×3;3%H 2 O 2 10min;PBS洗2min×3;山羊血清封闭15min;一抗(1∶50)室温过夜;PBS洗2min×3;生物素标记二抗15min;PBS洗2min×3;加SP15min，PBS洗2min×3，DAB(中山公司)显色5～10min，自来水充分冲洗，苏木素复染;脱水、透明，封片。
, 百拇医药
1.3 对照 以PBS代替一抗做空白对照，用已知胃癌阳性切片做阳性对照。
1.4 结果判断 c-met在光镜下观片，结果以细胞膜出现棕黄色颗料为c-met蛋白染色阳性细胞，可伴有细胞浆着色。以同一切片阳性细胞≥30%同类病变细胞为阳性病例。ki67以细胞核出现棕黄色颗粒为阳性，随机选取10个高倍镜视野共计数1000个细胞，以ki67阳性细胞所占百分数，计做ki67指数。
1.5 统计学方法 计数资料用卡方检验，计量资料用t检验。用SPSS10.0统计软件处理。
2 结果
c-met蛋白在大肠癌中的表达部位在癌细胞的细胞膜特别是腺细胞的腔面膜上，在低分化腺癌呈弥漫分布，表达强度高于高分化腺癌。与临床病理的关系见表1。C-met阳性组ki67指数为35.59±4.57，c-met阴性表达ki67指数为26.7±1.90，两组比较差异有显著性(P<0.05)。
, 百拇医药
表1 c-met与临床病理的关系
3 讨论
c-met蛋白是由原癌基因c-met编码的一类蛋白质。c-met基因位于人类7号染色体长臂(7q31) [5] 。其成熟的c-met蛋白位于细胞膜上，是一种细胞膜受体，有α亚基和β亚基。β亚基有胞外区、跨膜区和胞内区。α亚基只有胞外部分，借助于二硫键附于β亚基上。α亚基和β亚基的胞外区是配体识别部位，而胞内部分具有酪氨酸激酶活性。c-met受体的配体是肝细胞生长因子(hepatocyte growth facˉtor，HGF)，也称为离散因子(scatter factor)。HGF和c-met结合导致受体自身磷酸化，增强了c-met酪氨酸激酶的活 性，导致多种底物蛋白的酪氨酸磷酸化。如磷脂酶Cr、P13-K、生长因子受体结合蛋白-1、生长因子受体结合蛋白-2和信号转导与转录因子-3等 [6] 。庄小强等 [7] 研究了169例经病理学检查证实的不同胃粘膜病变c-met蛋白表达情况，结果发现浅表性胃炎c-met蛋白表达率较低，而随着病变从肠化生→异型增生→癌变演变，阳性表达逐步升高，以进展期胃癌更显著，同时，胃粘膜增殖程度与c-met蛋白阳性表达强度密切关系分析，两者显著相关，表明c-met蛋白表达反映胃粘膜细胞的增殖状态并具有恶变倾向，同时50例胃癌术后5年随访，证实c-met蛋白阳性表达者生存率明显低于c-met蛋白表达阴性者，认为c-met蛋白的表达情况可以作为判断胃癌预后的一个新指标。
, http://www.100md.com
本组病例研究发现c-met蛋白表达与大肠癌的浸润深度有关，侵及浆膜的c-met蛋白阳性表达率明显高于未侵及浆膜者，说明c-met蛋白参与了大肠癌的进展。淋巴结转移组c-met蛋白阳性表达率明显高于淋巴结未转移组，说明c-met蛋白可能参与了大肠癌的转移。这与Aˉjisaka等 [8] 的研究结果一致。我们用ki67指数对c-met在大肠癌中的增殖作用进行了评价，统计学分析显示，c-met阳性表达组ki67指数较高。说明c-met有促进大肠癌增殖的作用。1997年，Date等通过对重组HGF进行裂解发现了一种新的HGF拮抗剂，命名为NK4，NK4可以与c-met结合，竞争性完全抑制HGF/c-met系统的信号转导，从而抑制HGF所诱导的细胞增殖、运动和形态形成等，体外研究证实NK4可抑制HGF诱导的结肠癌细胞的运动和侵袭。这为大肠癌的辅助治疗提供了新的方法。
参考文献
1 Houlston R S.What could we do now:molecular pathology of colorectal cancer.J Clin Pathol Mol，2001，54:206-214.
, 百拇医药
2 李连第，鲁风珠，张思维，等.1990～1992中国恶性肿瘤死亡率流行分布情况分析.中华肿瘤杂志，1996，18(6):403-407.
3 Finlay IG，Meck D，Bruton F，et al.Growth rate of hepatic metastases in colorectal cancer.Br J Surg，1988，75:641-644.
4 Nakamura T，Matsumoto K，Kiritoshi A，et al.Induction of hepatocyte growthfactor in fibroblasts by tumor-derived factors affects invasive growth of tumorcells:in vitro analysis of tumor-stromal interactions.Cancer Res，1997，57:3305-3313.
, 百拇医药
5 Liu Y.The human hepatocyte growth factor receptor gene:complete structuralorganization and promoter characterization.Gene，1998，215(1):159-169.
6 Weidoer KM，Dicesare S，Sachs M，et al.Interaction between GabI and the c-met receptor tyrosine kinase is responsible for epithelial morphoˉgenesis.Nature，1996，38(6605):173-176.
7 庄小强，郑杰，林三仁，等.胃癌及癌前粘膜病变与c-met原癌基因表达的关系及预后研究.中华普通外科杂志，2002，17(2):107-109.
8 Ajisaka H，Nishimura G，Tsuneda A，et al.The expression of c-met/hepatocyte growth factor receptor in colorectal cancer.Nippon Shokakˉibyo Gakkai Zasshi，1998，95(7):750-754.
(收稿日期:2003-02-01)
作者单位:050000河北医科大学第二医院胃肠外科
(编辑晓 亮), http://www.100md.com(杜志坚 张玉印 蔡建辉)