复合型完全脱蛋白骨修复骨缺损的实验研究
【摘要】 目的 探讨复合型完全脱蛋白骨修复骨缺损的成骨作用。方法 用复合型完全脱蛋白骨(CFDB)来修复兔桡骨缺损，以自体髂骨移植和空白缺损为对照，术后4、8、12、24周取材，通过X线摄片和不脱钙硬组织切片检测，评价复合型完全脱蛋白骨的成骨作用。结果 X线摄片可见4周时材料密度较高;8周时材料与宿主骨交界处模糊;12周时材料边缘部分区域密度接近宿主骨;24周时缺损区域密度更接近宿主骨，但仍存有一些高密度影。经组织学形态观察可见4周和8周时新骨贴附材料生长;以后新骨增多;材料随着时间的推移逐渐降解吸收;24周时成骨量明显增多，仍可见部分残余材料。结论 CFDB可用于骨缺损的修复。
关键词 复合型完全脱蛋白骨 骨缺损 成骨作用
【文献标识码】 A 【文章编号】 1726-7587(2004)02-0100-02
Experimental study of repairing bone defects with composite fully deproteinised bone
, http://www.100md.com
Li Yanlin，Han Rui，Li Linzhi，et al.
The First Affiliated Hospital of Kunming Medical College，Yunnan650032.
【Abstract】 Objective To evaluate the osteogenesis of composite fully deproteinised bone in repairing bone defects.Methods Composite fully deproteinised bone(CFDB)was implanted into the radius bone defects of rabbits，autogenous iliac bone graft and empty defect were used as control.The specimens were examined after4weeks，8weeks，12weeks，24weeks;the osteogenesis was evaluated through X-ray radiograph and undecalcified solid tissue histology examination.Results The border between the material and host’s bone was distinct after4weeks，the borˉder between the material and host’s bone was blurred after8weeks，and the densityof some parts of the edge of the material was similar to radius after12weeks，the density of defect area was much similar to the host bone;there was a little high density shadow after24weeks by radiograph.Bone callus grew toward defect area and new bone formed adhesive to the material after4weeks and8weeks，more new bone formed with time，and the material were absorbed and degraded following withtime，the quantity of bone formation was much more by histomorphology observation，but there was a little residue material.Conclusion CFDB could be used to repair bone defect.
, http://www.100md.com
Key words composite fully deproteinised bone bone defect osteogenesis
采用一系列理化技术制备的复合型完全脱蛋白骨的抗原性弱，其结构和组成类似人体骨组织，具有良好的生物相容性，我们曾在复合型完全脱蛋白骨的细胞相容性研究的基础上复合成骨细胞的研究表明，其可用于成骨细胞的支架材料 [1，2] ，为进一步了解复合型完全脱蛋白骨修复骨缺损的能力，本研究采用复合型完全脱蛋白骨单纯植入来修复骨缺损。
1 材料与方法
1.1 植入材料的准备 按文献报道的方法 [1] 制得复合型完全脱蛋白骨(CFDB)，并制成10cm×4cm×3mm大小，分别放入75%的酒精中消毒备用。
1.2 实验动物 健康日本大耳白兔36只(昆明医学院动物科提供)，体重2～3kg，雌雄不限，随机分为A、B、C组，每组12只，其中A组植入CFDB材料，B组植入自体髂骨，C组为空白对照组。
, http://www.100md.com
1.3 手术方法 用3%戊巴比妥钠(1ml/mg)于兔耳缘静脉麻醉后，局部除毛，将兔固定于动物手术台上，常规消毒铺 巾，自体骨移植组先取髂骨后放入无菌弯盘中备用，于双前肢桡侧中段作2cm长皮肤纵切口，显露桡骨，用骨锯于中段截骨10mm，制成10mm节段性骨缺损，止血后各组分别植入材料或自体骨，空白对照组不植入材料或自体骨，缝合切口。术后予青霉素(40万U)肌注预防感染，术毕分笼饲养。各组分别于术后4、8、12、24周处死并作相关检查。
1.4 观测方法
1.4.1 一般观察 观察动物的饮食、活动情况和伤口愈合情况，处死后移植材料与宿主骨的关系。
1.4.2 X线摄片 分别于术后4周、8周、12周、24周处死3只动物，取出双侧尺、桡骨后立即摄X线片，了解移植材料的成骨程度。
1.4.3 不脱钙硬组织切片检测 摄X线片后立即用骨锯在距缺损两端0.5cm处截骨，将标本放入10%的甲醛溶液中低温避光固定3天，后将标本冲洗、脱水、渗透后，使用塑料包埋法进行包埋，包埋块使用切片机(LEIKA SP1600，德国莱卡公司)沿桡骨干纵轴修片，修至可见缺损两端与宿主骨交界处，然后使用硬组织切片机(LEICA SP2600，德国莱卡公司)连续切片，厚度为5μm，置于60℃水浴锅中展片，铬矾明胶载玻片捞片，塑料薄膜覆盖，50℃烤箱中风干，2天后进行甲苯胺蓝染色。在光学显微镜下观察组织形态，记录组织形态特点。
, 百拇医药
2 结果
2.1 一般观察 术后各组动物进食及活动正常，切口无红肿、渗液等炎性反应，切口Ⅰ期愈合。
2.2 标本大体观察 4周时可见CFDB材料大部分完整，部分与宿主骨疏松结合，自体骨与宿主骨端紧密结合;8周和12周时可见CFDB材料表面部分失去完整性，自体骨与宿主骨端形成骨性愈合，外形接近桡骨，24周可见CFDB材料破碎凹陷，材料与宿主骨部分融合，骨缺损中部仍见有残余材料，植入物大部分被新骨替代，周围与宿主骨形成牢固的骨性结合，自体骨移植部位外形与桡骨完全相同;空白对照组各阶段均可见缺损为纤维组织填充。
2.3 X线片检测结果 CFDB材料在植入后4周，材料密度较宿主骨密度高，材料与宿主骨分界清楚;8周材料与宿主骨分界模糊;12周时材料边缘部分密度接近桡骨，材料中央部呈高密度影;24周时缺损区域密度更接近桡骨，仍有一些高密度影;自体骨组在4周时植骨与宿主骨分界模糊，8周形成髓腔，12周时完成髓腔改建，24周时植骨部位与宿主骨一致;空白对照组术后随着时间的推移，均可见缺损，未见骨连接或髓腔再通，而缺损两端髓腔逐渐变尖、封闭并硬化(图1，图2，图3)。
, 百拇医药
2.4 组织学切片观察 CFDB材料植入后4周，可见纤维组织和血管长入三种材料内部，充填于材料的孔隙内，有软骨性和骨性骨痂由缺损区域长入;8周时可见新生骨组织从缺损两端贴附材料向缺损内部长入，缺损边缘部分可见散在的新生骨组织贴附材料生长，材料部分降解吸收;12周时，材料降解吸收增多，新骨组织贴附材料生长，出现骨组织与材料交错的三明治现象;24周时，仍可见残留一些材料，缺损中贴附材料生长的新骨形成较前有所增加;材料在各个阶段均可见多核巨噬细胞浸润，并见破骨细胞参与髓腔改建，未见明显淋巴细胞浸润。自体骨组4周可见植骨与宿主骨两端形成软骨或骨性连接，未见多核巨细胞及淋巴细胞浸润;8周时植骨与宿主骨形成骨性连接，缺损区域髓腔再通;12周时髓腔改建完成，髓腔再通;24周时植骨部位与宿主骨结构没有差别。空白对照组各阶段均为纤维组织填充缺损，未形成骨性愈合(图4，图5，图6)。
3 讨论
3.1 CFDB材料修复节段性骨缺损的机理探讨 CFDB材料是经一系列理化方法处理后制备而得，皆不含有活性细胞成分，没有成骨活性。我们曾将其植入兔肌袋内，无任何新骨生成 [3] ，在本实验中，CFDB材料植入后，宿主骨由缺损两端逐渐长入，材料逐渐降解吸收，随着植入时间的延长，新骨逐渐对材料爬行替代，进而对骨缺损进行修复，可见CFDB材料在修复骨缺损时，材料只发挥支架作用，仅通过骨传导作用而成骨，而整个修复过程主要包括新骨形成、材料降解和骨髓腔的重建。其中异种骨衍生材料的降解主要 是由多核巨噬细胞有吞噬吸收来完成，骨髓腔的重建主要由破骨细胞来完成。Lassus等 [4] 认为多核巨噬细胞骨吸收作用，一些研究表明，骨颗粒、羟基磷灰石或钙磷陶瓷在体内或体外均可诱导巨噬细胞浸润[5] ，本研究发现CFDB材料在植入体内后，有较多的多核巨噬细胞浸润，可见多核巨噬细胞对CFDB材料的吸收发挥了作用。这样，随着材料逐渐吸收而降解的同时，两端的新骨逐渐贴附材料长入，进而修复骨缺损。在空白对照组中，因缺损处没有支架材料，仅见纤维组织长入，故无法完成缺损的修复，可见移植材料所发挥的传导成骨作用对缺损的修复是十分必要的。
, 百拇医药
3.2 CFDB材料修复节段性骨缺损效果的评价 CFDB材料由猪肋骨制备，具有良好的生物相容性，为松质骨与皮质骨混合的结构，材料的皮质骨部分发挥支撑作用，松质骨部分具有相互交通的网状空间结构，有利于血管和纤维组织长入，支持贴附性成骨。本研究通过各项检测表明CFDB材料对骨缺损具有一定的修复作用，但不如自体骨修复效果好，其主要原因是该材料不含有活性细胞成分，没有成骨活性，仅通过骨传导作用而成骨。我们曾在复合型完全脱蛋白骨的细胞相容性研究的基础上复合成骨细胞的研究表明其可用于成骨细胞的支架材料[1，2] ，这说明可将其与成骨细胞或成骨活性因子复合，可望提高其成骨能力。
3.3 CFDB材料的应用展望 本研究表明CFDB材料可用于骨缺损的修复，在骨缺损的修复中发挥传导成骨作用，我们以往的研究还表明它具有天然的网状孔隙系统，解决了人工合成支架材料的孔隙率、孔隙交通、孔径大小等方面仿生制作的难题，其结构及组成类似人体骨组织，符合骨修复的生理要求，具有良好的生物相容性及传导成骨作用，可用于骨组织工程的支架材料 [2] 。且CFDB材料来源丰富、制作要求低、难度小、费用低，具有人工合成材料难以相比的优点，它的研制为骨移植材料的仿生制备提供一条简便、快速、低廉的研究途径，但目前CFDB材料的处理方法尚不完善，尚处在起步阶段，对其制备及性能控制还待进一步研究，但相信随着生化技术、免疫学、材料学及组织工程学等学科的发展，CFDB材料的研制将取得极大成功，并会在骨缺损修复的应用中发挥重要的作用。(本文图片见封三)
, 百拇医药
参考文献
1 李彦林，杨志明，韩睿，等.复合型完全脱蛋白骨的细胞相容性研究.中国骨伤，2002，15(10):597-599.
2 李彦林，杨志明，韩睿，等.复合型完全脱蛋白骨复合成骨细胞体内成骨的研究.骨与关节损伤杂志，2001，16(6):431-433.
3 杨志明，李彦林，解慧琪，等.生物衍生骨支架材料的组织相容性研究.中华整形外科杂志，2002，18(1):6-8.
4 Lassus J，Salo J，Jiranek WA，et al.Macrophage activation results in bone resorption.Clin Orthop，1998，352:7-15.
5 Xia ZD，Zhu TB，Du JY，et al.Macrophages in degradation of collagen/hydroxylapatite(CHA)，beta-tricalcium phosphate ceramics(TCP)arˉtificial bone graft.An in vivo study.ChinMed J(Engl)，1994，107(11):845-849.
(收稿日期:2003-10-17)
ˇ 基金项目:云南省自然科学基金资助项目(2000C0010R)
作者单位:650032昆明医学院第一附属医院骨科
(编辑小 川), 百拇医药(李彦林 韩 睿 李林芝 王永年 曾才铭 赵晓霞)
关键词 复合型完全脱蛋白骨 骨缺损 成骨作用
【文献标识码】 A 【文章编号】 1726-7587(2004)02-0100-02
Experimental study of repairing bone defects with composite fully deproteinised bone
, http://www.100md.com
Li Yanlin，Han Rui，Li Linzhi，et al.
The First Affiliated Hospital of Kunming Medical College，Yunnan650032.
【Abstract】 Objective To evaluate the osteogenesis of composite fully deproteinised bone in repairing bone defects.Methods Composite fully deproteinised bone(CFDB)was implanted into the radius bone defects of rabbits，autogenous iliac bone graft and empty defect were used as control.The specimens were examined after4weeks，8weeks，12weeks，24weeks;the osteogenesis was evaluated through X-ray radiograph and undecalcified solid tissue histology examination.Results The border between the material and host’s bone was distinct after4weeks，the borˉder between the material and host’s bone was blurred after8weeks，and the densityof some parts of the edge of the material was similar to radius after12weeks，the density of defect area was much similar to the host bone;there was a little high density shadow after24weeks by radiograph.Bone callus grew toward defect area and new bone formed adhesive to the material after4weeks and8weeks，more new bone formed with time，and the material were absorbed and degraded following withtime，the quantity of bone formation was much more by histomorphology observation，but there was a little residue material.Conclusion CFDB could be used to repair bone defect.
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Key words composite fully deproteinised bone bone defect osteogenesis
采用一系列理化技术制备的复合型完全脱蛋白骨的抗原性弱，其结构和组成类似人体骨组织，具有良好的生物相容性，我们曾在复合型完全脱蛋白骨的细胞相容性研究的基础上复合成骨细胞的研究表明，其可用于成骨细胞的支架材料 [1，2] ，为进一步了解复合型完全脱蛋白骨修复骨缺损的能力，本研究采用复合型完全脱蛋白骨单纯植入来修复骨缺损。
1 材料与方法
1.1 植入材料的准备 按文献报道的方法 [1] 制得复合型完全脱蛋白骨(CFDB)，并制成10cm×4cm×3mm大小，分别放入75%的酒精中消毒备用。
1.2 实验动物 健康日本大耳白兔36只(昆明医学院动物科提供)，体重2～3kg，雌雄不限，随机分为A、B、C组，每组12只，其中A组植入CFDB材料，B组植入自体髂骨，C组为空白对照组。
, http://www.100md.com
1.3 手术方法 用3%戊巴比妥钠(1ml/mg)于兔耳缘静脉麻醉后，局部除毛，将兔固定于动物手术台上，常规消毒铺 巾，自体骨移植组先取髂骨后放入无菌弯盘中备用，于双前肢桡侧中段作2cm长皮肤纵切口，显露桡骨，用骨锯于中段截骨10mm，制成10mm节段性骨缺损，止血后各组分别植入材料或自体骨，空白对照组不植入材料或自体骨，缝合切口。术后予青霉素(40万U)肌注预防感染，术毕分笼饲养。各组分别于术后4、8、12、24周处死并作相关检查。
1.4 观测方法
1.4.1 一般观察 观察动物的饮食、活动情况和伤口愈合情况，处死后移植材料与宿主骨的关系。
1.4.2 X线摄片 分别于术后4周、8周、12周、24周处死3只动物，取出双侧尺、桡骨后立即摄X线片，了解移植材料的成骨程度。
1.4.3 不脱钙硬组织切片检测 摄X线片后立即用骨锯在距缺损两端0.5cm处截骨，将标本放入10%的甲醛溶液中低温避光固定3天，后将标本冲洗、脱水、渗透后，使用塑料包埋法进行包埋，包埋块使用切片机(LEIKA SP1600，德国莱卡公司)沿桡骨干纵轴修片，修至可见缺损两端与宿主骨交界处，然后使用硬组织切片机(LEICA SP2600，德国莱卡公司)连续切片，厚度为5μm，置于60℃水浴锅中展片，铬矾明胶载玻片捞片，塑料薄膜覆盖，50℃烤箱中风干，2天后进行甲苯胺蓝染色。在光学显微镜下观察组织形态，记录组织形态特点。
, 百拇医药
2 结果
2.1 一般观察 术后各组动物进食及活动正常，切口无红肿、渗液等炎性反应，切口Ⅰ期愈合。
2.2 标本大体观察 4周时可见CFDB材料大部分完整，部分与宿主骨疏松结合，自体骨与宿主骨端紧密结合;8周和12周时可见CFDB材料表面部分失去完整性，自体骨与宿主骨端形成骨性愈合，外形接近桡骨，24周可见CFDB材料破碎凹陷，材料与宿主骨部分融合，骨缺损中部仍见有残余材料，植入物大部分被新骨替代，周围与宿主骨形成牢固的骨性结合，自体骨移植部位外形与桡骨完全相同;空白对照组各阶段均可见缺损为纤维组织填充。
2.3 X线片检测结果 CFDB材料在植入后4周，材料密度较宿主骨密度高，材料与宿主骨分界清楚;8周材料与宿主骨分界模糊;12周时材料边缘部分密度接近桡骨，材料中央部呈高密度影;24周时缺损区域密度更接近桡骨，仍有一些高密度影;自体骨组在4周时植骨与宿主骨分界模糊，8周形成髓腔，12周时完成髓腔改建，24周时植骨部位与宿主骨一致;空白对照组术后随着时间的推移，均可见缺损，未见骨连接或髓腔再通，而缺损两端髓腔逐渐变尖、封闭并硬化(图1，图2，图3)。
, 百拇医药
2.4 组织学切片观察 CFDB材料植入后4周，可见纤维组织和血管长入三种材料内部，充填于材料的孔隙内，有软骨性和骨性骨痂由缺损区域长入;8周时可见新生骨组织从缺损两端贴附材料向缺损内部长入，缺损边缘部分可见散在的新生骨组织贴附材料生长，材料部分降解吸收;12周时，材料降解吸收增多，新骨组织贴附材料生长，出现骨组织与材料交错的三明治现象;24周时，仍可见残留一些材料，缺损中贴附材料生长的新骨形成较前有所增加;材料在各个阶段均可见多核巨噬细胞浸润，并见破骨细胞参与髓腔改建，未见明显淋巴细胞浸润。自体骨组4周可见植骨与宿主骨两端形成软骨或骨性连接，未见多核巨细胞及淋巴细胞浸润;8周时植骨与宿主骨形成骨性连接，缺损区域髓腔再通;12周时髓腔改建完成，髓腔再通;24周时植骨部位与宿主骨结构没有差别。空白对照组各阶段均为纤维组织填充缺损，未形成骨性愈合(图4，图5，图6)。
3 讨论
3.1 CFDB材料修复节段性骨缺损的机理探讨 CFDB材料是经一系列理化方法处理后制备而得，皆不含有活性细胞成分，没有成骨活性。我们曾将其植入兔肌袋内，无任何新骨生成 [3] ，在本实验中，CFDB材料植入后，宿主骨由缺损两端逐渐长入，材料逐渐降解吸收，随着植入时间的延长，新骨逐渐对材料爬行替代，进而对骨缺损进行修复，可见CFDB材料在修复骨缺损时，材料只发挥支架作用，仅通过骨传导作用而成骨，而整个修复过程主要包括新骨形成、材料降解和骨髓腔的重建。其中异种骨衍生材料的降解主要 是由多核巨噬细胞有吞噬吸收来完成，骨髓腔的重建主要由破骨细胞来完成。Lassus等 [4] 认为多核巨噬细胞骨吸收作用，一些研究表明，骨颗粒、羟基磷灰石或钙磷陶瓷在体内或体外均可诱导巨噬细胞浸润[5] ，本研究发现CFDB材料在植入体内后，有较多的多核巨噬细胞浸润，可见多核巨噬细胞对CFDB材料的吸收发挥了作用。这样，随着材料逐渐吸收而降解的同时，两端的新骨逐渐贴附材料长入，进而修复骨缺损。在空白对照组中，因缺损处没有支架材料，仅见纤维组织长入，故无法完成缺损的修复，可见移植材料所发挥的传导成骨作用对缺损的修复是十分必要的。
, 百拇医药
3.2 CFDB材料修复节段性骨缺损效果的评价 CFDB材料由猪肋骨制备，具有良好的生物相容性，为松质骨与皮质骨混合的结构，材料的皮质骨部分发挥支撑作用，松质骨部分具有相互交通的网状空间结构，有利于血管和纤维组织长入，支持贴附性成骨。本研究通过各项检测表明CFDB材料对骨缺损具有一定的修复作用，但不如自体骨修复效果好，其主要原因是该材料不含有活性细胞成分，没有成骨活性，仅通过骨传导作用而成骨。我们曾在复合型完全脱蛋白骨的细胞相容性研究的基础上复合成骨细胞的研究表明其可用于成骨细胞的支架材料[1，2] ，这说明可将其与成骨细胞或成骨活性因子复合，可望提高其成骨能力。
3.3 CFDB材料的应用展望 本研究表明CFDB材料可用于骨缺损的修复，在骨缺损的修复中发挥传导成骨作用，我们以往的研究还表明它具有天然的网状孔隙系统，解决了人工合成支架材料的孔隙率、孔隙交通、孔径大小等方面仿生制作的难题，其结构及组成类似人体骨组织，符合骨修复的生理要求，具有良好的生物相容性及传导成骨作用，可用于骨组织工程的支架材料 [2] 。且CFDB材料来源丰富、制作要求低、难度小、费用低，具有人工合成材料难以相比的优点，它的研制为骨移植材料的仿生制备提供一条简便、快速、低廉的研究途径，但目前CFDB材料的处理方法尚不完善，尚处在起步阶段，对其制备及性能控制还待进一步研究，但相信随着生化技术、免疫学、材料学及组织工程学等学科的发展，CFDB材料的研制将取得极大成功，并会在骨缺损修复的应用中发挥重要的作用。(本文图片见封三)
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参考文献
1 李彦林，杨志明，韩睿，等.复合型完全脱蛋白骨的细胞相容性研究.中国骨伤，2002，15(10):597-599.
2 李彦林，杨志明，韩睿，等.复合型完全脱蛋白骨复合成骨细胞体内成骨的研究.骨与关节损伤杂志，2001，16(6):431-433.
3 杨志明，李彦林，解慧琪，等.生物衍生骨支架材料的组织相容性研究.中华整形外科杂志，2002，18(1):6-8.
4 Lassus J，Salo J，Jiranek WA，et al.Macrophage activation results in bone resorption.Clin Orthop，1998，352:7-15.
5 Xia ZD，Zhu TB，Du JY，et al.Macrophages in degradation of collagen/hydroxylapatite(CHA)，beta-tricalcium phosphate ceramics(TCP)arˉtificial bone graft.An in vivo study.ChinMed J(Engl)，1994，107(11):845-849.
(收稿日期:2003-10-17)
ˇ 基金项目:云南省自然科学基金资助项目(2000C0010R)
作者单位:650032昆明医学院第一附属医院骨科
(编辑小 川), 百拇医药(李彦林 韩 睿 李林芝 王永年 曾才铭 赵晓霞)