不育男子精液中抗精子抗体与精子凋亡的相关性研究
【摘要】 目的 探讨不育男子精液中抗精子抗体与精子凋亡的关系。方法 应用流式细胞术(FCM)检测30例正常生育组与50例不育男子精液中抗精子抗体和精子凋亡的情况。结果 生育组和不育组间抗精子抗体(ASA)阳性检出率、精子凋亡率(PAS)分别为3.33%、34.0%和4.12±1.33%、19.31±5.67%，两者间差异有显著性(P<0.01)，且精子凋亡率与抗精子抗体阳性检出率呈正相关。结论 精子凋亡与男性不育有着十分密切的关系，检测精子凋亡为临床评估男性生育力提供了新方法。
关键词 抗精子抗体(ASA) 精子凋亡(PAS)
【文献标识码】 B 【文章编号】 1680-077X(2003)06-0503-02
细胞凋亡(apoptosis，AP)，即程序化细胞死亡，是多细胞有机体为调控机体发育、维持内环境稳定、由基因控制的细胞主动死亡过程。通过细胞凋亡，清除体内多余的衰老细胞，以维持细胞在数量、形态和功能上的平衡。研究表明细胞凋亡的失控与许多疾病的发生有关 [1～3] 。本文运用FITC-Annenix V/PI荧光染色结合流式细胞术(flow cytomeˉtry，FCM)检测生育组与不育组男子精液中抗精子抗体与精子凋亡的情况，探讨抗精子抗体与精子凋亡的关系，以建立一种评估男性生育力的新方法。
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1 材料和方法
1.1 研究对象 (1)生育组:已生有一子或一女的健康男子30例，年龄24～35岁，平均28.3岁。(2)不育组:原发性或继发性不育男子50例，不育期3～10年，年龄25～35岁，平均27.8岁。
1.2 材料 异硫氰酸荧光素(FITC)标记的Annenix V细胞凋亡试剂(美国Becton Dickinson公司)。孵育缓冲剂:10mmol/L HEPES，pH7.4，140mmol/L NaCl，2.5mmol/L CaCl 2 ，PBS液:8g/L NaCl，0.2g/L KCl，1.44g/L Na 2 HPO 4 ·7H 2 O，0.24g/L KH 2 PO 4 ·H 2O，pH7.2。流式细胞仪(FCM，型号:EPICS-XL，USA)。
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1.3 方法
1.3.1 精液标本的收集 禁欲3～5天，手淫法收集全部精液于无菌玻璃容器中，置37℃恒温箱中待液化后，1500rpm离心，分离精子、精浆，重复2次，将分离的精子、精浆冻存在-80℃冰箱内备用。
1.3.2 抗精子抗体测定 ELISA间接法以1∶20稀释待检精浆100μl加入96孔微量反应板，37℃，1h后，PBS洗涤3min×3次后，加入1∶1000HRP-羊抗人IgG100μl，37℃，40min，PBS洗涤3min×3次后，每孔加入OPD-H 2 O 2 显色剂100μl，15min，用2M H 2 SO 4 终止反应。以DG-3022A型酶联免疫检测仪，492nm波长测定OD值，以阴性对照OD值X±3D确定为阳性。
1.3.3 精子凋亡的检测 将精子标本置冰水中复温，用冷 PBS液稀释精子悬液，取1×10 6 个精子于试管内，加PBS液洗涤，离心，去上清，重复一次，用孵育缓冲液1ml重悬浮，取100μl放入试管中，加入FITC-Annenix V10μl和PI0.3μg染色，室温下避光静置15min后加400μl孵育缓冲液，用FCM检测，阴性对照组孵育缓冲液中不加钙离子。
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1.3.4 统计学处理 采用SPSS10.0统计软件包进行t检验、q检验及相关分析。
2 结果
生育组与不育组ASA阳性检出率、PAS的比较，见表1。
表1 生育组与不育组ASA阳性检出率、PAS的比较
统计学分析表明:不育组与生育组间抗精子抗体阳性检出率、精了凋亡率差异存在显著性(P<0.01)，且抗精子抗体阳性率与精子凋亡率呈正相关。
3 讨论
精子凋亡与其他细胞凋亡一样都是通过多种生理病理因子参与由凋亡基因启动的过程，细胞凋亡的失控可引起许多疾病的发生。近年来的研究发现，精子凋亡与男性不育有着密切的关系 [4～6] 。由于男性生殖道的感染、损伤、精索静脉曲张、内分泌疾病等因素影响，可直接或间接地造成睾丸及其附属腺体受损、内环境紊乱、生精障碍等，影响精子的质量，并可能导致精子凋亡的增加。实验结果表明，生育组精子PAS明显低于不育组，两者间差异有显著性(P<0.01)。不育男子精子凋亡增加的可能原因:生殖系统损伤、感染时可刺激生精细胞、巨噬细胞产生一些细胞因子，如TNF、IL-1、IL-6等，它们均可以诱导精子凋亡的增加。吞噬细胞增多，在吞噬异物时，转移单电子的还原型辅酶氧化酶含量增加，产生一系列的活性氧物质(ROS)。巨噬细胞分泌的TNF-α亦能诱导ROS合成。过量的ROS可引起精子膜上的多聚不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，损伤精子膜的脂质双分子结构，导致精子膜流动性及通透性的变化。ROS还可使精子线粒体内、外膜上的不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，使膜的脂质排列松散，内膜嵴减少，使ATP合成降低。此外ROS还可引起精子核的DNA发生断裂，这些均可能导致精子凋亡的增加。此外，生殖道损伤、感染可引起机体自身免疫产生抗精子抗体，抗精子抗体通过细胞调理和补体介导而损伤精子，可导致精子凋亡增加。用FCM检测精子凋亡，具有快速、准确、客观、可靠等优点，且能进行多参数相关分析，具有广泛的应用前景。用FCM检测精液中精子凋亡，可作为评估精子功能及男性生育力的一个指标。
, 百拇医药
参考文献
1 Oosterhuis GJK，Mulder AB，Kalsbeek-Batenburg E，et al.Measuring apoptosis in human spermatozoa:a biological assay for semen quality.Fertil Steril，2000，74(2):245-250.
2 Ochsendorf FR.Infections in the male genital tract and reactive oxygen species.Hum Reprod Update，1999，5(5):399-420.
3 姜泊，谭晓华，许岸高.细胞凋亡基础与临床，北京:人民军医出版社，1999，280-292.
4 徐晨，王一飞.沙眼衣原体与不育不孕.男性学杂志，1994，8(3):180-182.
, 百拇医药
5 Dousset B，Hussenet F.Cytolines in the human semen.A new approach to male fertility.Presse Med，1997，26(1):24-29.
6 Baccetti B，Collodel G，Piombni P，et al.Apoptosis in human ejaculated sperms cells.J Submicrosc Cytol Pathol，1996，28(4):587-596.
(收稿日期:2003-04-25)
作者单位:215007苏州大学基础医学系
(编辑一 坤), 百拇医药(王晨)
关键词 抗精子抗体(ASA) 精子凋亡(PAS)
【文献标识码】 B 【文章编号】 1680-077X(2003)06-0503-02
细胞凋亡(apoptosis，AP)，即程序化细胞死亡，是多细胞有机体为调控机体发育、维持内环境稳定、由基因控制的细胞主动死亡过程。通过细胞凋亡，清除体内多余的衰老细胞，以维持细胞在数量、形态和功能上的平衡。研究表明细胞凋亡的失控与许多疾病的发生有关 [1～3] 。本文运用FITC-Annenix V/PI荧光染色结合流式细胞术(flow cytomeˉtry，FCM)检测生育组与不育组男子精液中抗精子抗体与精子凋亡的情况，探讨抗精子抗体与精子凋亡的关系，以建立一种评估男性生育力的新方法。
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1 材料和方法
1.1 研究对象 (1)生育组:已生有一子或一女的健康男子30例，年龄24～35岁，平均28.3岁。(2)不育组:原发性或继发性不育男子50例，不育期3～10年，年龄25～35岁，平均27.8岁。
1.2 材料 异硫氰酸荧光素(FITC)标记的Annenix V细胞凋亡试剂(美国Becton Dickinson公司)。孵育缓冲剂:10mmol/L HEPES，pH7.4，140mmol/L NaCl，2.5mmol/L CaCl 2 ，PBS液:8g/L NaCl，0.2g/L KCl，1.44g/L Na 2 HPO 4 ·7H 2 O，0.24g/L KH 2 PO 4 ·H 2O，pH7.2。流式细胞仪(FCM，型号:EPICS-XL，USA)。
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1.3 方法
1.3.1 精液标本的收集 禁欲3～5天，手淫法收集全部精液于无菌玻璃容器中，置37℃恒温箱中待液化后，1500rpm离心，分离精子、精浆，重复2次，将分离的精子、精浆冻存在-80℃冰箱内备用。
1.3.2 抗精子抗体测定 ELISA间接法以1∶20稀释待检精浆100μl加入96孔微量反应板，37℃，1h后，PBS洗涤3min×3次后，加入1∶1000HRP-羊抗人IgG100μl，37℃，40min，PBS洗涤3min×3次后，每孔加入OPD-H 2 O 2 显色剂100μl，15min，用2M H 2 SO 4 终止反应。以DG-3022A型酶联免疫检测仪，492nm波长测定OD值，以阴性对照OD值X±3D确定为阳性。
1.3.3 精子凋亡的检测 将精子标本置冰水中复温，用冷 PBS液稀释精子悬液，取1×10 6 个精子于试管内，加PBS液洗涤，离心，去上清，重复一次，用孵育缓冲液1ml重悬浮，取100μl放入试管中，加入FITC-Annenix V10μl和PI0.3μg染色，室温下避光静置15min后加400μl孵育缓冲液，用FCM检测，阴性对照组孵育缓冲液中不加钙离子。
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1.3.4 统计学处理 采用SPSS10.0统计软件包进行t检验、q检验及相关分析。
2 结果
生育组与不育组ASA阳性检出率、PAS的比较，见表1。
表1 生育组与不育组ASA阳性检出率、PAS的比较
统计学分析表明:不育组与生育组间抗精子抗体阳性检出率、精了凋亡率差异存在显著性(P<0.01)，且抗精子抗体阳性率与精子凋亡率呈正相关。
3 讨论
精子凋亡与其他细胞凋亡一样都是通过多种生理病理因子参与由凋亡基因启动的过程，细胞凋亡的失控可引起许多疾病的发生。近年来的研究发现，精子凋亡与男性不育有着密切的关系 [4～6] 。由于男性生殖道的感染、损伤、精索静脉曲张、内分泌疾病等因素影响，可直接或间接地造成睾丸及其附属腺体受损、内环境紊乱、生精障碍等，影响精子的质量，并可能导致精子凋亡的增加。实验结果表明，生育组精子PAS明显低于不育组，两者间差异有显著性(P<0.01)。不育男子精子凋亡增加的可能原因:生殖系统损伤、感染时可刺激生精细胞、巨噬细胞产生一些细胞因子，如TNF、IL-1、IL-6等，它们均可以诱导精子凋亡的增加。吞噬细胞增多，在吞噬异物时，转移单电子的还原型辅酶氧化酶含量增加，产生一系列的活性氧物质(ROS)。巨噬细胞分泌的TNF-α亦能诱导ROS合成。过量的ROS可引起精子膜上的多聚不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，损伤精子膜的脂质双分子结构，导致精子膜流动性及通透性的变化。ROS还可使精子线粒体内、外膜上的不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，使膜的脂质排列松散，内膜嵴减少，使ATP合成降低。此外ROS还可引起精子核的DNA发生断裂，这些均可能导致精子凋亡的增加。此外，生殖道损伤、感染可引起机体自身免疫产生抗精子抗体，抗精子抗体通过细胞调理和补体介导而损伤精子，可导致精子凋亡增加。用FCM检测精子凋亡，具有快速、准确、客观、可靠等优点，且能进行多参数相关分析，具有广泛的应用前景。用FCM检测精液中精子凋亡，可作为评估精子功能及男性生育力的一个指标。
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参考文献
1 Oosterhuis GJK，Mulder AB，Kalsbeek-Batenburg E，et al.Measuring apoptosis in human spermatozoa:a biological assay for semen quality.Fertil Steril，2000，74(2):245-250.
2 Ochsendorf FR.Infections in the male genital tract and reactive oxygen species.Hum Reprod Update，1999，5(5):399-420.
3 姜泊，谭晓华，许岸高.细胞凋亡基础与临床，北京:人民军医出版社，1999，280-292.
4 徐晨，王一飞.沙眼衣原体与不育不孕.男性学杂志，1994，8(3):180-182.
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5 Dousset B，Hussenet F.Cytolines in the human semen.A new approach to male fertility.Presse Med，1997，26(1):24-29.
6 Baccetti B，Collodel G，Piombni P，et al.Apoptosis in human ejaculated sperms cells.J Submicrosc Cytol Pathol，1996，28(4):587-596.
(收稿日期:2003-04-25)
作者单位:215007苏州大学基础医学系
(编辑一 坤), 百拇医药(王晨)