p70S6激酶在Hella细胞的不同细胞周期中表达的研究
【摘要】 目的 研究p70S6激酶信号通路在Hella细胞的不同细胞周期中的表达。方法用Western印迹方法对同步化的Hella细胞不同细胞周期的p70S6激酶(p70S6K)的α1、α2、β1、β2不同亚型的表达进行了研究。结果 免疫印迹的结果显示M期p70S6K的α1、α2、β1、β2均有增加。结论 p70S6K很可能在Hella细胞的生长中起重要的调节作用。
关键词 Hella细胞 p70S6激酶 细胞周期
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)18-2664-02
The study on expression of p70S6kinase in Hella cells in
different cell cycle phases
, 百拇医药
Liu Yi，Bao Yang，Yan Xiulin，et al.
College of Stomatology，China Medical University，Shengyang110000.
【Abstract】 Objective The aim of this study is to observe the expression of p70S6kinase(p70S6K)signal pathway in Hella Cells in different cell cycle phases.Methods p70S6kinase were examined by means of Western-blot test.Results In Mphase，the expression ofα1，α2，β1，β2isoforms of p70S6K increased obviously.Conclusion Higher expression of p70S6k might play an important role on regulation of Hella cells growth.
, 百拇医药
Key words Hella cells p70S6K cell cycle phases
细胞生长和细胞增殖是不同但又相关的两个过程，它们在器官的生长、组织的形成及肿瘤的生长中起着重要的作用。最新研究表明，雷帕霉素靶(mammalian target of raˉpamycin，mTOR)蛋白是细胞生长的中心调控因子，p70S6激酶(P70S6K)是mTOR的直接底物，并且是调控蛋白质合成的关键信号分子 [1] ，因此p70S6K很可能在Hella细胞的生长中起重要的调控作用。而目前对这方面的研究报道还没有。本研究的目的在于利用同步化的Hella细胞，观察在不同细胞周期中，mTOR的底物p70S6K的表达有何区别，从而阐明p70S6K与细胞周期间的关系。
1 材料与方法
1.1 细胞来源 Hella细胞由日本神户大学生物信号研究中心提供。
, 百拇医药
1.2 主要试剂 抗p70S6K抗体、HRP标记羊抗鼠IgG、ECL试剂盒购于Santa Cruz。
1.3 Hella细胞的同步化培养 按细胞培养及同步化方法，依时间顺序得到各期细胞:S、G 2 、M 1 、M 2 、G 1 。
1.4 Western印迹分析 上清用10%SDS-PAGE分离，然后转移到硝酸纤维素膜上，用5%milk封闭，TOR NSDH(1∶600)、抗p70S6K(1∶600)抗体、抗4EBP1(1∶600)抗体作为一抗，Anti-mouse IgG作为二抗，用ECL系统染色。
2 结果
图1为p70S6K的α1、α2的Western结果:S6K的α1、α2在M 1 、M 2 期的表达增加，而在G 2 期，可见α2的表达也有所增加。图2为p70S6K的β1、β2的Western结果:β1、β2在免疫印迹的结果显示在M 1 、M 2 期表达增加。这与以往的RT-PCR研究结果相吻合。
, 百拇医药
Fig.1 Western blot analysis of p70S6K using antibody against p70S6K(α 1 、α 2 )1:G1phase;S phase;G2phase;M1phase;M2phase Fig.2 Western blot analysis of p70S6K using antibody against p70S6K(β 1 、β 2 )1:G1phase;S phase;G2phase;M1phase;M2phase
3 讨论
有关细胞生长的研究从国际上看还刚刚起步。普遍认为细胞生长与增殖是既相关而又有区别的两个概念。mTOR的发现为人们研究细胞的生长提供了一个非常重要的领域。1999年Science报道果蝇的p70S6K的基因敲除后，身体发育仅为原来大小的一半，而细胞数目却不少 [2] ，大量研究表明，mTOR在细胞生长中起重要的调控作用。mTOR具有丝/苏氨酸蛋白激酶的活性，它的底物包括p70S6K(简称S6K)及4EBP1。S6K是核糖体40S小亚基S6K蛋白激酶。它可通过磷酸化S6蛋白激酶对5′Top(5′terminal oligopyrimidine tract)mRNAs的翻译起始起上调作用 [3] 。5′Top mRNAs约占细胞总mRNAs的20%，它是蛋白质生物合成的基础，它的主要翻译产物包括核糖体蛋白(rp)、延长因子EF1α、EF2和polyA结合蛋白等。我们的研究表明在不同细胞周期中，免疫印迹的结果显示M期p70S6K的α1、α2、β1、β2均有增加。p70S6K很可能在Hella细胞的生长中起重要的调控作用。这可能与这时候的蛋白质合成增加有关。
, http://www.100md.com
mTOR的底物S6K有四种亚型α1、α2、β1、β2。S6K又是蛋白质合成的正调控信号，因而在上述的共同调控下，促进了细胞的分裂，促进了蛋白质的合成。另有研究表明，mTOR可使S6K的第412位苏氨酸残基磷酸化，被磷酸化的S6K的活性可上升100倍左右 [4] ，这种活性的上升必然促进蛋白质的生物合成 [5] 。mTOR同样也可使4EBP1的第37位及第46位苏氨酸残基磷酸化，来对其进行调控。但目前关于mTOR与细胞周期间的研究尚不甚多。如前所述，若用mTOR的抑制剂作用到培养细胞时，可使其停滞于G 1 期，因而有关mTOR及其底物与细胞周期间关系的研究还是一个今后值得重视的领域。此外，从前也有有关抑制细 胞生长的相关基因的报道，如TGFB的myostatin基因，缺失该基因的小鼠的骨骼肌为正常的3倍。牛的该基因突变也可导致肌肉异变 [6] ，也值得研究。
总之有关细胞生长及细胞增殖间的深入研究，以及p70S6K与细胞生长及肿瘤间关系的深入研究，都将会有力地促进p70S6K与细胞生长等理论的认识。
, 百拇医药
参考文献
1 Schmelzle T，Hall MN.TOR，a Central Controller of Cell Growth.Cell，2000，103:253-262.
2 Jacques Montagne，Mary J.Stewart，Hugo Stocker.Drosophila S6kinase:A regulator of cell size.Science，1999，285:2126-2129.
3 fferies H B J，Fumagalli S，Dennis PB，et al.Rapamycin suppresses5’TOP mRNA translation inhibition of p70S6K.EMBO J，1997，16:3693-3704.
4 Shuji Isotani，Kenta Hara，Kazuyoshi Yonezawa.Immunopurified mamˉmalian target of rapamycin phosphorylates and activates p70S6kinase a in vitro.J Biol Chem，1997，274:34493-34498.
, 百拇医药
5 Garber K.Rapamycin’s resurrection:a newway to target the cancer cell cycle.J Natl Cancer Inst，2001，93(20):1517-1519.
6 Ian Conlon，Martin Raff.Size control in animal development.Cell，1999，96:235-244.
基金项目:国家973基础研究重点课题资助(No.1999055900-2)
作者单位:110002中国医科大学口腔医学院正畸科
辽宁省鞍山市任雅秋诊所
中国医科大学基础医学院病理教研室(生物化学教研室)
(编辑秋 实), 百拇医药(刘 奕 包扬 阎秀林 任雅秋 方长春 李建华 于秉)
关键词 Hella细胞 p70S6激酶 细胞周期
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)18-2664-02
The study on expression of p70S6kinase in Hella cells in
different cell cycle phases
, 百拇医药
Liu Yi，Bao Yang，Yan Xiulin，et al.
College of Stomatology，China Medical University，Shengyang110000.
【Abstract】 Objective The aim of this study is to observe the expression of p70S6kinase(p70S6K)signal pathway in Hella Cells in different cell cycle phases.Methods p70S6kinase were examined by means of Western-blot test.Results In Mphase，the expression ofα1，α2，β1，β2isoforms of p70S6K increased obviously.Conclusion Higher expression of p70S6k might play an important role on regulation of Hella cells growth.
, 百拇医药
Key words Hella cells p70S6K cell cycle phases
细胞生长和细胞增殖是不同但又相关的两个过程，它们在器官的生长、组织的形成及肿瘤的生长中起着重要的作用。最新研究表明，雷帕霉素靶(mammalian target of raˉpamycin，mTOR)蛋白是细胞生长的中心调控因子，p70S6激酶(P70S6K)是mTOR的直接底物，并且是调控蛋白质合成的关键信号分子 [1] ，因此p70S6K很可能在Hella细胞的生长中起重要的调控作用。而目前对这方面的研究报道还没有。本研究的目的在于利用同步化的Hella细胞，观察在不同细胞周期中，mTOR的底物p70S6K的表达有何区别，从而阐明p70S6K与细胞周期间的关系。
1 材料与方法
1.1 细胞来源 Hella细胞由日本神户大学生物信号研究中心提供。
, 百拇医药
1.2 主要试剂 抗p70S6K抗体、HRP标记羊抗鼠IgG、ECL试剂盒购于Santa Cruz。
1.3 Hella细胞的同步化培养 按细胞培养及同步化方法，依时间顺序得到各期细胞:S、G 2 、M 1 、M 2 、G 1 。
1.4 Western印迹分析 上清用10%SDS-PAGE分离，然后转移到硝酸纤维素膜上，用5%milk封闭，TOR NSDH(1∶600)、抗p70S6K(1∶600)抗体、抗4EBP1(1∶600)抗体作为一抗，Anti-mouse IgG作为二抗，用ECL系统染色。
2 结果
图1为p70S6K的α1、α2的Western结果:S6K的α1、α2在M 1 、M 2 期的表达增加，而在G 2 期，可见α2的表达也有所增加。图2为p70S6K的β1、β2的Western结果:β1、β2在免疫印迹的结果显示在M 1 、M 2 期表达增加。这与以往的RT-PCR研究结果相吻合。
, 百拇医药
Fig.1 Western blot analysis of p70S6K using antibody against p70S6K(α 1 、α 2 )1:G1phase;S phase;G2phase;M1phase;M2phase Fig.2 Western blot analysis of p70S6K using antibody against p70S6K(β 1 、β 2 )1:G1phase;S phase;G2phase;M1phase;M2phase
3 讨论
有关细胞生长的研究从国际上看还刚刚起步。普遍认为细胞生长与增殖是既相关而又有区别的两个概念。mTOR的发现为人们研究细胞的生长提供了一个非常重要的领域。1999年Science报道果蝇的p70S6K的基因敲除后，身体发育仅为原来大小的一半，而细胞数目却不少 [2] ，大量研究表明，mTOR在细胞生长中起重要的调控作用。mTOR具有丝/苏氨酸蛋白激酶的活性，它的底物包括p70S6K(简称S6K)及4EBP1。S6K是核糖体40S小亚基S6K蛋白激酶。它可通过磷酸化S6蛋白激酶对5′Top(5′terminal oligopyrimidine tract)mRNAs的翻译起始起上调作用 [3] 。5′Top mRNAs约占细胞总mRNAs的20%，它是蛋白质生物合成的基础，它的主要翻译产物包括核糖体蛋白(rp)、延长因子EF1α、EF2和polyA结合蛋白等。我们的研究表明在不同细胞周期中，免疫印迹的结果显示M期p70S6K的α1、α2、β1、β2均有增加。p70S6K很可能在Hella细胞的生长中起重要的调控作用。这可能与这时候的蛋白质合成增加有关。
, http://www.100md.com
mTOR的底物S6K有四种亚型α1、α2、β1、β2。S6K又是蛋白质合成的正调控信号，因而在上述的共同调控下，促进了细胞的分裂，促进了蛋白质的合成。另有研究表明，mTOR可使S6K的第412位苏氨酸残基磷酸化，被磷酸化的S6K的活性可上升100倍左右 [4] ，这种活性的上升必然促进蛋白质的生物合成 [5] 。mTOR同样也可使4EBP1的第37位及第46位苏氨酸残基磷酸化，来对其进行调控。但目前关于mTOR与细胞周期间的研究尚不甚多。如前所述，若用mTOR的抑制剂作用到培养细胞时，可使其停滞于G 1 期，因而有关mTOR及其底物与细胞周期间关系的研究还是一个今后值得重视的领域。此外，从前也有有关抑制细 胞生长的相关基因的报道，如TGFB的myostatin基因，缺失该基因的小鼠的骨骼肌为正常的3倍。牛的该基因突变也可导致肌肉异变 [6] ，也值得研究。
总之有关细胞生长及细胞增殖间的深入研究，以及p70S6K与细胞生长及肿瘤间关系的深入研究，都将会有力地促进p70S6K与细胞生长等理论的认识。
, 百拇医药
参考文献
1 Schmelzle T，Hall MN.TOR，a Central Controller of Cell Growth.Cell，2000，103:253-262.
2 Jacques Montagne，Mary J.Stewart，Hugo Stocker.Drosophila S6kinase:A regulator of cell size.Science，1999，285:2126-2129.
3 fferies H B J，Fumagalli S，Dennis PB，et al.Rapamycin suppresses5’TOP mRNA translation inhibition of p70S6K.EMBO J，1997，16:3693-3704.
4 Shuji Isotani，Kenta Hara，Kazuyoshi Yonezawa.Immunopurified mamˉmalian target of rapamycin phosphorylates and activates p70S6kinase a in vitro.J Biol Chem，1997，274:34493-34498.
, 百拇医药
5 Garber K.Rapamycin’s resurrection:a newway to target the cancer cell cycle.J Natl Cancer Inst，2001，93(20):1517-1519.
6 Ian Conlon，Martin Raff.Size control in animal development.Cell，1999，96:235-244.
基金项目:国家973基础研究重点课题资助(No.1999055900-2)
作者单位:110002中国医科大学口腔医学院正畸科
辽宁省鞍山市任雅秋诊所
中国医科大学基础医学院病理教研室(生物化学教研室)
(编辑秋 实), 百拇医药(刘 奕 包扬 阎秀林 任雅秋 方长春 李建华 于秉)