植物抗真菌病害基因工程的策略及研究进展
作者：冯 洁 来源：中国农业科学院植物保护研究所
摘 要:本文从植物抗病基因与防御反应基因等几方面讨论了植物抗真菌病害基因工程的策略，并介绍了目前国内外的研究现状及主要进展。
关键词:基因工程 真菌病害
1 植物抗病基因与防御反应基因的概念
从广义上讲植物抗病基因(resistance gene)与防御反应基因(defense gene)都是在植物抗病反应过程中起抵抗病菌侵染及扩展的有关基因。
所谓抗病基因就是Flor经典遗传学基因对基因(gene-for-gene)假说中所指的与病原菌无毒基因相对应的，存在于植物特定品种中，在植物生长的整个周期或其中某个阶段为组成型表达的植物抗病品种所特有的一类基因。
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植物防御反应基因的特点是，在抗病和感病品种中均存在，其差异主要体现在基因表达的时间、空间及产物含量的不同，为组成型或诱导型表达的一类基因。
2 植物抗病基因的克隆
植物抗病基因工程所首选的最佳目的基因是来自植物自身的抗病基因。但由于植物的基因组十分庞大，加之人们对抗病基因产物的功能了解甚少，以及克隆手段的限制，直到1992年以后，才出现成功克隆抗病基因的报道，使植物抗病基因工程出现了质的飞跃。克隆策略的改进是取得突破的关键，其中应用最广泛的克隆技术就是以图谱为基础的克隆法(map-based cloning)和转座子示踪技术(transposon gene tagging)。到目前为止，国际上成功克隆的植物抗病基因只有屈指可数的14例[1]，其中抗真菌病害的有9例：如玉米的Hm1基因(抗Helminthosporium maydis)；番茄的I2基因(抗Fusarium oxysporium f.sp.lycopersicon)、Cf-2、Cf-4、Cf-5和Cf-9基因(分别抗Cladosporium fulvum的avr2、avr4、avr5和avr9)；亚麻的L6和M基因(抗Melampsora lini)；拟南芥的RPP5基因(抗Peronospora parasitica)。除此之外，mRNA差别显示法(mRNA differential display)以及基因组相减技术(genomic substraction)也具有广泛的应用前景，但目前还未见到有成功的报道。我们利用具体外抑菌活性的纯化蛋白制备抗体，已从马铃薯中获得了编码组成型表达的抗病蛋白基因的cDNA克隆的部分序列，也是国内外唯一利用纯化的抗病蛋白克隆植物抗病基因的报道。
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真菌抗性基因被分离出来后，将其转入其他植物的品种或种中，从而使植株获得抗真菌病原物某一特定小种的能力，但转基因植物对真菌病原的其他小种仍是敏感的，因此，这类小种-品种特异互作的抗性基因在育种上的应用受到很大的限制，因为转单一抗性基因品种的大规模种植可能会诱发新致病小种的出现，导致品种抗病性的丧失。
目前一种非特异抗性的双组分系统的应用有望从根本上解决转基因植物抗性单一的问题。de Wit[2]1992年提出将抗病基因与互补的病菌无毒基因结合在一起并置于受病菌诱导的启动子之下的“双组分系统”，如在具Cf-9基因的番茄中导入真菌的avr9基因，并加上PR蛋白、植保素或其他非专化性诱导的启动子，当植物受不同病原菌或激发子诱导后就会产生广谱抗性。利用这种策略可有望获得具有低特异性和广泛适用性的转基因植物。
3 植物防御反应基因的克隆
3.1 病程相关蛋白(pathogenesis-related protein，PR)基因的克隆
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植物产生的PR蛋白通常具有几丁质酶或β-1，3葡聚糖酶活性，属内源水解酶，位于植物的液泡内，可分别催化几丁质和β-1，3葡聚糖的水解反应，而这两类物质又是真菌细胞壁的主要组分，在植物体内并不含此类成分。因此PR蛋白在植物抗真菌病害过程中所发挥的作用很早就引起了人们的重视，是目前研究报道最多的一类抗真菌蛋白。现已在许多植物中发现了PR蛋白的存在，并从烟草、马铃薯、水稻、菜豆等作物中克隆了编码PR蛋白的基因。1990年Brogilie等报道了转菜豆几丁质酶基因烟草可增强植株对立枯丝核菌和枯萎菌的抗性。1993年Alexander 等获得了组成型表达的转PR-1a基因烟草，转基因烟草对黑胫病和霜霉病均表现高水平抗性[3]。类似研究同样在马铃薯、番茄、甜菜及莴苣等作物中也获得了成功。
3.2 核糖体灭活蛋白(RIPs)基因的克隆
在自然界存在一大类蛋白质，它们可以催化性地破坏真核细胞的核糖体，从而阻止细胞的蛋白质合成，这类蛋白统称为核糖体灭活蛋白(RIPs)。大多数RIPs由单一肽链组成，分子量一般在30KD左右，真菌的核蛋白也可作为RIPs的作用靶子。纯化的离体大麦RIP就具有抑制真菌病原生长的作用，RIPs与几丁质酶、β-1，3葡聚糖酶及细胞壁降解酶协同作用时，可大大增强抑菌效果。1992年Logemann等利用大麦RIP抗真菌的特性，培育出了抗立枯丝核菌的转基因烟草[4]。利用转RIPs基因防治真菌病害拓宽了人们的研究思路，今后也将是一个很有发展前途的领域。
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3.3 植物凝集素蛋白基因的克隆
除了PR蛋白这类水解酶以外，我们将不具催化功能、但可与几丁质特异性结合的蛋白或糖蛋白称为植物凝集素(lectins)。由于植物凝集素具有识别功能，并与植物抵御病菌侵入有关，尤其是凝集素在抵抗植物真菌性病害中所发挥的作用，很早就引起了人们的重视。1964年Jones 等就发现草藤(Vicia cracca)凝集素可抑制土壤中分解种皮的微生物的生长。后经研究发现，除了豆科和禾本科植物中广泛存在凝集素以外，其他许多植物如雪花莲、荨麻、番茄、棉花、马铃薯、烟草、大蒜、洋葱等种子或根茎中也存在植物凝集素，并发现多数凝集素都含有一个由43个氨基酸组成的共同结构域。在橡胶树中发现的橡胶素(hevein)就是一种含43个氨基酸结构域的小分子的抗真菌蛋白。90年代以后，克隆植物凝集素蛋白编码基因的工作开始起步，1991～1997年Van Damme等[5]陆续从雪花莲、大蒜、洋葱等植物中获得了凝集素蛋白的cDNA克隆。目前，发掘新的植物凝集素，探索利用转凝集素基因植物防治真菌病害的新途径，已成为国内外生物技术工作者新的竞争焦点。
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3.4 植物抗病次生代谢关键酶基因的克隆
植物受病菌侵袭时体内合成的一类对病原物有一定抗性的化合物，称之为植保素(phytoalexin)，其抗性主要表现在抑制真菌孢子萌发和菌丝生长。现已报道有22个科的植物中存在植保素，据Ebel[6]统计，至少有150种植保素得到了分离和纯化。从化学结构上可分为酚类(phenolics)、类黄酮类(flavonoids)、异类黄酮(isoflavonoids)、芪类(stilbenes)、萜类(terpenes)、聚乙炔(polyacetylenes)等六类。通过基因工程手段导入植保素合成关键酶基因，提高植物体内植保素的合成水平，可以增强植物对病菌的抵抗能力。Hain等[7]1993年从葡萄中克隆了两个1，2-二苯乙烯(stilbene)合成酶基因，将其整合到烟草染色体上，获得了烟草抗性转基因植株，对灰霉病表现出明显的抗病性。此项研究证明，通过基因工程手段使外源植保素在其他植物--病原物系统中诱导合成，从而提高植物的抗病能力是切实可行的。
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4 真菌酶、毒素抑制剂基因的克隆
植物病原菌的毒素和降解酶是最重要的致病因子，如果植物能降解病原菌在致病过程中产生的毒素和酶，就能有效地抵抗病菌的侵染。因而人们开始尝试从产毒病原菌或其他微生物中分离并克隆降解毒素和酶的基因，并将其导入植物中，提高植物的抗病性。Ouchi等[9]1991年从克雷伯氏细菌(Klebsiella oxytoca)中分离到能降解尖孢镰刀菌产生的镰刀菌酸的基因，并已将其构建到质粒载体上，现正在向番茄中导入基因，如果能获得转降解镰刀菌酸基因的番茄，将有望减轻枯萎病的发生和为害。
多聚半乳糖醛酸酶(PG)是病原菌产生的植物细胞壁降解酶，在病菌致病过程中起着十分重要的作用。人们在双子叶植物中发现了一类能抑制多聚半乳糖醛酸酶活性的蛋白--PGIP(polygalacturonase inhibitor protein)，通过基因导入的方法，将PGIP基因整合到植物基因组中，使其组成型表达，也是提高植物抗病性的有效途径。目前，已经克隆到菜豆和梨的PGIP基因，现正在进行转基因植物防治真菌病害的研究。
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5 其他抗真菌蛋白基因的克隆
在有些微生物及昆虫中也存在抗真菌肽，它的开发利用也日益受到重视。例如巨大曲霉菌(Aspergillus giganteus)可合成一种由51个氨基酸组成的胞外蛋白质，对真菌的生长有一定的抑制作用。人们在昆虫天蚕的血淋巴中分离到一些小分子量的抗菌肽，国内已通过导入抗菌肽基因成功地获得了抗马铃薯细菌性青枯病的植株。将抗菌肽基因导入棉花后发现植株对黄萎病的抗性有所增强，目前正在对转基因植株进行鉴定和验证。
总之，随着基因工程研究的不断深入，人们防治植物真菌性病害的策略和手段也随之拓宽，除了开发植物自身的抗病基因以外，还可利用其他来源的基因为我所用，特别是“双组分系统”介导的基因工程策略的实施，将有效地调动植物的抗病潜力，是使植物获得持久抗病性的最佳途径。
参 考 文 献
Hammond-Kosack K E，Jones JDJ. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol， 1997，48：575～607
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De Wit PJGM. Annu Rev Phytopathol，1992，30：391～399
AlexanderD，Goodman R M，Gut-Rella M et al. Proc Natl Acad Sci USA， 1993，90：7327～7334
Logemann J，Jach G，Tommerup H et al. Bio/Technology，1992，10：305～312
Van Damme EJM，Barre A. Plant Molecular Biology，1996，31：657～668
Ebel J. Annu Rev Phytopathol，1986，24：235～264
Hain R，Reif H J，et al. Nature，1993，361：153～156
Ouchi S，Toyoda H，Katsuragi Y et al. J Cell Biochem，1991，Suppl.，15A：46～53, 百拇医药
摘 要:本文从植物抗病基因与防御反应基因等几方面讨论了植物抗真菌病害基因工程的策略，并介绍了目前国内外的研究现状及主要进展。
关键词:基因工程 真菌病害
1 植物抗病基因与防御反应基因的概念
从广义上讲植物抗病基因(resistance gene)与防御反应基因(defense gene)都是在植物抗病反应过程中起抵抗病菌侵染及扩展的有关基因。
所谓抗病基因就是Flor经典遗传学基因对基因(gene-for-gene)假说中所指的与病原菌无毒基因相对应的，存在于植物特定品种中，在植物生长的整个周期或其中某个阶段为组成型表达的植物抗病品种所特有的一类基因。
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植物防御反应基因的特点是，在抗病和感病品种中均存在，其差异主要体现在基因表达的时间、空间及产物含量的不同，为组成型或诱导型表达的一类基因。
2 植物抗病基因的克隆
植物抗病基因工程所首选的最佳目的基因是来自植物自身的抗病基因。但由于植物的基因组十分庞大，加之人们对抗病基因产物的功能了解甚少，以及克隆手段的限制，直到1992年以后，才出现成功克隆抗病基因的报道，使植物抗病基因工程出现了质的飞跃。克隆策略的改进是取得突破的关键，其中应用最广泛的克隆技术就是以图谱为基础的克隆法(map-based cloning)和转座子示踪技术(transposon gene tagging)。到目前为止，国际上成功克隆的植物抗病基因只有屈指可数的14例[1]，其中抗真菌病害的有9例：如玉米的Hm1基因(抗Helminthosporium maydis)；番茄的I2基因(抗Fusarium oxysporium f.sp.lycopersicon)、Cf-2、Cf-4、Cf-5和Cf-9基因(分别抗Cladosporium fulvum的avr2、avr4、avr5和avr9)；亚麻的L6和M基因(抗Melampsora lini)；拟南芥的RPP5基因(抗Peronospora parasitica)。除此之外，mRNA差别显示法(mRNA differential display)以及基因组相减技术(genomic substraction)也具有广泛的应用前景，但目前还未见到有成功的报道。我们利用具体外抑菌活性的纯化蛋白制备抗体，已从马铃薯中获得了编码组成型表达的抗病蛋白基因的cDNA克隆的部分序列，也是国内外唯一利用纯化的抗病蛋白克隆植物抗病基因的报道。
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真菌抗性基因被分离出来后，将其转入其他植物的品种或种中，从而使植株获得抗真菌病原物某一特定小种的能力，但转基因植物对真菌病原的其他小种仍是敏感的，因此，这类小种-品种特异互作的抗性基因在育种上的应用受到很大的限制，因为转单一抗性基因品种的大规模种植可能会诱发新致病小种的出现，导致品种抗病性的丧失。
目前一种非特异抗性的双组分系统的应用有望从根本上解决转基因植物抗性单一的问题。de Wit[2]1992年提出将抗病基因与互补的病菌无毒基因结合在一起并置于受病菌诱导的启动子之下的“双组分系统”，如在具Cf-9基因的番茄中导入真菌的avr9基因，并加上PR蛋白、植保素或其他非专化性诱导的启动子，当植物受不同病原菌或激发子诱导后就会产生广谱抗性。利用这种策略可有望获得具有低特异性和广泛适用性的转基因植物。
3 植物防御反应基因的克隆
3.1 病程相关蛋白(pathogenesis-related protein，PR)基因的克隆
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植物产生的PR蛋白通常具有几丁质酶或β-1，3葡聚糖酶活性，属内源水解酶，位于植物的液泡内，可分别催化几丁质和β-1，3葡聚糖的水解反应，而这两类物质又是真菌细胞壁的主要组分，在植物体内并不含此类成分。因此PR蛋白在植物抗真菌病害过程中所发挥的作用很早就引起了人们的重视，是目前研究报道最多的一类抗真菌蛋白。现已在许多植物中发现了PR蛋白的存在，并从烟草、马铃薯、水稻、菜豆等作物中克隆了编码PR蛋白的基因。1990年Brogilie等报道了转菜豆几丁质酶基因烟草可增强植株对立枯丝核菌和枯萎菌的抗性。1993年Alexander 等获得了组成型表达的转PR-1a基因烟草，转基因烟草对黑胫病和霜霉病均表现高水平抗性[3]。类似研究同样在马铃薯、番茄、甜菜及莴苣等作物中也获得了成功。
3.2 核糖体灭活蛋白(RIPs)基因的克隆
在自然界存在一大类蛋白质，它们可以催化性地破坏真核细胞的核糖体，从而阻止细胞的蛋白质合成，这类蛋白统称为核糖体灭活蛋白(RIPs)。大多数RIPs由单一肽链组成，分子量一般在30KD左右，真菌的核蛋白也可作为RIPs的作用靶子。纯化的离体大麦RIP就具有抑制真菌病原生长的作用，RIPs与几丁质酶、β-1，3葡聚糖酶及细胞壁降解酶协同作用时，可大大增强抑菌效果。1992年Logemann等利用大麦RIP抗真菌的特性，培育出了抗立枯丝核菌的转基因烟草[4]。利用转RIPs基因防治真菌病害拓宽了人们的研究思路，今后也将是一个很有发展前途的领域。
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3.3 植物凝集素蛋白基因的克隆
除了PR蛋白这类水解酶以外，我们将不具催化功能、但可与几丁质特异性结合的蛋白或糖蛋白称为植物凝集素(lectins)。由于植物凝集素具有识别功能，并与植物抵御病菌侵入有关，尤其是凝集素在抵抗植物真菌性病害中所发挥的作用，很早就引起了人们的重视。1964年Jones 等就发现草藤(Vicia cracca)凝集素可抑制土壤中分解种皮的微生物的生长。后经研究发现，除了豆科和禾本科植物中广泛存在凝集素以外，其他许多植物如雪花莲、荨麻、番茄、棉花、马铃薯、烟草、大蒜、洋葱等种子或根茎中也存在植物凝集素，并发现多数凝集素都含有一个由43个氨基酸组成的共同结构域。在橡胶树中发现的橡胶素(hevein)就是一种含43个氨基酸结构域的小分子的抗真菌蛋白。90年代以后，克隆植物凝集素蛋白编码基因的工作开始起步，1991～1997年Van Damme等[5]陆续从雪花莲、大蒜、洋葱等植物中获得了凝集素蛋白的cDNA克隆。目前，发掘新的植物凝集素，探索利用转凝集素基因植物防治真菌病害的新途径，已成为国内外生物技术工作者新的竞争焦点。
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3.4 植物抗病次生代谢关键酶基因的克隆
植物受病菌侵袭时体内合成的一类对病原物有一定抗性的化合物，称之为植保素(phytoalexin)，其抗性主要表现在抑制真菌孢子萌发和菌丝生长。现已报道有22个科的植物中存在植保素，据Ebel[6]统计，至少有150种植保素得到了分离和纯化。从化学结构上可分为酚类(phenolics)、类黄酮类(flavonoids)、异类黄酮(isoflavonoids)、芪类(stilbenes)、萜类(terpenes)、聚乙炔(polyacetylenes)等六类。通过基因工程手段导入植保素合成关键酶基因，提高植物体内植保素的合成水平，可以增强植物对病菌的抵抗能力。Hain等[7]1993年从葡萄中克隆了两个1，2-二苯乙烯(stilbene)合成酶基因，将其整合到烟草染色体上，获得了烟草抗性转基因植株，对灰霉病表现出明显的抗病性。此项研究证明，通过基因工程手段使外源植保素在其他植物--病原物系统中诱导合成，从而提高植物的抗病能力是切实可行的。
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4 真菌酶、毒素抑制剂基因的克隆
植物病原菌的毒素和降解酶是最重要的致病因子，如果植物能降解病原菌在致病过程中产生的毒素和酶，就能有效地抵抗病菌的侵染。因而人们开始尝试从产毒病原菌或其他微生物中分离并克隆降解毒素和酶的基因，并将其导入植物中，提高植物的抗病性。Ouchi等[9]1991年从克雷伯氏细菌(Klebsiella oxytoca)中分离到能降解尖孢镰刀菌产生的镰刀菌酸的基因，并已将其构建到质粒载体上，现正在向番茄中导入基因，如果能获得转降解镰刀菌酸基因的番茄，将有望减轻枯萎病的发生和为害。
多聚半乳糖醛酸酶(PG)是病原菌产生的植物细胞壁降解酶，在病菌致病过程中起着十分重要的作用。人们在双子叶植物中发现了一类能抑制多聚半乳糖醛酸酶活性的蛋白--PGIP(polygalacturonase inhibitor protein)，通过基因导入的方法，将PGIP基因整合到植物基因组中，使其组成型表达，也是提高植物抗病性的有效途径。目前，已经克隆到菜豆和梨的PGIP基因，现正在进行转基因植物防治真菌病害的研究。
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5 其他抗真菌蛋白基因的克隆
在有些微生物及昆虫中也存在抗真菌肽，它的开发利用也日益受到重视。例如巨大曲霉菌(Aspergillus giganteus)可合成一种由51个氨基酸组成的胞外蛋白质，对真菌的生长有一定的抑制作用。人们在昆虫天蚕的血淋巴中分离到一些小分子量的抗菌肽，国内已通过导入抗菌肽基因成功地获得了抗马铃薯细菌性青枯病的植株。将抗菌肽基因导入棉花后发现植株对黄萎病的抗性有所增强，目前正在对转基因植株进行鉴定和验证。
总之，随着基因工程研究的不断深入，人们防治植物真菌性病害的策略和手段也随之拓宽，除了开发植物自身的抗病基因以外，还可利用其他来源的基因为我所用，特别是“双组分系统”介导的基因工程策略的实施，将有效地调动植物的抗病潜力，是使植物获得持久抗病性的最佳途径。
参 考 文 献
Hammond-Kosack K E，Jones JDJ. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol， 1997，48：575～607
, http://www.100md.com
De Wit PJGM. Annu Rev Phytopathol，1992，30：391～399
AlexanderD，Goodman R M，Gut-Rella M et al. Proc Natl Acad Sci USA， 1993，90：7327～7334
Logemann J，Jach G，Tommerup H et al. Bio/Technology，1992，10：305～312
Van Damme EJM，Barre A. Plant Molecular Biology，1996，31：657～668
Ebel J. Annu Rev Phytopathol，1986，24：235～264
Hain R，Reif H J，et al. Nature，1993，361：153～156
Ouchi S，Toyoda H，Katsuragi Y et al. J Cell Biochem，1991，Suppl.，15A：46～53, 百拇医药