两种精液处理方式的回顾性分析
【摘要】 目的 回顾性分析2002年6月～12月我科以上游法和Pure Sperm(硅烷化硅胶悬浮液)梯度密度离心法处理的精液在IVF-ET中的应用情况。方法 45例丈夫精液密度20～40×10 6 /ml，a级精子比例<15%用Pure Sperm处理，其余用上游法处理。结果 Pure Sperm组处理前的精液密度，a级精子率及总活率明显低于上游组(P<0.01)，但处理后前组的密度高于后组(P<0.05)，a级精子比例及总活力差异无显著性(P>0.05);Pure Sperm梯度密度离心处理组的a级及总活动精子的回收率高于上游组(P<0.05);两组的女方年龄、获卵数、受精率、卵裂率、优胚率、妊娠率及流产率差异无显著性(P>0.05)。结论 Pure Sperm处理法与上游法都可以不同程度的提高精子的质量:上游法简便，成本低，但对精液的参数要求高;Pure Sperm处理组a级精子及总活动精子的回收率高(43.4%，24.2%)于上游组，处理后可获得足够量的优质精子，不影响IVF-ET的各项参数，是相对于稍差精液的较好处理方法。
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关键词 精液 上游 梯度密度离心
【文献标识码】 B 【文章编号】 1609-6614(2004)07-0651-03
在辅助生殖领域中，如何获得高质量的精子，是人们一直关注的问题，由此也产生了许多不同的精液处理方式。本文将对传统的上游法、Pure Sperm(硅烷化硅胶悬浮液)梯度密度离心法处理后的精液与IVF-ET中的各项参数的相关性进行回顾性分析，现报告如下。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 病人来源与分组 回顾分析我科2002年6～12月的224对不孕夫妇。男性的精液已在我院妇研室做过2～3次的精液分析，可行普通IVF-ET。其中男方取卵这次精液密度20～40×10 6 /ml，a级精子比例<15%者45例，用梯度密度离心处理，其余用常规上游法处理。
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1.1.2 试剂 精子处理液:Earel’s+10%SSS+青霉素(6μl/10ml)+链霉素(7.5μl/10ml)Earel’s，Sigma，E2888;SSS(serum substitutes supplement)，Irine;Pure sperm40/80，Spermbuffer，Nidacon labs，Cothenbury，Sweden.
1.2 方法
1.2.1 上游法 准备10ml处理液放入5%的CO 2 孵箱中平衡过夜。分析液化好的精液，记录精液参数，然后将其用巴氏管全部移到离心管内，加入1.5～2倍的精子处理液，轻轻吹打混匀后，用离心力150g离心8min，弃上清，加入2～3ml处理液，悬浮精子，再次离心，离心力100g，8min后，弃上清，留沉渣上1～2mm的洗液，轻轻弹松沉渣(密集的精子)，加入0.5～0.8ml的精子处理液，以45°角放入CO 2 孵箱中上游45min～1h。上游完吸上层0.3～0.5ml精子浮液备用，检查精子参数。
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1.2.2 梯度密度离心 试剂Pure Sperm40/80，先将2ml80%的Pure Sperm放入离心管底，轻轻的以1:1的形式在其上加2ml40%的Pure Sperm，最后将1.5～2ml的精液放在最上层;离心力300g，离心20min，弃上层精浆、40%与大部分的80%层Pure Sperm，然后用5ml Spermbuffer液混匀沉渣，离心力300g，离心10min，弃去上清，将收集到的精子制备成0.3～1ml左右的悬浮液，检查精液参数后放入CO 2 孵箱中备用。
1.2.3 精液参数分析 精液处理前后均按WHO的标准进 行常规分析。
1.2.4 授精方法 按常规，精液孵育4h左右，授精浓度1×10 6 /ml。
1.2.5 统计和分析 采用SPSS11.0软件进行统计和分析，检验采用t和X 2 检验。
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2 结果
见表1～3。
表1 上游处理组与梯度密度离心处理组的精液参数情况 (略)
由表1以看出处理前梯度密度离心组精液的密度、总活力及a级精子的比例都比上游组差，差异有极显著性，但处理后却发现，梯度密度离心组的密度优于上游组，差异有显著性，总活力及a级精子比例方面差异无显著性。
表2说明梯度密度离心法的回收率优于上游法。
表2 两种处理方法回收率比较 (略)
表3 两种方法处理组的IVF-ET各参数的比较 (略)
两种处理方法均可以显著提高精液的总活力及a级精子比例，梯度密度离心在总活动精子回收率及a级精子的获得方面优于上游法。相对于参数稍差者的精液来说，用Pure Sperm梯度密度离心处理后，可获得足够量的活动精子及a级精子，不会影响IVF-ET的结局。
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3 讨论
人类精液中除了精子外，还有许多其它成分，这些成分中有许多影响精子获能及顶体反应，从而影响精子的受精能力。报道较多的有以下几种:(1)白细胞:白细胞是人类精浆中产生活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)的主要物质，Sharma PK [1] 研究中报道，尽管WHO的检验手册中规定白细胞(WBC)<1×10 6 /ml，可以为正常，但他发现，只要可检测到WBC的存在，精浆中的ROS增加，抗活性氧能力下降(Total Antioidant Capcity，TAC)，精子也将受到不同程度的损害。(2)油脂(lipils):鼠的精浆中过多的油脂存在影响精子的活力，通过上游或梯度密度离心的方法处理精液，可使油脂浮在洗精液的表层，而达到去除的目的 [2] 。(3)不成熟精子:死亡精子均可产生ROS [3] ，影响精子的活力和存活率。尽可能的去除精浆及非精子成分的方法有许多，其中运用最广泛、最多的即为上游法和Percoll梯度密度离心，曾 有报道 [4] ，精浆的分离方面，上游法最有效，其次为两层Percoll。而且也有人研究发现 [5] ，用上游法和梯度密度离心法结合处理获得的活精子可以将精浆的HIV和HCV病毒减少到目前检测不到的水平。
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处理后的精子活力、质量及活动精子的精量与IVF-ET的各项参数十分相关，RhemreJp等人报道，洗后所有前向运动精子的计数(TPMC:Post-Wash)，可预测TFF(Total Fertilization Failure) [6] 但如果活动精子总数>20×10 6 /ml，则对于妊娠率的提高方面并无一个确切的阈值 [7] 。从这里可以看出，足够的高质量活动精子的获得是减少不利IVF-ET成功因素的一个办法，而对于一些临界少弱精患者，好的精液处理方式可以使他们洗后的精液参数达到普通IVF-ET的标准，避免ICSI治疗而减少费用。
国内外许多文献均报道 [8，9] ，用上游法或Porcoll梯度密度离心法处理精液都可使精子的各项参数达到显著性提高。上游法相对于梯度密度离心法，试剂成本低，但上游法对精液的量、总活动精子数和总活动力的要求比较高;Perˉcoll梯度密度离心法，则要求较宽，尤其适用于精液参数稍差患者。但是目前Percoll已不能应用于临床 [3] ，但它的替代品可用;Pure Sperm即为其中一种。Pure Sperm是一种硅烷化硅胶悬浮液。曾有报道，硅烷化硅胶悬浮液法总精子回收率优于Percoll，但活力方面差异无显著性。目前，国内有王氏管分离精子的报道 [4] ，认为王氏法可使精子的活动率、正常形态精子率、精子顶体的完整率得到显著提高，处理未成熟DNA精子有良好效果，但成本高，不易推广使用。
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基于以上分析及本研究都证明，上游法及硅烷化硅胶悬浮液(Pure Sperm)梯度离心方法回收率好，优质的活动精子获得率高，成本低，是目前辅助生殖领域中处理精液的良好方法。
参考文献
1 Sharma PK，Pasqualotto AE，Nelson DR，et al.Relationship between seminal white blood cell counts and oxidative stress in men treated at an infertility clinic.J androl，2001，22(4):575-583.
2 Tanphaichitr N，Zheng Y S，Kates M，et al.Cholesterol and phospholipid leves ofwashed and pertoll gradient entrifuged mouse sperm:presence of lipids possessing inhibitory effects on sperm motility.Mol Rprod Dev，1996，43(2):187-195.
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3 世界卫生组织编.人类精子及精子—宫颈粘液相互作用实验室 检验手册，第4版.北京:人民卫生出版社，2001，26-94.
4 Levay P F，Fourie F R，Bezuidenhout C，Koch A.Effectiveness of various sperm processing methods in removing seminal plasma from insemination media.Human-Reprod，1995，10(8):2056-2060.
5 Pasquier C，Daudom M Righil，Berges L，et al.Sperm washing and virus trans
mission in serodiscordant couples wishing to have children AIDS，2000，29:14(14):2093-2099.
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6 Rhemrv Jp，MenKveld R，RoseBoom.TJ.et al.The acrosome index radiˉcal buffer capacity and number of isolated progressively motile spermatoˉzoa predict IVF results.Human Reprod，2001，16(9):1885-1892.7 Williams RS.Alderman J:Predictors of success with the use of donor sperm.Am J Obstet Gynecol，2001，185(2):332-337.
8 Perez S M，Chan P J，Patton H C，et al.Silance coated silica particle colloid processing of human sperm.J Assist Reprod Genet，1997，14(7):388-393.
9 韦相才，田佩玲.王氏管精子优选法的应用及效果.广东医学，2000，21(5):375-376.
作者单位:510150广州市第二人民医院广州市妇产科研究所生殖助孕科
(收稿日期:2003-12-30)
(编辑 亦平), http://www.100md.com
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关键词 精液 上游 梯度密度离心
【文献标识码】 B 【文章编号】 1609-6614(2004)07-0651-03
在辅助生殖领域中，如何获得高质量的精子，是人们一直关注的问题，由此也产生了许多不同的精液处理方式。本文将对传统的上游法、Pure Sperm(硅烷化硅胶悬浮液)梯度密度离心法处理后的精液与IVF-ET中的各项参数的相关性进行回顾性分析，现报告如下。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 病人来源与分组 回顾分析我科2002年6～12月的224对不孕夫妇。男性的精液已在我院妇研室做过2～3次的精液分析，可行普通IVF-ET。其中男方取卵这次精液密度20～40×10 6 /ml，a级精子比例<15%者45例，用梯度密度离心处理，其余用常规上游法处理。
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1.1.2 试剂 精子处理液:Earel’s+10%SSS+青霉素(6μl/10ml)+链霉素(7.5μl/10ml)Earel’s，Sigma，E2888;SSS(serum substitutes supplement)，Irine;Pure sperm40/80，Spermbuffer，Nidacon labs，Cothenbury，Sweden.
1.2 方法
1.2.1 上游法 准备10ml处理液放入5%的CO 2 孵箱中平衡过夜。分析液化好的精液，记录精液参数，然后将其用巴氏管全部移到离心管内，加入1.5～2倍的精子处理液，轻轻吹打混匀后，用离心力150g离心8min，弃上清，加入2～3ml处理液，悬浮精子，再次离心，离心力100g，8min后，弃上清，留沉渣上1～2mm的洗液，轻轻弹松沉渣(密集的精子)，加入0.5～0.8ml的精子处理液，以45°角放入CO 2 孵箱中上游45min～1h。上游完吸上层0.3～0.5ml精子浮液备用，检查精子参数。
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1.2.2 梯度密度离心 试剂Pure Sperm40/80，先将2ml80%的Pure Sperm放入离心管底，轻轻的以1:1的形式在其上加2ml40%的Pure Sperm，最后将1.5～2ml的精液放在最上层;离心力300g，离心20min，弃上层精浆、40%与大部分的80%层Pure Sperm，然后用5ml Spermbuffer液混匀沉渣，离心力300g，离心10min，弃去上清，将收集到的精子制备成0.3～1ml左右的悬浮液，检查精液参数后放入CO 2 孵箱中备用。
1.2.3 精液参数分析 精液处理前后均按WHO的标准进 行常规分析。
1.2.4 授精方法 按常规，精液孵育4h左右，授精浓度1×10 6 /ml。
1.2.5 统计和分析 采用SPSS11.0软件进行统计和分析，检验采用t和X 2 检验。
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2 结果
见表1～3。
表1 上游处理组与梯度密度离心处理组的精液参数情况 (略)
由表1以看出处理前梯度密度离心组精液的密度、总活力及a级精子的比例都比上游组差，差异有极显著性，但处理后却发现，梯度密度离心组的密度优于上游组，差异有显著性，总活力及a级精子比例方面差异无显著性。
表2说明梯度密度离心法的回收率优于上游法。
表2 两种处理方法回收率比较 (略)
表3 两种方法处理组的IVF-ET各参数的比较 (略)
两种处理方法均可以显著提高精液的总活力及a级精子比例，梯度密度离心在总活动精子回收率及a级精子的获得方面优于上游法。相对于参数稍差者的精液来说，用Pure Sperm梯度密度离心处理后，可获得足够量的活动精子及a级精子，不会影响IVF-ET的结局。
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3 讨论
人类精液中除了精子外，还有许多其它成分，这些成分中有许多影响精子获能及顶体反应，从而影响精子的受精能力。报道较多的有以下几种:(1)白细胞:白细胞是人类精浆中产生活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)的主要物质，Sharma PK [1] 研究中报道，尽管WHO的检验手册中规定白细胞(WBC)<1×10 6 /ml，可以为正常，但他发现，只要可检测到WBC的存在，精浆中的ROS增加，抗活性氧能力下降(Total Antioidant Capcity，TAC)，精子也将受到不同程度的损害。(2)油脂(lipils):鼠的精浆中过多的油脂存在影响精子的活力，通过上游或梯度密度离心的方法处理精液，可使油脂浮在洗精液的表层，而达到去除的目的 [2] 。(3)不成熟精子:死亡精子均可产生ROS [3] ，影响精子的活力和存活率。尽可能的去除精浆及非精子成分的方法有许多，其中运用最广泛、最多的即为上游法和Percoll梯度密度离心，曾 有报道 [4] ，精浆的分离方面，上游法最有效，其次为两层Percoll。而且也有人研究发现 [5] ，用上游法和梯度密度离心法结合处理获得的活精子可以将精浆的HIV和HCV病毒减少到目前检测不到的水平。
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处理后的精子活力、质量及活动精子的精量与IVF-ET的各项参数十分相关，RhemreJp等人报道，洗后所有前向运动精子的计数(TPMC:Post-Wash)，可预测TFF(Total Fertilization Failure) [6] 但如果活动精子总数>20×10 6 /ml，则对于妊娠率的提高方面并无一个确切的阈值 [7] 。从这里可以看出，足够的高质量活动精子的获得是减少不利IVF-ET成功因素的一个办法，而对于一些临界少弱精患者，好的精液处理方式可以使他们洗后的精液参数达到普通IVF-ET的标准，避免ICSI治疗而减少费用。
国内外许多文献均报道 [8，9] ，用上游法或Porcoll梯度密度离心法处理精液都可使精子的各项参数达到显著性提高。上游法相对于梯度密度离心法，试剂成本低，但上游法对精液的量、总活动精子数和总活动力的要求比较高;Perˉcoll梯度密度离心法，则要求较宽，尤其适用于精液参数稍差患者。但是目前Percoll已不能应用于临床 [3] ，但它的替代品可用;Pure Sperm即为其中一种。Pure Sperm是一种硅烷化硅胶悬浮液。曾有报道，硅烷化硅胶悬浮液法总精子回收率优于Percoll，但活力方面差异无显著性。目前，国内有王氏管分离精子的报道 [4] ，认为王氏法可使精子的活动率、正常形态精子率、精子顶体的完整率得到显著提高，处理未成熟DNA精子有良好效果，但成本高，不易推广使用。
, http://www.100md.com
基于以上分析及本研究都证明，上游法及硅烷化硅胶悬浮液(Pure Sperm)梯度离心方法回收率好，优质的活动精子获得率高，成本低，是目前辅助生殖领域中处理精液的良好方法。
参考文献
1 Sharma PK，Pasqualotto AE，Nelson DR，et al.Relationship between seminal white blood cell counts and oxidative stress in men treated at an infertility clinic.J androl，2001，22(4):575-583.
2 Tanphaichitr N，Zheng Y S，Kates M，et al.Cholesterol and phospholipid leves ofwashed and pertoll gradient entrifuged mouse sperm:presence of lipids possessing inhibitory effects on sperm motility.Mol Rprod Dev，1996，43(2):187-195.
, http://www.100md.com
3 世界卫生组织编.人类精子及精子—宫颈粘液相互作用实验室 检验手册，第4版.北京:人民卫生出版社，2001，26-94.
4 Levay P F，Fourie F R，Bezuidenhout C，Koch A.Effectiveness of various sperm processing methods in removing seminal plasma from insemination media.Human-Reprod，1995，10(8):2056-2060.
5 Pasquier C，Daudom M Righil，Berges L，et al.Sperm washing and virus trans
mission in serodiscordant couples wishing to have children AIDS，2000，29:14(14):2093-2099.
, 百拇医药
6 Rhemrv Jp，MenKveld R，RoseBoom.TJ.et al.The acrosome index radiˉcal buffer capacity and number of isolated progressively motile spermatoˉzoa predict IVF results.Human Reprod，2001，16(9):1885-1892.7 Williams RS.Alderman J:Predictors of success with the use of donor sperm.Am J Obstet Gynecol，2001，185(2):332-337.
8 Perez S M，Chan P J，Patton H C，et al.Silance coated silica particle colloid processing of human sperm.J Assist Reprod Genet，1997，14(7):388-393.
9 韦相才，田佩玲.王氏管精子优选法的应用及效果.广东医学，2000，21(5):375-376.
作者单位:510150广州市第二人民医院广州市妇产科研究所生殖助孕科
(收稿日期:2003-12-30)
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