腺病毒载体疫苗免疫途径的研究(基金项目)
http://www.100md.com
基金项目:山东省科技发展计划项目(编号:013130104)
【摘要】 目的 研究腺病毒(Adenovirus，Ad)载体乙型肝炎病毒(Hapatitis B virus，HBV)疫苗免疫途径与小鼠产生抗体水平的关系。方法 将BALB/C小鼠(SPF)分为5组，每组10只，分别于鼻腔、皮下接种Ad HBV重组疫苗，用ELISA方法在免疫动物后35d、72d检测动脉血清抗体，与注射常规铝佐剂肽苗组和阴性对照组比较，探讨重组苗免疫途径与小鼠产生抗体水平的关系。结果 皮下注射Ad HBV组在35d、72d均不能测到抗体;鼻腔接种Ad HBV苗组在35d不能测到抗体，72d后在动物血清中测到抗体(终末效价为1/7040)，与注射铝佐剂苗(1/8420)相当。结论 鼻腔接种Ad HBV重组苗比注射有效。
关键词 腺病毒 载体 乙型肝炎/疫苗 动物/小鼠
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-6115(2004)05-0392-02
, http://www.100md.com
The research on inoculative approach
with adenovirus vector vaccines in mice
Li Yan，Yue Yingying，Zhang Fengli，et al.
Department of Microbiology，Institute of Basic
Medicine，Shandong Academy ofMedical Science，Jinan250062.
【Abstract】 Objective To investigate the relationship of inoculative approach and the level of specific antiˉbody induced by adenovirus(Ad)vector HBV vaccines in mice.Methods The mice were divided into5groups，each group had10mice.The Ad HBV vaccines were inoculated by nasal，subcutaneous tissue in every group respectively.The specific antibody was tested by ELISA in35d，72d and compared with the group injected with aluminium-adjuˉvanted vaccines，and discussed the relationship of inoculative approach and the level ofspecific antibody induced by Ad vector HBV vaccines.Results After35d，the specific antibody could not be detected in those mice inocultated Ad HBV vaccines.Butafter72d，the same titer of antibody can be detected in mice inoculated by nasal with the Ad HBV vaccines and inoculated with aluminium-adjuvanted vaccines.Conclusion Inoculating Ad HBV vaccines by nasal is more effective than by subcutaneous tissue.
, 百拇医药
Key words adenovirus vector HBV vaccine mice
Ad载体疫苗是近年来研究的热点，但怎样才能获得水平高、持续时间长的抗体是制约其进入临床应用的重要因素之一。本研究将Ad HBV重组苗接种于BALB/C小鼠，研究了不同途径的免疫效果，探讨了刺激机体产生抗体与接种途径的关系。
1 材料与方法
1.1 动物 BALB/C小鼠(SPF)50只，雌性，18～20g。引自上海动物中心，动物合格证号:2002-0010。无菌环境空运，SPF饲养环境饲养。
1.2 动物分组 将上述动物随机分为5组，每组10只，分别为Ad HBV重组疫苗(本室参照说明书用clontech公司试剂盒构建，含HBV pres2-s片段)、试验组(包括鼻腔、皮下途径组)、阳性对照组(皮下注射常规铝佐剂疫苗，购自山东省免疫控制中心，深圳康泰公司产品，批号:20021052-2)、阴性对照组(生理盐水鼻腔接种对照、生理盐水皮下注射对照)。
, 百拇医药
1.3 动物免疫剂量和时间 Ad HBV重组苗鼻腔接种剂量为7.5×10 -7 (PFU);注射剂量为成人用量的5倍。在0d、14d、28d、65d时接种动物，在35d、72d眼动脉丛取血，10000r/min离心分离血清用于测定小鼠抗体。
1.4 动物抗体检测(ELISA法) 将小鼠血清做1∶50、1∶ 100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200、1∶6400、1∶12800、1∶25600系列稀释，依次加入(100μl)包被有HBV S抗原(基因工程产品，购自中国预防医学科学院病毒所肝炎研究室，10ng/孔)、山羊血清封闭的聚乙烯多孔板中，37℃1h，然后加HRP-羊抗鼠IgG(sigma试剂，工作稀释度为10 -4 )。37℃孵育1h后用磷酸盐缓冲液洗板，加OPD显色系统显色，在492nm酶标仪测定OD值。
2 结果
见表1，图1。Ad HBV重组苗鼻腔接种动物35d未能测到抗体，重复免疫后在72d测到抗体，效价高达1/7040，与商业疫苗组比较P>0.05，差异无显著性;皮下注射重组疫苗组和阴性对照组动物35d、72d所取血清在1/200均未测到抗体。 图1 与皮下注射途径比较， HBV重组疫苗鼻腔接种效果显著
, 百拇医药
表1 重组疫苗鼻腔、皮下接种小鼠72d抗体水平
注: ˇ 重组疫苗组与商业疫苗组比较P>0.05
3 讨论
腺病毒载体重组疫苗是近年研究热点之一，如何获得水平高、持续时间长的抗体则是其能否走向临床的关键，比如，He [1] 等将B7-1共刺激分子与表面抗原一起表达，Lindley [2] 将IL-2、6等与目的蛋白共表达;Chengalvala [3] 等克隆增加了T细胞反应表位，力图提高重组苗的免疫效果。国内周智等 [4] 将B7与S基因片段共表达在免疫后10d检测了动物血清抗体，后与常规铝佐剂疫苗联合应用提高了免疫效果。本文将Ad HBV重组疫苗以不同免疫途径接种小鼠，在不同时间检测了动物血清抗体，结果发现皮下注射途径者在35d、72d均未能测到血清(1:200稀释)抗体，而鼻腔接种者抗体终末效价高达1/7040，与注射商业铝佐剂疫苗终末效价(1/8420)比较，差异无显著性(P>0.05)，表明Ad HBV重组疫苗适合鼻腔接种，延长免疫周期可弥补鼻腔接种重组疫苗的免疫效果。有关腺病毒载体重组疫苗口服和其他接种途径的免疫效果已经有人做了比较研究，Natuk等 [5] 通过狗和大猩猩比 较研究，得出了口服免疫效果不如鼻腔粘膜接种效果好的实验结论;何金生、王建伟 [6] 等报道RV Ad G1VP7重组疫苗鼻腔接种诱导小鼠产生抗体的终末效价高达10 -5 ，明显高于肠道接种途径的结果，与本实验结论相符。可见，Ad重组疫苗的鼻腔免疫效果是确切可信的。
, 百拇医药
总之，本文通过比较Ad HBV重组疫苗鼻腔与皮下两种免疫途径的结果，得到了鼻腔接种可以诱导高效免疫效果的结论，为该疫苗的推广应用奠定了基础。
参考文献
1 He X S，Chen H S，Chu K，et al.Costimulatory protein B7-1enhances the cytotoxic T cell response and antibody response to hepatitis B surface antigen.ProcNatl Acad Sci USA，1996，93(14):7274-7278.
2 Lindley T，Virk KP.Ronchetti Blume M，et al.Construction and characˉterization of adenovirus co-expressing hepatitis B virus surface antigen and interleukin-6.Gene，1994，138(1-2):165-170.
, 百拇医药
3 Chengalvala MV，Bhat R A，Bhat B M，et al.Enhanced immunogenicity of hepatitis B surface antigen by insertion of a helper T cell epitope from tetanus toxoid.Vaccine，1999，17(9-10):1035-1041.
4 Zhou Z，Zhang D，Ren H.Construction of the recombinant retrovirus vector of HBV-S gene and it’s expression in eukaryotic cells.Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi，2000，8(5):296-298.
5 Natuk RJ，Davis AR，Chanda PK，et al.Adenovirus vectored vaccines.Dev BiolStand，1994，82:71-77.
6 何金生，王健伟，姜秀丽，等.复制缺陷型重组腺病毒rv Ad G1VP7免疫学效果的研究.安徽医科大学学报，2002，37(2):86-88.
作者单位:250062山东济南山东省医学科学院基础医学研究所
(收稿日期:2004-01-03)
(编辑刘 静), 百拇医药
【摘要】 目的 研究腺病毒(Adenovirus，Ad)载体乙型肝炎病毒(Hapatitis B virus，HBV)疫苗免疫途径与小鼠产生抗体水平的关系。方法 将BALB/C小鼠(SPF)分为5组，每组10只，分别于鼻腔、皮下接种Ad HBV重组疫苗，用ELISA方法在免疫动物后35d、72d检测动脉血清抗体，与注射常规铝佐剂肽苗组和阴性对照组比较，探讨重组苗免疫途径与小鼠产生抗体水平的关系。结果 皮下注射Ad HBV组在35d、72d均不能测到抗体;鼻腔接种Ad HBV苗组在35d不能测到抗体，72d后在动物血清中测到抗体(终末效价为1/7040)，与注射铝佐剂苗(1/8420)相当。结论 鼻腔接种Ad HBV重组苗比注射有效。
关键词 腺病毒 载体 乙型肝炎/疫苗 动物/小鼠
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-6115(2004)05-0392-02
, http://www.100md.com
The research on inoculative approach
with adenovirus vector vaccines in mice
Li Yan，Yue Yingying，Zhang Fengli，et al.
Department of Microbiology，Institute of Basic
Medicine，Shandong Academy ofMedical Science，Jinan250062.
【Abstract】 Objective To investigate the relationship of inoculative approach and the level of specific antiˉbody induced by adenovirus(Ad)vector HBV vaccines in mice.Methods The mice were divided into5groups，each group had10mice.The Ad HBV vaccines were inoculated by nasal，subcutaneous tissue in every group respectively.The specific antibody was tested by ELISA in35d，72d and compared with the group injected with aluminium-adjuˉvanted vaccines，and discussed the relationship of inoculative approach and the level ofspecific antibody induced by Ad vector HBV vaccines.Results After35d，the specific antibody could not be detected in those mice inocultated Ad HBV vaccines.Butafter72d，the same titer of antibody can be detected in mice inoculated by nasal with the Ad HBV vaccines and inoculated with aluminium-adjuvanted vaccines.Conclusion Inoculating Ad HBV vaccines by nasal is more effective than by subcutaneous tissue.
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Key words adenovirus vector HBV vaccine mice
Ad载体疫苗是近年来研究的热点，但怎样才能获得水平高、持续时间长的抗体是制约其进入临床应用的重要因素之一。本研究将Ad HBV重组苗接种于BALB/C小鼠，研究了不同途径的免疫效果，探讨了刺激机体产生抗体与接种途径的关系。
1 材料与方法
1.1 动物 BALB/C小鼠(SPF)50只，雌性，18～20g。引自上海动物中心，动物合格证号:2002-0010。无菌环境空运，SPF饲养环境饲养。
1.2 动物分组 将上述动物随机分为5组，每组10只，分别为Ad HBV重组疫苗(本室参照说明书用clontech公司试剂盒构建，含HBV pres2-s片段)、试验组(包括鼻腔、皮下途径组)、阳性对照组(皮下注射常规铝佐剂疫苗，购自山东省免疫控制中心，深圳康泰公司产品，批号:20021052-2)、阴性对照组(生理盐水鼻腔接种对照、生理盐水皮下注射对照)。
, 百拇医药
1.3 动物免疫剂量和时间 Ad HBV重组苗鼻腔接种剂量为7.5×10 -7 (PFU);注射剂量为成人用量的5倍。在0d、14d、28d、65d时接种动物，在35d、72d眼动脉丛取血，10000r/min离心分离血清用于测定小鼠抗体。
1.4 动物抗体检测(ELISA法) 将小鼠血清做1∶50、1∶ 100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200、1∶6400、1∶12800、1∶25600系列稀释，依次加入(100μl)包被有HBV S抗原(基因工程产品，购自中国预防医学科学院病毒所肝炎研究室，10ng/孔)、山羊血清封闭的聚乙烯多孔板中，37℃1h，然后加HRP-羊抗鼠IgG(sigma试剂，工作稀释度为10 -4 )。37℃孵育1h后用磷酸盐缓冲液洗板，加OPD显色系统显色，在492nm酶标仪测定OD值。
2 结果
见表1，图1。Ad HBV重组苗鼻腔接种动物35d未能测到抗体，重复免疫后在72d测到抗体，效价高达1/7040，与商业疫苗组比较P>0.05，差异无显著性;皮下注射重组疫苗组和阴性对照组动物35d、72d所取血清在1/200均未测到抗体。 图1 与皮下注射途径比较， HBV重组疫苗鼻腔接种效果显著
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表1 重组疫苗鼻腔、皮下接种小鼠72d抗体水平
注: ˇ 重组疫苗组与商业疫苗组比较P>0.05
3 讨论
腺病毒载体重组疫苗是近年研究热点之一，如何获得水平高、持续时间长的抗体则是其能否走向临床的关键，比如，He [1] 等将B7-1共刺激分子与表面抗原一起表达，Lindley [2] 将IL-2、6等与目的蛋白共表达;Chengalvala [3] 等克隆增加了T细胞反应表位，力图提高重组苗的免疫效果。国内周智等 [4] 将B7与S基因片段共表达在免疫后10d检测了动物血清抗体，后与常规铝佐剂疫苗联合应用提高了免疫效果。本文将Ad HBV重组疫苗以不同免疫途径接种小鼠，在不同时间检测了动物血清抗体，结果发现皮下注射途径者在35d、72d均未能测到血清(1:200稀释)抗体，而鼻腔接种者抗体终末效价高达1/7040，与注射商业铝佐剂疫苗终末效价(1/8420)比较，差异无显著性(P>0.05)，表明Ad HBV重组疫苗适合鼻腔接种，延长免疫周期可弥补鼻腔接种重组疫苗的免疫效果。有关腺病毒载体重组疫苗口服和其他接种途径的免疫效果已经有人做了比较研究，Natuk等 [5] 通过狗和大猩猩比 较研究，得出了口服免疫效果不如鼻腔粘膜接种效果好的实验结论;何金生、王建伟 [6] 等报道RV Ad G1VP7重组疫苗鼻腔接种诱导小鼠产生抗体的终末效价高达10 -5 ，明显高于肠道接种途径的结果，与本实验结论相符。可见，Ad重组疫苗的鼻腔免疫效果是确切可信的。
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总之，本文通过比较Ad HBV重组疫苗鼻腔与皮下两种免疫途径的结果，得到了鼻腔接种可以诱导高效免疫效果的结论，为该疫苗的推广应用奠定了基础。
参考文献
1 He X S，Chen H S，Chu K，et al.Costimulatory protein B7-1enhances the cytotoxic T cell response and antibody response to hepatitis B surface antigen.ProcNatl Acad Sci USA，1996，93(14):7274-7278.
2 Lindley T，Virk KP.Ronchetti Blume M，et al.Construction and characˉterization of adenovirus co-expressing hepatitis B virus surface antigen and interleukin-6.Gene，1994，138(1-2):165-170.
, 百拇医药
3 Chengalvala MV，Bhat R A，Bhat B M，et al.Enhanced immunogenicity of hepatitis B surface antigen by insertion of a helper T cell epitope from tetanus toxoid.Vaccine，1999，17(9-10):1035-1041.
4 Zhou Z，Zhang D，Ren H.Construction of the recombinant retrovirus vector of HBV-S gene and it’s expression in eukaryotic cells.Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi，2000，8(5):296-298.
5 Natuk RJ，Davis AR，Chanda PK，et al.Adenovirus vectored vaccines.Dev BiolStand，1994，82:71-77.
6 何金生，王健伟，姜秀丽，等.复制缺陷型重组腺病毒rv Ad G1VP7免疫学效果的研究.安徽医科大学学报，2002，37(2):86-88.
作者单位:250062山东济南山东省医学科学院基础医学研究所
(收稿日期:2004-01-03)
(编辑刘 静), 百拇医药