血液病患儿骨髓细胞DNA变异的临床意义探讨
【摘要】 目的 探讨小儿常见血液病骨髓细胞变异的临床意义。方法 应用流式细胞仪测定54例血液病患儿骨髓单个核细胞的DNA含量，计算细胞周期各时相比例。结果 白血病组异倍体检出率明显高于非白血病组。12例非白血病中4例为异倍体，其中2例癌变。白血病组骨髓细胞S%明显低于对照组。3例接受治疗的急性淋巴细胞性白血病患儿达到完全缓解后，其S%明显高于治疗前，非白血病组的骨髓细胞周期与正常对照组差异无显著性。结论 检测常见小儿血液病DNA可为临床诊断、判断其预后及其治疗提供客观的参考数据。
关键词 常见血液病 DNA变异 异倍体 细胞周期
【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2004)09-0781-02
Clinical significance of DNA variation of marrow cell
, http://www.100md.com in the common blood disease in children
Li Zhongyi
The Central Hospital of Jianghan Oil Field Qiangjiang Hubei Prov.433124.
【Abstract】 Objective To study the clinical significance of DNA variationof marrow cell in the common blood disease in children.Methods We have detectedthe DNA quantity of MNLL in54children patients with the common blood disease byflow cytometry，and counted the ratio of any timely difference in cell cycle.Results The deˉtection ratio of heteroploidy in leukemia children was more than that in non-leukemia.Four of12patients with non-leukemia were heteroploidy，2of4were precancerous lesion.The S%of marrow cell of leukemia was significant lesser than that of control.Three acute lymphocytic leukemia were got CR，and its S%was more than that before therapy.There were no significance between the marrow cell cycle of non-leukemia and the normal control.Conclusion To detect the DNA in the common blood disease in children can provide objective parameter for clinical diagnosis，judging prognosis and its therapy.
, 百拇医药
Key words common blood disease DNA variation heteroploidy cell cycle
为探讨血液病患儿DNA的变异，我们采用流式细胞仪(FCM)检测54例血液病患儿骨髓单个核细胞(MNLL)的DNA含量，以分析其倍体水平及细胞增殖周期，进一步探讨其临床意义。
1 对象与方法
1.1 对象 (1)急性白血病组(AL):初诊为AL42例，其中急性淋巴细胞性白血病(ALL)22例，急性非淋巴细胞性白血病(ANLL)20例。(2)初诊为非白血病的常见血液病组12例:4例急性特发性血小板减少性紫癜(AITP)，慢性特发性血小板减少性紫癜(CITP)、再生障碍性贫血(AA)、急性溶血性贫血各2例，营养性缺铁性贫血、粒细胞减少症各1例，均经临床及实验室检查确诊，年龄2～14岁，平均年龄6.5岁。(3)正常对照组15例，为骨髓象正常的儿童，年龄2～14年。平均年龄6.7岁。
, 百拇医药
1.2 方法 (1)样品制备:取肝素抗凝骨髓0.1ml，按常规方法分离MNC，每个测定管加骨髓细胞10 6 个，然后依次加入DNA测定液(Coulter DNA Kit)，室温保存30min，然后加入PI染色液(终浓度为100μl/ml)。室温下30min后上机测定。(2)DNA测定方法:流式细胞仪FACscan(Coulter公司)，15mW氩离子激光光源，发射波长488nm，每个样品测定10000个细胞，采用Coulter公司提供的DNA分析程序，获取 各样本细胞周期时相百分比。流式细胞检测方法:采用Coulter公司生产的流式细胞仪FACscan进行参数检测，每个样本随机测定10 4 个细胞，并求出细胞生长分数(%)=(S+G 2 /M)/(G 1 +S+G 2 /M)×100%，将测量的数据、图形同步输入HP-300Consort30计算机，应用相应软件程序进行资料处理。(3)倍体分析:根据DNA指数(DI)判断，本仪器DI正常范围是0.90～1.10，小于0.9为亚二倍体，大于1.10为超二倍体。
, 百拇医药
1.3 统计学处理 采用t检验和X 2 检验。
2 结果
2.1 DNA异倍体检出率 白血病组异倍体检出率57.1%(24/42)，其中ALL68.2%(15/22)，ANLL为25%(5/20)，两者比较存在显著差异(P<0.05)，血液病组异倍体检出率33.3%(4/12)，与白血病组比较存在显著差异(P<0.05)。正常对照组无1人检出异倍体。
2.2 细胞周期分布 见表1。ALL及ANLL组G 0 /G 1 %均明显高于对照组(P<0.01)，S%+G 2 /M%则明显低于对照组(P<0.05)。ALL组与ANLL组比较，各周期细胞分布无显著差异。血液病组DNA分析图形除了有4例异倍体外，其余均与正常对照组相似，细胞周期分布各值与正常对照组比较无显著差异。
, 百拇医药
表1 各组的骨髓细胞周期分布 (X±s)
注:与对照组比较ˇP<0.05
3 讨论
近年来，FCM广泛应用于肿瘤细胞学的临床诊断，人体正常的细胞具有较恒定的DNA二倍体含量，当人体癌变及具有恶性潜能的癌前病变时，在其发生、发展过程中可伴随细胞DNA含量的异常改变 [1] 。本文结果表明，白血病异倍体检出率为57.1%(24/42)，血液病患儿异倍体检出率为33.3%(4/12)，两组存在显著差异。经追踪，4例异倍体初诊为非白血病中，1例CITP转变为骨髓增生异常综合征(MDS)，1例AA发病为ANLL。因此，初诊为血液病的患儿，临床进行骨髓细胞形态学检查的同时，应用FCM检测其骨髓MNC的DNA含量，对DNA含量异常的非白血病患儿，应高度注意其癌变的可能。
本资料显示，白血病异倍体检出率显著高于非白血病组，因此DNA倍体改变在AL中极其常见，而且ALL的DNA异倍体检出率明显高于ANLL组，从遗传学角度分析AL的发病机制表明ANLL患儿的染色体异常较多地表现为结构异常，而不是数目的异常，还可能是临床上ANLL较ALL缓解率低的原因之一。此外，本文接受治疗的8例ALL中6例达到完全缓解(CR)，其中4例为超二倍体，另2例分别为二倍体和亚二倍体，提示超二倍体患儿的CR率高，预后较好，与多数文献报道一致 [2，3] 。
, 百拇医药
细胞周期中S期比例代表该细胞群体中增殖细胞的数 量，从侧面反映细胞的增殖状态，本文AL组骨髓细胞的G 0 /G%明显高于正常对照组，而S%及S+G 2 /M%明显低于对照组，说明了白血病骨髓细胞从G 0 /G 1 期至S期之间存在运行阻滞，表明白血病骨髓细胞的增殖能力低于正常。追踪结果发现同一患者在不同病期的白血病细胞增殖状况不同，3例ALL达到CR后，其S%(分别为30.2%，28.5%，26.3%)和S+G 2 /M%(分别为35.3%，30.2%，33.5%)均明显高于初诊时的S%(分别为10.5%，12.4%，13.1%)和S+G 2 /M%(分别为9.5%，13.8%，20.6%)，说明AL患儿CR后各期比例恢复正常，骨髓造血功能恢复，我们将继续应用FCM定期测定AL患儿骨髓细胞周期分布，了解细胞增殖状态，施以相应的治疗，提高治疗AL的疗效。
参考文献
, http://www.100md.com
1 Barlogie B，Drewindo B，Schumann J，et al.Cellular DNA content as a marker of neoplasia in man.Am J Med，1998，80(1):195-200.
2 Stary J，Hrodek O，Harsner P，et al.The importance of blast cell DNA content for prognosis of childhood acute lymphoblastic leukemia.Neoˉplasma.1999，46(2):293-296.
3 Look AT，Roberson PK，Williams DI，et al.Prognostic importance of blast cell:DNA content in childhood adute lmphoblastic leukemia.Blood，1999，70(9):1079-1083.
作者单位:433124湖北省江汉油田中心医院
(收稿日期:2004-02-12)
(编辑罗 彬), http://www.100md.com
关键词 常见血液病 DNA变异 异倍体 细胞周期
【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2004)09-0781-02
Clinical significance of DNA variation of marrow cell
, http://www.100md.com in the common blood disease in children
Li Zhongyi
The Central Hospital of Jianghan Oil Field Qiangjiang Hubei Prov.433124.
【Abstract】 Objective To study the clinical significance of DNA variationof marrow cell in the common blood disease in children.Methods We have detectedthe DNA quantity of MNLL in54children patients with the common blood disease byflow cytometry，and counted the ratio of any timely difference in cell cycle.Results The deˉtection ratio of heteroploidy in leukemia children was more than that in non-leukemia.Four of12patients with non-leukemia were heteroploidy，2of4were precancerous lesion.The S%of marrow cell of leukemia was significant lesser than that of control.Three acute lymphocytic leukemia were got CR，and its S%was more than that before therapy.There were no significance between the marrow cell cycle of non-leukemia and the normal control.Conclusion To detect the DNA in the common blood disease in children can provide objective parameter for clinical diagnosis，judging prognosis and its therapy.
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Key words common blood disease DNA variation heteroploidy cell cycle
为探讨血液病患儿DNA的变异，我们采用流式细胞仪(FCM)检测54例血液病患儿骨髓单个核细胞(MNLL)的DNA含量，以分析其倍体水平及细胞增殖周期，进一步探讨其临床意义。
1 对象与方法
1.1 对象 (1)急性白血病组(AL):初诊为AL42例，其中急性淋巴细胞性白血病(ALL)22例，急性非淋巴细胞性白血病(ANLL)20例。(2)初诊为非白血病的常见血液病组12例:4例急性特发性血小板减少性紫癜(AITP)，慢性特发性血小板减少性紫癜(CITP)、再生障碍性贫血(AA)、急性溶血性贫血各2例，营养性缺铁性贫血、粒细胞减少症各1例，均经临床及实验室检查确诊，年龄2～14岁，平均年龄6.5岁。(3)正常对照组15例，为骨髓象正常的儿童，年龄2～14年。平均年龄6.7岁。
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1.2 方法 (1)样品制备:取肝素抗凝骨髓0.1ml，按常规方法分离MNC，每个测定管加骨髓细胞10 6 个，然后依次加入DNA测定液(Coulter DNA Kit)，室温保存30min，然后加入PI染色液(终浓度为100μl/ml)。室温下30min后上机测定。(2)DNA测定方法:流式细胞仪FACscan(Coulter公司)，15mW氩离子激光光源，发射波长488nm，每个样品测定10000个细胞，采用Coulter公司提供的DNA分析程序，获取 各样本细胞周期时相百分比。流式细胞检测方法:采用Coulter公司生产的流式细胞仪FACscan进行参数检测，每个样本随机测定10 4 个细胞，并求出细胞生长分数(%)=(S+G 2 /M)/(G 1 +S+G 2 /M)×100%，将测量的数据、图形同步输入HP-300Consort30计算机，应用相应软件程序进行资料处理。(3)倍体分析:根据DNA指数(DI)判断，本仪器DI正常范围是0.90～1.10，小于0.9为亚二倍体，大于1.10为超二倍体。
, 百拇医药
1.3 统计学处理 采用t检验和X 2 检验。
2 结果
2.1 DNA异倍体检出率 白血病组异倍体检出率57.1%(24/42)，其中ALL68.2%(15/22)，ANLL为25%(5/20)，两者比较存在显著差异(P<0.05)，血液病组异倍体检出率33.3%(4/12)，与白血病组比较存在显著差异(P<0.05)。正常对照组无1人检出异倍体。
2.2 细胞周期分布 见表1。ALL及ANLL组G 0 /G 1 %均明显高于对照组(P<0.01)，S%+G 2 /M%则明显低于对照组(P<0.05)。ALL组与ANLL组比较，各周期细胞分布无显著差异。血液病组DNA分析图形除了有4例异倍体外，其余均与正常对照组相似，细胞周期分布各值与正常对照组比较无显著差异。
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表1 各组的骨髓细胞周期分布 (X±s)
注:与对照组比较ˇP<0.05
3 讨论
近年来，FCM广泛应用于肿瘤细胞学的临床诊断，人体正常的细胞具有较恒定的DNA二倍体含量，当人体癌变及具有恶性潜能的癌前病变时，在其发生、发展过程中可伴随细胞DNA含量的异常改变 [1] 。本文结果表明，白血病异倍体检出率为57.1%(24/42)，血液病患儿异倍体检出率为33.3%(4/12)，两组存在显著差异。经追踪，4例异倍体初诊为非白血病中，1例CITP转变为骨髓增生异常综合征(MDS)，1例AA发病为ANLL。因此，初诊为血液病的患儿，临床进行骨髓细胞形态学检查的同时，应用FCM检测其骨髓MNC的DNA含量，对DNA含量异常的非白血病患儿，应高度注意其癌变的可能。
本资料显示，白血病异倍体检出率显著高于非白血病组，因此DNA倍体改变在AL中极其常见，而且ALL的DNA异倍体检出率明显高于ANLL组，从遗传学角度分析AL的发病机制表明ANLL患儿的染色体异常较多地表现为结构异常，而不是数目的异常，还可能是临床上ANLL较ALL缓解率低的原因之一。此外，本文接受治疗的8例ALL中6例达到完全缓解(CR)，其中4例为超二倍体，另2例分别为二倍体和亚二倍体，提示超二倍体患儿的CR率高，预后较好，与多数文献报道一致 [2，3] 。
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细胞周期中S期比例代表该细胞群体中增殖细胞的数 量，从侧面反映细胞的增殖状态，本文AL组骨髓细胞的G 0 /G%明显高于正常对照组，而S%及S+G 2 /M%明显低于对照组，说明了白血病骨髓细胞从G 0 /G 1 期至S期之间存在运行阻滞，表明白血病骨髓细胞的增殖能力低于正常。追踪结果发现同一患者在不同病期的白血病细胞增殖状况不同，3例ALL达到CR后，其S%(分别为30.2%，28.5%，26.3%)和S+G 2 /M%(分别为35.3%，30.2%，33.5%)均明显高于初诊时的S%(分别为10.5%，12.4%，13.1%)和S+G 2 /M%(分别为9.5%，13.8%，20.6%)，说明AL患儿CR后各期比例恢复正常，骨髓造血功能恢复，我们将继续应用FCM定期测定AL患儿骨髓细胞周期分布，了解细胞增殖状态，施以相应的治疗，提高治疗AL的疗效。
参考文献
, http://www.100md.com
1 Barlogie B，Drewindo B，Schumann J，et al.Cellular DNA content as a marker of neoplasia in man.Am J Med，1998，80(1):195-200.
2 Stary J，Hrodek O，Harsner P，et al.The importance of blast cell DNA content for prognosis of childhood acute lymphoblastic leukemia.Neoˉplasma.1999，46(2):293-296.
3 Look AT，Roberson PK，Williams DI，et al.Prognostic importance of blast cell:DNA content in childhood adute lmphoblastic leukemia.Blood，1999，70(9):1079-1083.
作者单位:433124湖北省江汉油田中心医院
(收稿日期:2004-02-12)
(编辑罗 彬), http://www.100md.com