羊膜联合自体角膜缘移植治疗眼表损伤的实验研究(基金项目)
http://www.100md.com
基金项目:上海市科委基金资助项目(014119092)
【摘要】 目的 探讨羊膜联合自体角膜缘移植对眼表损伤的疗效。方法 采用羊膜联合自体角膜缘移植分别治疗1/2、3/4和全角膜缘受损动物，评价治疗效果。结果 1/2和3/4角膜缘受损的动物术后获得稳定眼表面，全角膜缘受损的动物术后出现大范围角膜表面结膜上皮化。结论 羊膜联合自体角膜缘移植能治疗2/3以下角膜缘受损的眼表损伤，不能治疗全角膜缘受损的眼表损伤。
关键词 羊膜 角膜缘干细胞 眼表重建
【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2004)11-0964-03
The experimental study on ocular surface reconstruction by
transplantation of amnion combined with autologous limbus
, 百拇医药
Fan Xianqun，Li Jin
Dept.of Ophthalmology of the No.9People’s Hospital of Shanghai Second Medical University，Shanghai200011.
【Abstract】 Objective To investigate and evaluate the effects of amnion transplantation combined with autoloˉgous limbus for ocualr surface damage.Methods Rabbits underwent excision of1/2，3/4and total of limbal circumˉference in one eye，then amnion transplantation combined with autologous limbus were performed.After operation，the corneal changes were observed and the corneal pathological change were examined.Results 28days after operation，rabbits with excision of1/2and3/4limbal circumference gained normal ocular surface，while those with excision of total limbal circumference had conjunctival epithelium covering corneal surface.Conclusion Amnion transplantation combined withautologous limbus is effective for treating limbus injuries less than3/4circumference，but is not effecˉtive for total limbus injuries.
, 百拇医药
Key words amnion limbal stem cell ocular surface reconstruction
热化学烧伤、单疱病毒感染、复发性翼状胬肉等严重眼表疾病临床上表现为大范围的眼表上皮缺损，由于缺损范围大，周围的上皮细胞移行不足以修复整个缺损区，进而瘢痕愈合，继发睑球粘连，角膜混浊。眼表疾病发病率高，治疗困难，长期以来一直是眼科医师面临的临床难题之一。近年来，随着角膜缘干细胞研究的不断深入，人们逐渐认识到角膜缘受损、干细胞缺乏是眼表疾病的主要原因，只有矫正了患眼角膜缘干细胞的失代偿状态，才有可能抑制上述并发症的发生。本实验采用羊膜联合自体角膜缘干细胞移植对不同范围的眼表损伤的动物进行眼表重建，观察和比较治疗效果，对羊膜联合自体角膜缘移植治疗眼表疾病的疗效作出评价。
1 对象与方法
1.1 实验动物 30只成年新西兰大白兔，雌雄不拘，体重2.0～2.5kg，检查无眼疾。30只兔均分为A、B、C3组，分别为1/2、2/3和全部角膜缘损伤组。
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1.2 方法
1.2.1 保存人羊膜制备 选择健康剖宫产妇的胎盘，无菌操作下剪取羊膜，反复浸洗，剪成2cm×2cm大小，上皮面向上铺于滤纸上，深低温保存，使用前常温下解冻 [1] 。
1.2.2 1/2角膜缘损伤眼表重建 兔10只，去除右眼1/2面积的角膜缘上皮、角膜上皮及浅层基质，左眼上方取90°角膜缘组织备用，然后随机分成A实验组和A对照组，每组5只。A实验组行羊膜联合自体角膜缘移植术。方法是用10-0尼龙线经过浅层巩膜将自体植片结膜缘与右眼结膜创缘紧密对合，按角膜缺损面积，修剪同形等大的保存羊膜，上皮面向上，用10-0尼龙线将羊膜植片边缘与角膜创缘和移植角膜边缘紧密结合。A对照组不进行眼表重建手术。
1.2.3 2/3角膜缘损伤眼表重建 兔10只，去除右眼2/3面积角膜缘上皮、角膜上皮和浅层基质，左眼上方取90°角膜缘组织备用，然后随机分成B实验组和B对照组，每组5只。B实验组行羊膜联合自体角膜缘移植术，方法同前。B对照组不进行眼表重建手术。
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1.2.4 全角膜缘损伤眼表重建 兔10只，去除右眼全角膜缘上皮、角膜上皮和浅层基质，左眼上方取90°角膜缘组织备用，然后随机分成C实验组和C对照组，每组5只。C实验组行羊膜联合自体角膜缘移植术，方法同前。C对照组不进行眼表重建手术。
1.3 术后处理和观察 各组手术眼每天滴0.25%氯霉素地塞米松眼液4次。定期观察各组动物术后眼表形态改变，28天后对各组动物进行评分，处死动物，取眼球行角膜组织学检查，以抗角膜上皮细胞特异性角蛋白K3的单克隆抗体AE5，对各组动物的角膜表面细胞进行免疫组化染色。
1.4 眼表形态评分标准 (1)结合印迹细胞学检查结果观察结膜上皮化情况:1分，无结膜上皮化或少量结膜上皮化;2分，1/2以上角膜表面出现结膜上皮化;3分，3/4以上角膜表面出现结膜上皮化;4分，全部角膜表面出现结膜上皮化。(2)角膜新生血管情况:1分，无新生血管或新生血管位于角膜缘内2mm;2分，新生血管位于角膜周边，≤1/2角膜表面;3分，新生血管位于角膜周边，>1/2角膜表面;4分，全角膜可见新生血管。(3)角膜透明度情况:1分，角膜透明或轻度混浊，虹膜纹理可见;2分，角膜中度混浊，虹膜纹理不清;3分，角膜重度混浊，隐见瞳孔;4分，角膜极度混浊，瞳孔不见。本文数据采用SAS For Windows V8统计软件处理，统计学方法为Wilcoxon检验的确切概率计算。
, 百拇医药
2 结果
2.1 术后28天各组眼表形态改变 A实验组5只兔均未出现角膜结膜上皮化，A对照组4只兔结膜上皮化面积达1/2角膜面积，1只结膜上皮化面积达2/3角膜面积。B实验组4只兔未出现角膜结膜上皮化，1只出现1/2角膜面积的结膜上皮化。B对照组5只兔角膜结膜化范围达1/2角膜面积以上。C实验组5只兔均出现1/2以上角膜面积的结膜上皮化，C对照组5只兔角膜结膜化范围达2/3角膜面积以上。
2.2 评分结果和统计学处理 评分结果见表1～3。以防治角膜结膜化为主要指标，统计学处理结果显示，A实验组与A对照组疗效比较差异有显著性(P<0.05)，表明羊膜联合自体角膜缘移植对1/2角膜缘受损的眼表损伤有治疗效果;B实验组与B对照组疗效比较差异有显著性(P<0.05)，表明羊膜联合自体角膜缘移植对2/3角膜缘受损的眼表损伤有治疗效果;C实验组与C对照组疗效比较差异无显著性(P>0.05)，表明羊膜联合自体角膜缘移植对全角膜缘受损的眼表损伤无治疗效果。
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表1 各组角膜结膜上皮化评分和统计结果
2.3 组织学检查 组织学检查显示A实验组和B实验组角膜表面有复层上皮，共4～5层细胞连续贴附于羊膜上，基底部细胞呈柱状，表面为扁平形，与正常角膜上皮结构基本相似，但较正常偏厚(图1)。A对照组、B对照组、C实验组和C对照组可见结膜样上皮侵入角膜。
免疫细胞化学染色显示A实验组和B实验组角膜表面细胞胞浆被染成棕黄色，能正常表达角膜上皮特异性角 蛋白K3(图2)。A对照组、B对照组、C实验组和C对照组染色阴性。
表2 各组角膜新生血管评分和统计结果
表3 各组角膜透明度评分和统计结果
3 讨论
Kenyon [2] 于1998年创立了自体角膜缘移植术，其原理是应用自体健眼的角膜缘替换功能缺陷的患眼角膜缘组织，通过供体植片内角膜缘干细胞的增殖、分化及向心性移动来修复、稳定受损眼表面，阻止新生血管的侵入和假性胬肉的形成。Tsai [3] 等在动物实验中发现健康的角膜缘上皮不仅能提供干细胞，还具有屏障功能，能显著抑制角膜新生血管，防止角膜混浊。本实验采用羊膜联合角膜缘干细胞移植分别治疗1/2和3/4角膜缘受损的动物，10只动物中9只术后获得稳定眼表面，而对照组所有动物均出现不同程度的结膜上皮化和新生血管侵入，表明自体的角膜缘移植能有效矫正患眼的干细胞失代偿状态，从而恢复受损的眼表面。
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角膜上皮细胞更新及再生的源泉是角膜缘干细胞，而角膜缘干细胞的增殖分化很大程度依赖于周围基质微坏境-干细胞壁龛的存在 [3] 。Tseng等对离体角膜上皮细胞的研究中发现，羊膜能起到干细胞壁龛的作用 [4] 。羊膜含有人体最厚的基底膜，其主要成分和眼表上皮细胞基底膜的成分相似，因此，在部分角膜缘受损，干细胞贮备受到破坏的情况下，移植的羊膜能抑制炎症反应，改善局部的微环境，促进损伤区周围的角膜缘干细胞增殖和分化，达到修复损伤的目的 [5] 。在角膜创伤愈合过程中，新生的角膜上皮细胞依靠表面受体与基底膜上的纤维连接蛋白结合进行附着和移动，反之则出现复发性上皮剥脱，羊膜的基底膜富含IV型和V型胶原和纤维连接蛋白，移植后能进一步促进上皮粘附，有利于创面修复 [6] 。
本实验中采用羊膜联合角膜缘移植术治疗全角膜缘受损的眼表损伤，5只动物均出现不同程度的结膜上皮化和新生血管长入，统计学处理显示该法对全角膜缘受损的眼表损伤疗效不佳，表明该方法仍有其不足之处。自体角膜缘植片取自健眼，由于一个健康的眼表面需要干细胞的数量无法确定，因此，从健眼取多少角膜缘组织才能保证其自然愈合，不受损伤，仍然是一个没有解决的问题。目前多数学者认为，采取健眼角膜缘组织最多不能超过总面积的1/3，以免影响健眼角膜上皮的稳定。本实验中C组动物角膜缘均受到严重破坏，干细胞几乎全部丧失，仅获得部分健康角膜缘干细胞不足以充分修复。因此，对于全角膜缘受损 的眼表损伤，羊膜联合自体角膜缘移植不是合理的治疗方法。 (本文图片见封三)
, http://www.100md.com
参考文献
1 李瑾，林明，范先群.羊膜移植修复碱烧伤后结膜缺损的实验研究.眼科研究，2003，21:169.
2 Meallet MA，Espana EM，Grueterich M，et al.Amniotic membrane transplantation with conjunctival limbal autograft for total limbal stem cell deficiency.Ophthalmology，2003，110:1585.
3 Tsai RJ，Li LM，Chen JK.Reconstruction of damaged corneas by transˉplantation of autologous limbal cells.N Eng J Med，2000，13:86.
, 百拇医药
4 Grueterich M，Espana EM，Tseng SC.Ex vivo expansion of limbal epˉithelialstem cells:amniotic membrane serving as a stem cell niche.Surv Ophthalmol，2003Nov-Dec;48:631-646.
5 Dua HS，Joseph A，Shanmuganathan VA，et al.Stem cell differentiaˉtion andthe effects of deficiency，Eye，2003，17:877.
6 Gomes JA，Santos MS，Ventura AS，et al.Amniotic membrane with living related corneal limbal/conjunctioval allograft for ocular surface reˉconstruction inStevens-Johnson syndrome.Arch Ophthalmol，2003，121:1369.
作者单位:200011上海第二医科大学附属第九人民医院眼科
(收稿日期:2004-02-29)
(编辑晓 勇), http://www.100md.com
【摘要】 目的 探讨羊膜联合自体角膜缘移植对眼表损伤的疗效。方法 采用羊膜联合自体角膜缘移植分别治疗1/2、3/4和全角膜缘受损动物，评价治疗效果。结果 1/2和3/4角膜缘受损的动物术后获得稳定眼表面，全角膜缘受损的动物术后出现大范围角膜表面结膜上皮化。结论 羊膜联合自体角膜缘移植能治疗2/3以下角膜缘受损的眼表损伤，不能治疗全角膜缘受损的眼表损伤。
关键词 羊膜 角膜缘干细胞 眼表重建
【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2004)11-0964-03
The experimental study on ocular surface reconstruction by
transplantation of amnion combined with autologous limbus
, 百拇医药
Fan Xianqun，Li Jin
Dept.of Ophthalmology of the No.9People’s Hospital of Shanghai Second Medical University，Shanghai200011.
【Abstract】 Objective To investigate and evaluate the effects of amnion transplantation combined with autoloˉgous limbus for ocualr surface damage.Methods Rabbits underwent excision of1/2，3/4and total of limbal circumˉference in one eye，then amnion transplantation combined with autologous limbus were performed.After operation，the corneal changes were observed and the corneal pathological change were examined.Results 28days after operation，rabbits with excision of1/2and3/4limbal circumference gained normal ocular surface，while those with excision of total limbal circumference had conjunctival epithelium covering corneal surface.Conclusion Amnion transplantation combined withautologous limbus is effective for treating limbus injuries less than3/4circumference，but is not effecˉtive for total limbus injuries.
, 百拇医药
Key words amnion limbal stem cell ocular surface reconstruction
热化学烧伤、单疱病毒感染、复发性翼状胬肉等严重眼表疾病临床上表现为大范围的眼表上皮缺损，由于缺损范围大，周围的上皮细胞移行不足以修复整个缺损区，进而瘢痕愈合，继发睑球粘连，角膜混浊。眼表疾病发病率高，治疗困难，长期以来一直是眼科医师面临的临床难题之一。近年来，随着角膜缘干细胞研究的不断深入，人们逐渐认识到角膜缘受损、干细胞缺乏是眼表疾病的主要原因，只有矫正了患眼角膜缘干细胞的失代偿状态，才有可能抑制上述并发症的发生。本实验采用羊膜联合自体角膜缘干细胞移植对不同范围的眼表损伤的动物进行眼表重建，观察和比较治疗效果，对羊膜联合自体角膜缘移植治疗眼表疾病的疗效作出评价。
1 对象与方法
1.1 实验动物 30只成年新西兰大白兔，雌雄不拘，体重2.0～2.5kg，检查无眼疾。30只兔均分为A、B、C3组，分别为1/2、2/3和全部角膜缘损伤组。
, http://www.100md.com
1.2 方法
1.2.1 保存人羊膜制备 选择健康剖宫产妇的胎盘，无菌操作下剪取羊膜，反复浸洗，剪成2cm×2cm大小，上皮面向上铺于滤纸上，深低温保存，使用前常温下解冻 [1] 。
1.2.2 1/2角膜缘损伤眼表重建 兔10只，去除右眼1/2面积的角膜缘上皮、角膜上皮及浅层基质，左眼上方取90°角膜缘组织备用，然后随机分成A实验组和A对照组，每组5只。A实验组行羊膜联合自体角膜缘移植术。方法是用10-0尼龙线经过浅层巩膜将自体植片结膜缘与右眼结膜创缘紧密对合，按角膜缺损面积，修剪同形等大的保存羊膜，上皮面向上，用10-0尼龙线将羊膜植片边缘与角膜创缘和移植角膜边缘紧密结合。A对照组不进行眼表重建手术。
1.2.3 2/3角膜缘损伤眼表重建 兔10只，去除右眼2/3面积角膜缘上皮、角膜上皮和浅层基质，左眼上方取90°角膜缘组织备用，然后随机分成B实验组和B对照组，每组5只。B实验组行羊膜联合自体角膜缘移植术，方法同前。B对照组不进行眼表重建手术。
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1.2.4 全角膜缘损伤眼表重建 兔10只，去除右眼全角膜缘上皮、角膜上皮和浅层基质，左眼上方取90°角膜缘组织备用，然后随机分成C实验组和C对照组，每组5只。C实验组行羊膜联合自体角膜缘移植术，方法同前。C对照组不进行眼表重建手术。
1.3 术后处理和观察 各组手术眼每天滴0.25%氯霉素地塞米松眼液4次。定期观察各组动物术后眼表形态改变，28天后对各组动物进行评分，处死动物，取眼球行角膜组织学检查，以抗角膜上皮细胞特异性角蛋白K3的单克隆抗体AE5，对各组动物的角膜表面细胞进行免疫组化染色。
1.4 眼表形态评分标准 (1)结合印迹细胞学检查结果观察结膜上皮化情况:1分，无结膜上皮化或少量结膜上皮化;2分，1/2以上角膜表面出现结膜上皮化;3分，3/4以上角膜表面出现结膜上皮化;4分，全部角膜表面出现结膜上皮化。(2)角膜新生血管情况:1分，无新生血管或新生血管位于角膜缘内2mm;2分，新生血管位于角膜周边，≤1/2角膜表面;3分，新生血管位于角膜周边，>1/2角膜表面;4分，全角膜可见新生血管。(3)角膜透明度情况:1分，角膜透明或轻度混浊，虹膜纹理可见;2分，角膜中度混浊，虹膜纹理不清;3分，角膜重度混浊，隐见瞳孔;4分，角膜极度混浊，瞳孔不见。本文数据采用SAS For Windows V8统计软件处理，统计学方法为Wilcoxon检验的确切概率计算。
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2 结果
2.1 术后28天各组眼表形态改变 A实验组5只兔均未出现角膜结膜上皮化，A对照组4只兔结膜上皮化面积达1/2角膜面积，1只结膜上皮化面积达2/3角膜面积。B实验组4只兔未出现角膜结膜上皮化，1只出现1/2角膜面积的结膜上皮化。B对照组5只兔角膜结膜化范围达1/2角膜面积以上。C实验组5只兔均出现1/2以上角膜面积的结膜上皮化，C对照组5只兔角膜结膜化范围达2/3角膜面积以上。
2.2 评分结果和统计学处理 评分结果见表1～3。以防治角膜结膜化为主要指标，统计学处理结果显示，A实验组与A对照组疗效比较差异有显著性(P<0.05)，表明羊膜联合自体角膜缘移植对1/2角膜缘受损的眼表损伤有治疗效果;B实验组与B对照组疗效比较差异有显著性(P<0.05)，表明羊膜联合自体角膜缘移植对2/3角膜缘受损的眼表损伤有治疗效果;C实验组与C对照组疗效比较差异无显著性(P>0.05)，表明羊膜联合自体角膜缘移植对全角膜缘受损的眼表损伤无治疗效果。
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表1 各组角膜结膜上皮化评分和统计结果
2.3 组织学检查 组织学检查显示A实验组和B实验组角膜表面有复层上皮，共4～5层细胞连续贴附于羊膜上，基底部细胞呈柱状，表面为扁平形，与正常角膜上皮结构基本相似，但较正常偏厚(图1)。A对照组、B对照组、C实验组和C对照组可见结膜样上皮侵入角膜。
免疫细胞化学染色显示A实验组和B实验组角膜表面细胞胞浆被染成棕黄色，能正常表达角膜上皮特异性角 蛋白K3(图2)。A对照组、B对照组、C实验组和C对照组染色阴性。
表2 各组角膜新生血管评分和统计结果
表3 各组角膜透明度评分和统计结果
3 讨论
Kenyon [2] 于1998年创立了自体角膜缘移植术，其原理是应用自体健眼的角膜缘替换功能缺陷的患眼角膜缘组织，通过供体植片内角膜缘干细胞的增殖、分化及向心性移动来修复、稳定受损眼表面，阻止新生血管的侵入和假性胬肉的形成。Tsai [3] 等在动物实验中发现健康的角膜缘上皮不仅能提供干细胞，还具有屏障功能，能显著抑制角膜新生血管，防止角膜混浊。本实验采用羊膜联合角膜缘干细胞移植分别治疗1/2和3/4角膜缘受损的动物，10只动物中9只术后获得稳定眼表面，而对照组所有动物均出现不同程度的结膜上皮化和新生血管侵入，表明自体的角膜缘移植能有效矫正患眼的干细胞失代偿状态，从而恢复受损的眼表面。
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角膜上皮细胞更新及再生的源泉是角膜缘干细胞，而角膜缘干细胞的增殖分化很大程度依赖于周围基质微坏境-干细胞壁龛的存在 [3] 。Tseng等对离体角膜上皮细胞的研究中发现，羊膜能起到干细胞壁龛的作用 [4] 。羊膜含有人体最厚的基底膜，其主要成分和眼表上皮细胞基底膜的成分相似，因此，在部分角膜缘受损，干细胞贮备受到破坏的情况下，移植的羊膜能抑制炎症反应，改善局部的微环境，促进损伤区周围的角膜缘干细胞增殖和分化，达到修复损伤的目的 [5] 。在角膜创伤愈合过程中，新生的角膜上皮细胞依靠表面受体与基底膜上的纤维连接蛋白结合进行附着和移动，反之则出现复发性上皮剥脱，羊膜的基底膜富含IV型和V型胶原和纤维连接蛋白，移植后能进一步促进上皮粘附，有利于创面修复 [6] 。
本实验中采用羊膜联合角膜缘移植术治疗全角膜缘受损的眼表损伤，5只动物均出现不同程度的结膜上皮化和新生血管长入，统计学处理显示该法对全角膜缘受损的眼表损伤疗效不佳，表明该方法仍有其不足之处。自体角膜缘植片取自健眼，由于一个健康的眼表面需要干细胞的数量无法确定，因此，从健眼取多少角膜缘组织才能保证其自然愈合，不受损伤，仍然是一个没有解决的问题。目前多数学者认为，采取健眼角膜缘组织最多不能超过总面积的1/3，以免影响健眼角膜上皮的稳定。本实验中C组动物角膜缘均受到严重破坏，干细胞几乎全部丧失，仅获得部分健康角膜缘干细胞不足以充分修复。因此，对于全角膜缘受损 的眼表损伤，羊膜联合自体角膜缘移植不是合理的治疗方法。 (本文图片见封三)
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参考文献
1 李瑾，林明，范先群.羊膜移植修复碱烧伤后结膜缺损的实验研究.眼科研究，2003，21:169.
2 Meallet MA，Espana EM，Grueterich M，et al.Amniotic membrane transplantation with conjunctival limbal autograft for total limbal stem cell deficiency.Ophthalmology，2003，110:1585.
3 Tsai RJ，Li LM，Chen JK.Reconstruction of damaged corneas by transˉplantation of autologous limbal cells.N Eng J Med，2000，13:86.
, 百拇医药
4 Grueterich M，Espana EM，Tseng SC.Ex vivo expansion of limbal epˉithelialstem cells:amniotic membrane serving as a stem cell niche.Surv Ophthalmol，2003Nov-Dec;48:631-646.
5 Dua HS，Joseph A，Shanmuganathan VA，et al.Stem cell differentiaˉtion andthe effects of deficiency，Eye，2003，17:877.
6 Gomes JA，Santos MS，Ventura AS，et al.Amniotic membrane with living related corneal limbal/conjunctioval allograft for ocular surface reˉconstruction inStevens-Johnson syndrome.Arch Ophthalmol，2003，121:1369.
作者单位:200011上海第二医科大学附属第九人民医院眼科
(收稿日期:2004-02-29)
(编辑晓 勇), http://www.100md.com