乙型肝炎病毒核酸水平与血清标志物模式及肝细胞损害关系的探讨
【摘要】 目的 探讨乙型肝炎患者HBV-DNA含量与乙肝血清标志物表达模式及肝细胞损害的关系。方法 以完全闭管式PCR和荧光探针技术相结合的方法检测867例乙肝患者血清HBV-DNA的含量，用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测乙肝血清标志物，用速率法检测ALT、AST。结果 HBeAg(+)/HBeAb(-)组与HBeAg(-)/HBeAb(+)及HBeAg(-)/HBeAb(-)组的HBV-DNA含量之间差异有极显著性;而HBeAg(-)/HBeAb(+)组与HBeAg(-)/HBeAb(-)组的HBV-DNA含量之间差异无统计学意义;HBV-DNA含量与ALT、AST水平无相关性。结论 HBeAg是反映HBV-DNA复制的重要指标，HBeAg阳性表示病毒复制活跃，HBV-DNA定量检测是反映HBV复制和药物疗效的最直接、可靠的指标;但与ALT、AST的水平没有相关性。
关键词 乙型肝炎病毒 HBV-DNA的含量 血清标志物模式
【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2004)10-0903-02
, http://www.100md.com
Investigation of the correlation among HBV necleic acid level
serum markermode and hepatic cell damage
Ma Yafeng，Feng Haixiang，Li Yi.
Department of Laboratory，The1st Hospital of Yulin City，Shanxi718000.
【Abstract】 Objective To investigate the correlation among HBV-DNA content of hepatitis B patients，exˉpresson of their serur marker mode and hepatic cell damage conditions.Methods The HBV-DNA content of867hepatitis B patients were examined by complete closed tube PCR technique combined with fluorescence probe techˉnique，the serum marker by Enzyme-Linked Immunosorbent Assay(ELISA)，ALT andAST by rate method.Results The HBV-DNA content had an extremely significant difference among group HBeAg(+)/HBeAb(-)，group HBeAg(-)/HBeAb(+)and group HBeAg(-)/HBeAb(-)，but had no statistics significance in group HBeAg(-)/HBeAb(+)and group HBeAg(-)/HBeAb(-)，and had no correlation with ALT or AST.Conclusion HbeAg is the important index for reflecting HBV-DNA duplication and a positive HBeAg expresses an active duplicaˉtion of HBV-DNA.There is some limitation to reflect HBV-DNA duplication by using marker singly.So HBV-DNA content test is a most direct and reliabie index for reflecting HBV-DNA duplication and medicine curative efˉfect.There is no correlation between HBV-DNA duplication and ALT or AST level whether the virus duplication happens or not.
, 百拇医药
Key words hepatitis B virus HBV-DNA content serum marker mode
乙型肝炎是一种严重危害人类健康的世界性传染病，我国是乙型肝炎高发区。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测乙肝的多种血清标志物对乙肝诊治和预防有着重要的意义。随着分子生物学技术的发展，乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBV-DNA)检测已由过去的定性发展到定量。特别是近年来发展起来的荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)以其高度的灵敏性、特异性、精确性以及其操作简单、时间短、不易污染、自动化高等优点广泛应用于临床。我们应用FQ-PCR技术检测了867例乙肝患者血清的HBV-DNA含量，以探讨HBV-DNA含量与乙肝血清标志物表达的关系及HBV-DNA含量与肝细胞损害的关系。现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 标本来源 本院2003年5～12月门诊和住院患者867例，男498例，女369例，年龄3～72岁。
, http://www.100md.com
1.2 仪器 TC-25/H扩增仪、DA620荧光比色仪、日立7020全自动生化分析仪。
1.3 主要试剂 乙型肝炎病毒核酸荧光检测试剂盒由中山大学达安基因诊断中心提供，乙肝两对半试剂由上海实业科华生物技术有限公司提供，ALT、AST由上海复星长征医学科学有限公司提供。
1.4 方法 取病人当日空腹血，分为3管，分别作HBV-DNA定量、乙肝两对半、ALT、AST，严格按说明操作。
2 结果
见表1～3。
表1 867例HBV-DNA含量与HBV-M检测结果比较略
表2 HBV-DNA含量与HBeAg和HBeAb 的关系 (略)
, 百拇医药
表3 HBV-DNA含量与ALT、AST的关系 (略)
3 讨论
3.1 FQ-PCR是一种新的基因检测技术，已成为国内外病毒学、细菌学、病因病理学研究的重要工具。本技术是在定性PCR基础上增加了一条荧光探针，标记有荧光报告基团(R)和荧光淬灭基团(Q)，当荧光探针保持完整时，R的荧光信号被R所淬灭;而在PCR反应中，Taq酶将探针切断，R释放出荧光信号，检测其荧光信号强弱，可反映HBV-DNA的浓度 [1] 。FQ-PCR的整个操作过程仅需开盖一次，克服了定性PCR易污染、假阳性高、操作者要接触致癌物等不足，检测的准确性极高，可以反映HBV的真实感染和复制状况 [2，3] ，因而在临床上得到广泛应用。
3.2 用ELISA法作HBV-M是临床应用最广泛的诊断HBV感染、评价HBV传染性及预后的手段。本文中，HBV-DNA总阳性率以组别1、6(HBeAg阳性)最高，达95%以上，且HBV-DNA的含量对数为5.64±1.59，明显高于其他 组别。其次是级别2的HBV-DNA阳性率53.9%。HBV-DNA的含量对数为3.50±0.84。相对于组别1、6而言，其HBV-DNA复制欠活跃，HBV浓度稍低一些，传染性也差一些。
, http://www.100md.com
3.3 目前普遍将HBV-DNA的存在视为乙肝病毒复制的标志，且与肝病活动及传染性有关 [2] 。HBV-DNA阳性，即反映有复制完整的HBV-DNA颗粒，HBeAg是乙肝病毒中分子量为25000的核心蛋白，在内质网中，经蛋白酶消化前C蛋白的一部分及羧基端的一部分即形成HBeAg，并释放于血液中 [4] 。我们研究表明，HBeAg阳性组的HBV-DNA的含量明显高于HBeAg阴性组，采用两个大样本几何均数的U检验，U=17.22，P<0.01，差异有极显著性。而HBeAg阴性的两个组U=1.438，P>0.05，差异无显著性。
3.4 ALT、AST是反映肝细胞损害的重要指标。本研究表明，HBV-DNA的含量与ALT、AST不具相关性。
3.5 在本次研究中发现有少部分HBeAg阳性病例HBV-DNA的含量呈阴性，这可能是药物使HBV-DNA复制受抑制或试样中样本HBV-DNA丢失或引物对应的DNA序列变异。
, http://www.100md.com
参考文献
1 Liva K J，Flood SJA，Marmaro J，et al.01igonucletides with fluorscentdyesat opposite rnds provide a quenched probe system useful for detecting PCR product and hybridixation.PCR Methods Applic，1995，4:357-362.
2 Zanella I，Rossini A，Domenighini D，et al.Quantittive analysis of hepatitis C patients with occult HBV infection.Eru J Clin Microbiol Infect Dis，2002，21:22-26.
3 Jardi R，Rodriguez F，Buti M，et al.Quantitative detection of hepatitis Bvirus DNA in serum by a new rapid rral-time fluorescence PCR asˉsay.J Viral Hepat，2001，8:465-471.
4 唐珊熙.微生物学及微生物学检验，北京:人民卫生出版社，1998，386.
作者单位:718000陕西省榆林市第一医院检验科
(收稿日期:2004-02-12)
(编辑 罗彬), 百拇医药
关键词 乙型肝炎病毒 HBV-DNA的含量 血清标志物模式
【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2004)10-0903-02
, http://www.100md.com
Investigation of the correlation among HBV necleic acid level
serum markermode and hepatic cell damage
Ma Yafeng，Feng Haixiang，Li Yi.
Department of Laboratory，The1st Hospital of Yulin City，Shanxi718000.
【Abstract】 Objective To investigate the correlation among HBV-DNA content of hepatitis B patients，exˉpresson of their serur marker mode and hepatic cell damage conditions.Methods The HBV-DNA content of867hepatitis B patients were examined by complete closed tube PCR technique combined with fluorescence probe techˉnique，the serum marker by Enzyme-Linked Immunosorbent Assay(ELISA)，ALT andAST by rate method.Results The HBV-DNA content had an extremely significant difference among group HBeAg(+)/HBeAb(-)，group HBeAg(-)/HBeAb(+)and group HBeAg(-)/HBeAb(-)，but had no statistics significance in group HBeAg(-)/HBeAb(+)and group HBeAg(-)/HBeAb(-)，and had no correlation with ALT or AST.Conclusion HbeAg is the important index for reflecting HBV-DNA duplication and a positive HBeAg expresses an active duplicaˉtion of HBV-DNA.There is some limitation to reflect HBV-DNA duplication by using marker singly.So HBV-DNA content test is a most direct and reliabie index for reflecting HBV-DNA duplication and medicine curative efˉfect.There is no correlation between HBV-DNA duplication and ALT or AST level whether the virus duplication happens or not.
, 百拇医药
Key words hepatitis B virus HBV-DNA content serum marker mode
乙型肝炎是一种严重危害人类健康的世界性传染病，我国是乙型肝炎高发区。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测乙肝的多种血清标志物对乙肝诊治和预防有着重要的意义。随着分子生物学技术的发展，乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBV-DNA)检测已由过去的定性发展到定量。特别是近年来发展起来的荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)以其高度的灵敏性、特异性、精确性以及其操作简单、时间短、不易污染、自动化高等优点广泛应用于临床。我们应用FQ-PCR技术检测了867例乙肝患者血清的HBV-DNA含量，以探讨HBV-DNA含量与乙肝血清标志物表达的关系及HBV-DNA含量与肝细胞损害的关系。现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 标本来源 本院2003年5～12月门诊和住院患者867例，男498例，女369例，年龄3～72岁。
, http://www.100md.com
1.2 仪器 TC-25/H扩增仪、DA620荧光比色仪、日立7020全自动生化分析仪。
1.3 主要试剂 乙型肝炎病毒核酸荧光检测试剂盒由中山大学达安基因诊断中心提供，乙肝两对半试剂由上海实业科华生物技术有限公司提供，ALT、AST由上海复星长征医学科学有限公司提供。
1.4 方法 取病人当日空腹血，分为3管，分别作HBV-DNA定量、乙肝两对半、ALT、AST，严格按说明操作。
2 结果
见表1～3。
表1 867例HBV-DNA含量与HBV-M检测结果比较略
表2 HBV-DNA含量与HBeAg和HBeAb 的关系 (略)
, 百拇医药
表3 HBV-DNA含量与ALT、AST的关系 (略)
3 讨论
3.1 FQ-PCR是一种新的基因检测技术，已成为国内外病毒学、细菌学、病因病理学研究的重要工具。本技术是在定性PCR基础上增加了一条荧光探针，标记有荧光报告基团(R)和荧光淬灭基团(Q)，当荧光探针保持完整时，R的荧光信号被R所淬灭;而在PCR反应中，Taq酶将探针切断，R释放出荧光信号，检测其荧光信号强弱，可反映HBV-DNA的浓度 [1] 。FQ-PCR的整个操作过程仅需开盖一次，克服了定性PCR易污染、假阳性高、操作者要接触致癌物等不足，检测的准确性极高，可以反映HBV的真实感染和复制状况 [2，3] ，因而在临床上得到广泛应用。
3.2 用ELISA法作HBV-M是临床应用最广泛的诊断HBV感染、评价HBV传染性及预后的手段。本文中，HBV-DNA总阳性率以组别1、6(HBeAg阳性)最高，达95%以上，且HBV-DNA的含量对数为5.64±1.59，明显高于其他 组别。其次是级别2的HBV-DNA阳性率53.9%。HBV-DNA的含量对数为3.50±0.84。相对于组别1、6而言，其HBV-DNA复制欠活跃，HBV浓度稍低一些，传染性也差一些。
, http://www.100md.com
3.3 目前普遍将HBV-DNA的存在视为乙肝病毒复制的标志，且与肝病活动及传染性有关 [2] 。HBV-DNA阳性，即反映有复制完整的HBV-DNA颗粒，HBeAg是乙肝病毒中分子量为25000的核心蛋白，在内质网中，经蛋白酶消化前C蛋白的一部分及羧基端的一部分即形成HBeAg，并释放于血液中 [4] 。我们研究表明，HBeAg阳性组的HBV-DNA的含量明显高于HBeAg阴性组，采用两个大样本几何均数的U检验，U=17.22，P<0.01，差异有极显著性。而HBeAg阴性的两个组U=1.438，P>0.05，差异无显著性。
3.4 ALT、AST是反映肝细胞损害的重要指标。本研究表明，HBV-DNA的含量与ALT、AST不具相关性。
3.5 在本次研究中发现有少部分HBeAg阳性病例HBV-DNA的含量呈阴性，这可能是药物使HBV-DNA复制受抑制或试样中样本HBV-DNA丢失或引物对应的DNA序列变异。
, http://www.100md.com
参考文献
1 Liva K J，Flood SJA，Marmaro J，et al.01igonucletides with fluorscentdyesat opposite rnds provide a quenched probe system useful for detecting PCR product and hybridixation.PCR Methods Applic，1995，4:357-362.
2 Zanella I，Rossini A，Domenighini D，et al.Quantittive analysis of hepatitis C patients with occult HBV infection.Eru J Clin Microbiol Infect Dis，2002，21:22-26.
3 Jardi R，Rodriguez F，Buti M，et al.Quantitative detection of hepatitis Bvirus DNA in serum by a new rapid rral-time fluorescence PCR asˉsay.J Viral Hepat，2001，8:465-471.
4 唐珊熙.微生物学及微生物学检验，北京:人民卫生出版社，1998，386.
作者单位:718000陕西省榆林市第一医院检验科
(收稿日期:2004-02-12)
(编辑 罗彬), 百拇医药