无血清培养基对体外激活的A-NK细胞的支持作用(基金项目)
基金项目:本课题受国家“九五”重点攻关课题(96-960A-01-20)和黑龙江省重点攻关课题(G00C190401)资助
【摘要】 目的 研究多方面比较无血清培养基AIMV与完全培养基对体外细胞因子激活的NK细胞的支持作用。方法 分别用AIMV及完全培养基培养粘附NK细胞(A-NK)和非粘附NK细胞(NA-NK)，比较细胞的增殖能力、杀伤肿瘤细胞的能力、表达粘附分子CD11 c 的能力，并通过电镜对A-NK细胞所杀伤的肿瘤细胞进行形态学观察。结果 与完全培养基培养细胞相比，AIMV培养细胞增殖能力、杀伤肿瘤细胞的能力、表达CD11 c 的能力与之相当;在同一培养条件下A-NK细胞的增殖能力、杀伤活性及表达CD11 c 的能力明显强于NA-NK细胞;被A-NK细胞杀伤的肿瘤细胞死亡形式是溶解坏死和凋亡。结论 无血清培养基可替代完全培养基用于A-NK细胞的培养;A-NK细胞用于治疗肿瘤的过继免疫疗法要优于NA-NK细胞。
关键词 粘附NK细胞 无血清培养基 细胞培养 四甲基偶氮唑盐比色法
, http://www.100md.com
【文献标识码】A 【文章编号】 1606-8106(2004)10-0865-03
The culturing of IL-2-activated natural killer cells were
suported with serum-free medium AIMV in vitro
Wang Zhihua，Zhang Yan，Zhang Chunyan
Cancer Research Institute，Harbin Medical University，Harbin150040.
【Abstract】 Objective To compare serum-free medium AIMV with standard serum-containing medium in culturing IL-2-activated natural killer cells in vitro.Methods Proliferation，cytotoxicity in vitro and expression of CD11 c of the cells cultured in the two different media were compared.To observe the tumor target cells killed by adˉherent natural killer cells(A-NK)through electroscope.Results Cells cultured in serum-free medium AIMV could proliferate，kill target cellsand express CD11 c well enough to substitute the cells cultured in standard serum-containing medium.Proliferation，cytotoxicity and expression of CD11 c of A-NK were better than nonadherent natural killer cells(NA-NK).Death patterns of tumor target cells were necrosis and apoptosis.Conclusion These data indiˉcate that serum-free medium AIMV could replace standard serum-containing medium in culturing IL-2-activated natural killer cells in vitro，and A-NK was the better cells than NA-NK in adoptive immunotherapy.
, 百拇医药
Key words adherent natural killer cell serum-free medium cell culture MTT-assay
NK细胞是表型和功能上的异质性群体，根据在22nM(6000IU/ml)IL-2诱导下3～5h迅速粘附到塑料表面的能力，可将NK细胞分为两种不同的亚群:粘附NK细胞(adˉherent natural killer cell，A-NK)和非粘附NK细胞(nonadherˉent natural killer cell，NA-NK)。A-NK细胞代表外周血淋巴细胞的一小部分(4%～30%)，由于其体外增殖和抗肿瘤能力强，对正常细胞无杀伤作用等优点，成为近年来肿瘤过继免疫疗法的研究热点。现在临床上常用于细胞培养的完全培养基，因含有人AB血清，虽经各种病毒的检测，但仍有可能传播其他疾病，而无血清培养基则可达到生物洁净要求，克服了添加人AB血清的缺点，对于免疫治疗的临床推广应用有重要意义。本研究力求找到一种新的方法，发展无血清培养基用于A-NK细胞的临床生物治疗，即不减少A-NK细胞的数量和活性，又能增加其临床应用的安全性。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 主要试剂与材料 rhIL-2为南京军区军事医学研究所产品;淋巴细胞分离液、苯丙胺酸甲酯(PME)、四甲基偶氮唑盐(MTT)为Sigma公司产品;PE标记的鼠抗人CD11 c 为美国Becton-Dickinson公司产品;RPMI1640培养液及无血清培养液AIMV为美国Gibco公司产品;人AB血清由哈尔滨市红十字中心血站提供，用于人A-NK细胞培养;胎牛血清为美国Hyclone公司产品，用于肿瘤细胞培养;人肺腺癌细胞Anip973和人红白血病细胞K562由本研究所建株传代。所用塑料培养瓶和培养板均为美国Costar公司产品，培养条件为37℃、5%CO 2 饱和湿化空气的培养箱中建立培养。酶标仪为BioRAU，450型，美国制造。
1.2 人外周血单个核细胞的制备 淋巴细胞分离液常规分离健康人的外周血单个核细胞，充分洗涤后，置于塑料离心管中用PME(5mmol/L)室温处理40min后充分洗涤备用。
, 百拇医药
1.3 A-NK细胞的诱导 用PME处理后的人外周血单个核细胞分别用完全培养基(RPMI1640，含10%人AB血清，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素)和无血清培养基AIMV在塑料培养瓶内培养，每组加rhIL-2(6000IU/ml)并调整细胞浓度为5×10 6 /ml。培养3～5h，移去含未粘附塑料表面的细胞悬液(即NA-NK细胞)，收集粘附于塑料表面的细胞(即A-NK细胞)，分别重悬于各自含50%自体条件培养基的培养液中，调成细胞浓度为2×10 6 /ml，同时补充IL-2，细胞至终浓度为6000IU/ml，继续培养，每3天补充新鲜培养液和IL-2，细胞浓度和IL-2终浓度不变 [1] 。
1.4 细胞增殖活性的测定 采用改进的四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法 [2] 。于培养的第1，4，7，10和第14天分别取细胞，充分洗涤，以1×10 6 /ml浓度加入96孔平底板中，每孔0.2ml，设3个复孔，培养箱中培养48h后，每孔加MTT(5mg/ml)20μl，继续培养4h，然后翻板，每孔滴加100μl二甲基亚砜(DMSO)轻轻振荡10min后在酶标仪上570nm处测定吸光度(OD值)，取3孔均值，OD值高则增殖快。
, 百拇医药
1.5 细胞杀伤活性的测定 采用MTT法进行免疫活性细胞的细胞毒性测定。靶细胞为Anip973和K562肿瘤细胞，效应细胞为完全培养基和AIMV分别培养的A-NK细胞和NA-NK细胞，效靶比例为100:1。设立效应细胞和靶细胞共同孵育孔(E+T)，效应细胞对照孔(E)和靶细胞对照孔(T)，每组设3个复孔，操作方法同1.4。测定的OD值，取3孔均值，公式如下 [2] :细胞杀伤活性(%)=[1+(OD E+T -OD E )/OD T ]×100
1.6 细胞表型分析 细胞诱导3～5h后，分别收集完全培养基和AIMV培养的A-NK细胞和NA-NK细胞，按5×10 5 个细胞/管，用美国Becton-Dickinson公司的流式细胞 仪检测并分析CD11 c 的表达。
1.7 透射电镜标本制备 在培养瓶中将A-NK细胞和K562肿瘤细胞共同培养，过夜，第二天取出离心(4000rpm×5min)，用3%戊二醛固定30min(37℃)后按常规处理电镜标本。
, 百拇医药
1.8 统计学方法 采用样本均数的t检验。
2 结果
2.1 AIMV与完全培养基培养细胞增殖能力的比较 实验表明，除了第10天AIMV培养的A-NK细胞测得的OD值明显低于完全培养基培养的A-NK细胞外(P<0.01)，其他时间AIMV与完全培养基培养细胞的增殖能力相当，并无统计学意义;AIMV和完全培养基培养的A-NK细胞均大量增殖，OD值明显高于同一培养条件下的NA-NK细胞;不同条件培养的细胞均在第7天达到增殖高峰，结果见表1。
2.2 AIMV与完全培养基培养细胞体外杀伤肿瘤细胞能力的比较 AIMV与完全培养基培养细胞体外杀伤肿瘤细胞的能力相当，并无统计学意义;在同一培养条件下培养的A-NK细胞，其杀伤活性明显高于NA-NK细胞;IL-2诱导的第7天是细胞杀伤活性的高峰期，结果见图1。
表1 AIMV与完全培养基培养细胞OD值的比较
, 百拇医药
图1 AIMV与完全培养基培养细胞杀伤活性的比较
2.3 AIMV与完全培养基培养细胞表达CD11 c 能力的比较AIMV与完全培养基培养细胞24h后表达CD11 c 的细胞百分数相当;在同一培养条件下培养A-NK细胞表达CD11 c 的能力要高于NA-NK细胞。
2.4 透射电镜结果 透射电镜下可见A-NK细胞在靶细 胞周围形成花环，部分细胞变形，形成的突起或微绒毛伸向靶细胞，呈点状或斑状接触。溶解坏死的肿瘤细胞，细胞内浆网肿胀，线粒体内外膜分离，胞质中出现空泡变性，核染色质破碎，核膜质膜破裂，最终细胞崩解;凋亡的肿瘤细胞，可见核染色质固缩、偏移，形成典型的致密月牙槽形聚集在核膜内侧面，基质水肿变性，但核膜质膜完整。
3 讨论
本实验在制备A-NK细胞的方法上力求简便快速，利用NK细胞在22nM(6000IU/ml)IL-2诱导下，能在3～5h迅速粘附到塑料表面上的这一特性，将收集细胞的时间缩小到3～5h[1] 。由于以往采用尼龙毛柱过滤，操作复杂而难以推广应用，我们采用PME(5mmol/L)室温处理40min，以去除人外周血中某些抑制因素，如B细胞和单核巨噬细胞 [3] 。无血清培养基已经得到越来越广泛的应用，如血源性细胞的培养、真核系统中重组蛋白的表达、病毒及寄生虫的繁殖等各个方面。多数研究表明，无血清培养基可替代含血清的完全培养基，二者所得培养物的数目和功能相当 [4～7] 。从我们的实验结果中可以看出，虽然AIMV培养细胞的增殖速度略低于完全培养基培养细胞的增殖速度，但并无统计学意义，仅在第10天用完全培养基培养的细胞仍具有很强的增殖能力(见表1)。
, 百拇医药
在测定细胞杀伤活性的实验中，我们选择了两种靶细胞:人肺腺癌细胞Anip973是NK非敏感细胞系;人红白血病细胞K562是NK敏感细胞系。从图1A、B显示，无论是AIMV还是完全培养基，这两组靶细胞对A-NK细胞的敏感性无明显差异，说明AIMV替代完全培养基用于A-NK细胞的培养，对A-NK细胞的杀伤活性也无明显影响，并且被IL-2激活后的A-NK细胞有更强的杀伤肿瘤作用，其杀伤范围也扩大了。本实验方法培养的A-NK细胞增殖高峰和杀伤活性的高峰期均在第7天，对将来应用于临床回输肿瘤病人，在时间上有一定的指导意义。
A-NK细胞表面有多种复杂的粘附分子(CAM)存在，并与其生物学活性息息相关:粘附血管内皮、浸润细胞外间质、杀伤肿瘤细胞，这些功能均以“粘附”为基础。Melder等报道，A-NK细胞经IL-2诱导24h，CD11 c 和CD11 a 抗原的表达增加，抗CAM单抗能不同程度地抑制A-NK细胞的粘附，其中抗CD11 c 单抗抑制水平最高 [8～10] 。本实验对AIMV与完全培养基培养细胞表达CD11 c 的能力进行比较，说明AIMV完全可以替代完全培养基培养细胞而不影响细胞的粘附性。A-NK细胞的粘附性强于NA-NK细胞，这也解释了在培养细胞中我们所看到的:A-NK细胞半粘附瓶壁生长而NA-NK细胞悬浮生长现象。是否因为NA-NK细胞“粘附”功能弱，不易与肿瘤细胞结合而发挥抗肿瘤作用，所以NA-NK细胞杀伤肿瘤细胞活性低于A-NK细胞，这还有待于进一步研究。
, http://www.100md.com
A-NK细胞的抗肿瘤作用机理复杂，可能通过不同的机制杀伤瘤细胞:(1)由穿孔素/粒酶介导的肿瘤细胞溶解性坏死;(2)A-NK细胞直接与肿瘤细胞接触，由A-NK细胞表面的膜型TNF介导瘤细胞的凋亡或A-NK细胞释放的分泌型TNF间接介导瘤细胞的凋亡;(3)A-NK细胞破坏或活化肿瘤微血管系统，导致其他效应细胞和细胞毒分子渗出到肿瘤组织，引起肿瘤的出血坏死 [11～13] 。在我们的 实验中，通过透射电镜对A-NK细胞杀伤肿瘤细胞进行形态学观察，瘤细胞的死亡形式为溶解坏死(necrosis)和凋亡坏死(apoptosis)两种，说明A-NK细胞杀伤肿瘤细胞是通过多种机制完成的。
在国外，用A-NK细胞对晚期恶性实体瘤进行过继免疫治疗已用于临床试验，具有很好的临床应用前景 [1] ，本研究为A-NK细胞的进一步研究和临床的应用推广提供了一定的理论依据。
参考文献
, http://www.100md.com
1 Lister J，Rybka WB，Donnenberg AD，et al.Autologous peripheral blood stemcell transplantation and adoptive immunotherapywith activated natˉural killer cells in the immediate posttransplant period.Clin Cancer Res，1995，1(6):607-614.
2 李杰，刘玉琴.MTT法在肿瘤研究中的改良及应用进展.中国肿瘤临床，1998，25(4):312-313.
3 Triozzi PL，Aldrich W，Kim J，et al.Biologic effects of the adoptive transfer of cells depleted of monocytes with L-phenylalanine methyl esˉter.Immunopharmacology，1994，28(1):39-45.
, 百拇医药
4 Kambe N，Kambe M，Chang HW，et al.An improved procedure for the development of human mast cells from dispersed fetal liver cells in serum-free culture medium.J Immunol Methods，2000，240(1-2):101-110.
5 Bulter M，Burgener A，Patrick M，et al.Application of a serum-free medium for the growth of Vero cells and the production of reovirus.Biotechnol Prog，2000，16(5):854-858.
6 Lee GM，Kim EJ，Kim NS，et al.Development of a serum-free medium for the production of erythropoietin by suspension culture of recombinant chinese hamsterovary cells using a statistical design.J Biotechnol，1999，69(2-3):85-93.
, 百拇医药
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, 百拇医药
10 Melder RJ，Walker E，Herberman RB，et al.Adhesion characteristics of human interleukin2-activated natural killer cells.Cell Immunol，1991，132(1):177-192.
11 Vujanovic NL，Yasumura S，Hirabayashi H，et al.Antitumor activities of subsets of human IL-2activated matural killer cells in solid tisˉsues.J Immunol，1995，154(1):281-289.
12 Whiteside TL，Herberman RB.The role of natural killer cells in imˉmune surveillance of cancer.Curr Opin Immunol，1995，7(5):704-710.
13 Yamauchi A，Taga K，Mostowski HS，et al.Target cell-induced apopˉtosis of interleukin2-activated matural killer cells:roles of surface molecules and intracellular events.Blood，1996，87(12):5127-5135.
作者单位:150040黑龙江哈尔滨医科大学肿瘤研究所
(编辑曲 全), http://www.100md.com
【摘要】 目的 研究多方面比较无血清培养基AIMV与完全培养基对体外细胞因子激活的NK细胞的支持作用。方法 分别用AIMV及完全培养基培养粘附NK细胞(A-NK)和非粘附NK细胞(NA-NK)，比较细胞的增殖能力、杀伤肿瘤细胞的能力、表达粘附分子CD11 c 的能力，并通过电镜对A-NK细胞所杀伤的肿瘤细胞进行形态学观察。结果 与完全培养基培养细胞相比，AIMV培养细胞增殖能力、杀伤肿瘤细胞的能力、表达CD11 c 的能力与之相当;在同一培养条件下A-NK细胞的增殖能力、杀伤活性及表达CD11 c 的能力明显强于NA-NK细胞;被A-NK细胞杀伤的肿瘤细胞死亡形式是溶解坏死和凋亡。结论 无血清培养基可替代完全培养基用于A-NK细胞的培养;A-NK细胞用于治疗肿瘤的过继免疫疗法要优于NA-NK细胞。
关键词 粘附NK细胞 无血清培养基 细胞培养 四甲基偶氮唑盐比色法
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【文献标识码】A 【文章编号】 1606-8106(2004)10-0865-03
The culturing of IL-2-activated natural killer cells were
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Wang Zhihua，Zhang Yan，Zhang Chunyan
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【Abstract】 Objective To compare serum-free medium AIMV with standard serum-containing medium in culturing IL-2-activated natural killer cells in vitro.Methods Proliferation，cytotoxicity in vitro and expression of CD11 c of the cells cultured in the two different media were compared.To observe the tumor target cells killed by adˉherent natural killer cells(A-NK)through electroscope.Results Cells cultured in serum-free medium AIMV could proliferate，kill target cellsand express CD11 c well enough to substitute the cells cultured in standard serum-containing medium.Proliferation，cytotoxicity and expression of CD11 c of A-NK were better than nonadherent natural killer cells(NA-NK).Death patterns of tumor target cells were necrosis and apoptosis.Conclusion These data indiˉcate that serum-free medium AIMV could replace standard serum-containing medium in culturing IL-2-activated natural killer cells in vitro，and A-NK was the better cells than NA-NK in adoptive immunotherapy.
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NK细胞是表型和功能上的异质性群体，根据在22nM(6000IU/ml)IL-2诱导下3～5h迅速粘附到塑料表面的能力，可将NK细胞分为两种不同的亚群:粘附NK细胞(adˉherent natural killer cell，A-NK)和非粘附NK细胞(nonadherˉent natural killer cell，NA-NK)。A-NK细胞代表外周血淋巴细胞的一小部分(4%～30%)，由于其体外增殖和抗肿瘤能力强，对正常细胞无杀伤作用等优点，成为近年来肿瘤过继免疫疗法的研究热点。现在临床上常用于细胞培养的完全培养基，因含有人AB血清，虽经各种病毒的检测，但仍有可能传播其他疾病，而无血清培养基则可达到生物洁净要求，克服了添加人AB血清的缺点，对于免疫治疗的临床推广应用有重要意义。本研究力求找到一种新的方法，发展无血清培养基用于A-NK细胞的临床生物治疗，即不减少A-NK细胞的数量和活性，又能增加其临床应用的安全性。
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1 材料与方法
1.1 主要试剂与材料 rhIL-2为南京军区军事医学研究所产品;淋巴细胞分离液、苯丙胺酸甲酯(PME)、四甲基偶氮唑盐(MTT)为Sigma公司产品;PE标记的鼠抗人CD11 c 为美国Becton-Dickinson公司产品;RPMI1640培养液及无血清培养液AIMV为美国Gibco公司产品;人AB血清由哈尔滨市红十字中心血站提供，用于人A-NK细胞培养;胎牛血清为美国Hyclone公司产品，用于肿瘤细胞培养;人肺腺癌细胞Anip973和人红白血病细胞K562由本研究所建株传代。所用塑料培养瓶和培养板均为美国Costar公司产品，培养条件为37℃、5%CO 2 饱和湿化空气的培养箱中建立培养。酶标仪为BioRAU，450型，美国制造。
1.2 人外周血单个核细胞的制备 淋巴细胞分离液常规分离健康人的外周血单个核细胞，充分洗涤后，置于塑料离心管中用PME(5mmol/L)室温处理40min后充分洗涤备用。
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1.3 A-NK细胞的诱导 用PME处理后的人外周血单个核细胞分别用完全培养基(RPMI1640，含10%人AB血清，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素)和无血清培养基AIMV在塑料培养瓶内培养，每组加rhIL-2(6000IU/ml)并调整细胞浓度为5×10 6 /ml。培养3～5h，移去含未粘附塑料表面的细胞悬液(即NA-NK细胞)，收集粘附于塑料表面的细胞(即A-NK细胞)，分别重悬于各自含50%自体条件培养基的培养液中，调成细胞浓度为2×10 6 /ml，同时补充IL-2，细胞至终浓度为6000IU/ml，继续培养，每3天补充新鲜培养液和IL-2，细胞浓度和IL-2终浓度不变 [1] 。
1.4 细胞增殖活性的测定 采用改进的四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法 [2] 。于培养的第1，4，7，10和第14天分别取细胞，充分洗涤，以1×10 6 /ml浓度加入96孔平底板中，每孔0.2ml，设3个复孔，培养箱中培养48h后，每孔加MTT(5mg/ml)20μl，继续培养4h，然后翻板，每孔滴加100μl二甲基亚砜(DMSO)轻轻振荡10min后在酶标仪上570nm处测定吸光度(OD值)，取3孔均值，OD值高则增殖快。
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1.5 细胞杀伤活性的测定 采用MTT法进行免疫活性细胞的细胞毒性测定。靶细胞为Anip973和K562肿瘤细胞，效应细胞为完全培养基和AIMV分别培养的A-NK细胞和NA-NK细胞，效靶比例为100:1。设立效应细胞和靶细胞共同孵育孔(E+T)，效应细胞对照孔(E)和靶细胞对照孔(T)，每组设3个复孔，操作方法同1.4。测定的OD值，取3孔均值，公式如下 [2] :细胞杀伤活性(%)=[1+(OD E+T -OD E )/OD T ]×100
1.6 细胞表型分析 细胞诱导3～5h后，分别收集完全培养基和AIMV培养的A-NK细胞和NA-NK细胞，按5×10 5 个细胞/管，用美国Becton-Dickinson公司的流式细胞 仪检测并分析CD11 c 的表达。
1.7 透射电镜标本制备 在培养瓶中将A-NK细胞和K562肿瘤细胞共同培养，过夜，第二天取出离心(4000rpm×5min)，用3%戊二醛固定30min(37℃)后按常规处理电镜标本。
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1.8 统计学方法 采用样本均数的t检验。
2 结果
2.1 AIMV与完全培养基培养细胞增殖能力的比较 实验表明，除了第10天AIMV培养的A-NK细胞测得的OD值明显低于完全培养基培养的A-NK细胞外(P<0.01)，其他时间AIMV与完全培养基培养细胞的增殖能力相当，并无统计学意义;AIMV和完全培养基培养的A-NK细胞均大量增殖，OD值明显高于同一培养条件下的NA-NK细胞;不同条件培养的细胞均在第7天达到增殖高峰，结果见表1。
2.2 AIMV与完全培养基培养细胞体外杀伤肿瘤细胞能力的比较 AIMV与完全培养基培养细胞体外杀伤肿瘤细胞的能力相当，并无统计学意义;在同一培养条件下培养的A-NK细胞，其杀伤活性明显高于NA-NK细胞;IL-2诱导的第7天是细胞杀伤活性的高峰期，结果见图1。
表1 AIMV与完全培养基培养细胞OD值的比较
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图1 AIMV与完全培养基培养细胞杀伤活性的比较
2.3 AIMV与完全培养基培养细胞表达CD11 c 能力的比较AIMV与完全培养基培养细胞24h后表达CD11 c 的细胞百分数相当;在同一培养条件下培养A-NK细胞表达CD11 c 的能力要高于NA-NK细胞。
2.4 透射电镜结果 透射电镜下可见A-NK细胞在靶细 胞周围形成花环，部分细胞变形，形成的突起或微绒毛伸向靶细胞，呈点状或斑状接触。溶解坏死的肿瘤细胞，细胞内浆网肿胀，线粒体内外膜分离，胞质中出现空泡变性，核染色质破碎，核膜质膜破裂，最终细胞崩解;凋亡的肿瘤细胞，可见核染色质固缩、偏移，形成典型的致密月牙槽形聚集在核膜内侧面，基质水肿变性，但核膜质膜完整。
3 讨论
本实验在制备A-NK细胞的方法上力求简便快速，利用NK细胞在22nM(6000IU/ml)IL-2诱导下，能在3～5h迅速粘附到塑料表面上的这一特性，将收集细胞的时间缩小到3～5h[1] 。由于以往采用尼龙毛柱过滤，操作复杂而难以推广应用，我们采用PME(5mmol/L)室温处理40min，以去除人外周血中某些抑制因素，如B细胞和单核巨噬细胞 [3] 。无血清培养基已经得到越来越广泛的应用，如血源性细胞的培养、真核系统中重组蛋白的表达、病毒及寄生虫的繁殖等各个方面。多数研究表明，无血清培养基可替代含血清的完全培养基，二者所得培养物的数目和功能相当 [4～7] 。从我们的实验结果中可以看出，虽然AIMV培养细胞的增殖速度略低于完全培养基培养细胞的增殖速度，但并无统计学意义，仅在第10天用完全培养基培养的细胞仍具有很强的增殖能力(见表1)。
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在测定细胞杀伤活性的实验中，我们选择了两种靶细胞:人肺腺癌细胞Anip973是NK非敏感细胞系;人红白血病细胞K562是NK敏感细胞系。从图1A、B显示，无论是AIMV还是完全培养基，这两组靶细胞对A-NK细胞的敏感性无明显差异，说明AIMV替代完全培养基用于A-NK细胞的培养，对A-NK细胞的杀伤活性也无明显影响，并且被IL-2激活后的A-NK细胞有更强的杀伤肿瘤作用，其杀伤范围也扩大了。本实验方法培养的A-NK细胞增殖高峰和杀伤活性的高峰期均在第7天，对将来应用于临床回输肿瘤病人，在时间上有一定的指导意义。
A-NK细胞表面有多种复杂的粘附分子(CAM)存在，并与其生物学活性息息相关:粘附血管内皮、浸润细胞外间质、杀伤肿瘤细胞，这些功能均以“粘附”为基础。Melder等报道，A-NK细胞经IL-2诱导24h，CD11 c 和CD11 a 抗原的表达增加，抗CAM单抗能不同程度地抑制A-NK细胞的粘附，其中抗CD11 c 单抗抑制水平最高 [8～10] 。本实验对AIMV与完全培养基培养细胞表达CD11 c 的能力进行比较，说明AIMV完全可以替代完全培养基培养细胞而不影响细胞的粘附性。A-NK细胞的粘附性强于NA-NK细胞，这也解释了在培养细胞中我们所看到的:A-NK细胞半粘附瓶壁生长而NA-NK细胞悬浮生长现象。是否因为NA-NK细胞“粘附”功能弱，不易与肿瘤细胞结合而发挥抗肿瘤作用，所以NA-NK细胞杀伤肿瘤细胞活性低于A-NK细胞，这还有待于进一步研究。
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A-NK细胞的抗肿瘤作用机理复杂，可能通过不同的机制杀伤瘤细胞:(1)由穿孔素/粒酶介导的肿瘤细胞溶解性坏死;(2)A-NK细胞直接与肿瘤细胞接触，由A-NK细胞表面的膜型TNF介导瘤细胞的凋亡或A-NK细胞释放的分泌型TNF间接介导瘤细胞的凋亡;(3)A-NK细胞破坏或活化肿瘤微血管系统，导致其他效应细胞和细胞毒分子渗出到肿瘤组织，引起肿瘤的出血坏死 [11～13] 。在我们的 实验中，通过透射电镜对A-NK细胞杀伤肿瘤细胞进行形态学观察，瘤细胞的死亡形式为溶解坏死(necrosis)和凋亡坏死(apoptosis)两种，说明A-NK细胞杀伤肿瘤细胞是通过多种机制完成的。
在国外，用A-NK细胞对晚期恶性实体瘤进行过继免疫治疗已用于临床试验，具有很好的临床应用前景 [1] ，本研究为A-NK细胞的进一步研究和临床的应用推广提供了一定的理论依据。
参考文献
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作者单位:150040黑龙江哈尔滨医科大学肿瘤研究所
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