清热凉血活血方对局灶节段性肾小球硬化大鼠肾脏的保护作用
【摘要】 目的 观察清热凉血活血方(简称中药方)在局灶节段性肾小球硬化大鼠模型中对残肾的保护作用并探讨其可能的机理。方法 采用局灶节段性肾小球硬化大鼠模型，分别给予清热凉血活血方20g·kg -1 ·d -1 ，雷公藤多苷片(20mg·kg -1 ·d -1 )。8周后观察大鼠24h尿蛋白定量，血尿素氮(BUN)，血肌酐(Scr)，血浆白蛋白(ALB)，血脂(CHOL、TRIG、HDL、LDL)以及肾脏病理改变。结果 两药均能减少尿蛋白，降低血尿素氮(BUN)，提高血浆白蛋白，改善脂质代谢。在肾脏病理上，局灶节段性肾小球硬化大鼠模型组可见局灶性肾间质纤维化，肾小球硬化，用药后病变减轻。其中应用中药方者减轻更为明显。结论 在局灶节段性肾小球硬化大鼠模型中，清热凉血活血方能通过抑制肾脏中的异常增殖，减少间质纤维化，肾小球硬化，并能减少蛋白尿，改善脂质代谢，从而明显减轻肾脏的损害。
关键词 中药方 局灶节段性肾小球硬化 动物模型
, 百拇医药
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2004)09-0800-03
Nephroprotective effect of Chinese traditional medicine(CTM)
on rat with focal segmen talglomeruloseclerosis
Zhou Qinghua，He Liqun，Tang liang，et al.
Pu Dong NewArea People’s Hospital Shanghai201200
【Abstract】 Objective To investigate the nephroprotective effect of(CTM)on focal segmental glomeruloseˉclerosis(FSGS)rat and explore its mechanism.Methods The SD rats were used.After the operation，20g/kg CTM，20mg/kg leigongteng were respectively delivered daily by gavage for8weeks.Renal function as well as urinary protein were measured at the end of the study and the renal pathological changes were evaluated also.Results Compared with the untreated group，urinary protein of CTM and leigongteng treated groups rats were substantially decreased，so was the UREA.Serum albumin significantly increased.Pathological study revealed that，compare with the untreated group，there were less glomerular matrix and renal interstitial fibrosis.Conclusion CTM can inhibit glomerular matrix and renal interstitial fibrosis.CTM significantly prevents renal injury following focal segmental glomeruloseclerosis.Key words CTM focal segmental glomeruloseclerosis animal model
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清热凉血活血方是我院经多年临床应用的处方。由连翘、鱼腥草、白花蛇舌草、粉丹皮、粉川芎、益母草、云茯苓配伍而成，具有清热解毒、凉血活血、利湿的功效。多年来临床治疗慢性肾炎有较好疗效。本研究目的在于探讨清热凉血活血方对局灶节段性肾小球硬化大鼠残肾的保护作用，并探讨其可能的机理。
1 材料与方法
1.1 实验动物 选取成年雄性SD大鼠19只，体重200～250g(购自中国科学院实验动物中心)。本研究采用单侧肾结扎合并阿霉素静脉2次注射造模。用2%戊巴比妥钠50mg/kg腹腔注射，待大鼠麻醉后，将其置于温暖手术台上，经侧腹部切口，暴露左侧肾脏，行左肾结扎术，术后第一周阿霉素4mg/kg尾静脉注射。于第一次阿霉素注射后72h留取24h蛋白尿，根据造模成功后的24h尿蛋白定量值，分模型组、治疗组及对照组，保证各组治疗前24h蛋白尿值无显著差异。其中模型组6只，治疗组6只，用清热凉血活血方治疗;对照组7只，用雷公藤多苷片治疗。根据人鼠剂量换算约为人剂量的20倍，分别予中药方(CTM，20g·kg -1 ·d -1 )，雷公藤(20mg·kg -1 ·d -1 )。分组后开始经胃给药，每日一次，至第8周末。于第7周末重复注射阿霉素2mg/kg，于第8周末，将大鼠置于清洁的代谢笼中，留取24h尿液，测尿量，然后将大鼠称重，予2%戊巴比妥钠50mg/kg腹腔注射，待大鼠麻醉后，沿大鼠腹腔正中线剪开，经腹主动脉采血。摘取残肾，称肾重，部分肾组织置于10%中性福尔马林溶液中以便制作石蜡切片。
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1.2 血、尿生化免疫检测 尿样经尿蛋白定量液滴定后，用722光栅分光光度计，进行光比色定量分析;血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)、血浆白蛋白(ALB)、血脂(HDL、CHOL、TRIG、LDL)用全自动生化分析仪(型号:ABBOTT-AREˉOSET)进行分析。
1.3 肾脏病理检查 所用标本按常规方法固定、包埋，切片厚4μm，行HE染色。每张切片在20倍目镜下至少观察20个完整的肾小球。
1.4 统计学方法 计算数据用ˉx±s表示，组间比较采用单因素方差分析。用SPSS11.5统计软件进行统计分析。
2 结果
2.1 各组指标检测结果 造模成功后，各组大鼠蛋白尿均明显增加。和正常组比，P<0.001。经治疗，中药组和雷公藤组均较病理组蛋白尿明显减少，差异有显著性。中药组比雷公藤组有更明显的降蛋白尿的作用，二者之间差异有非常显著性(P<0.001)。同时血浆白蛋白于治疗后明显增高，各治疗组较之病理组差异均有显著性，但中药组与雷公藤组之间，差异无显著性。BUN在中药组和雷公藤组均较治疗前有变化，且差异均有显著性。BUN、CHOL、HDL、LDL 在中药组和雷公藤组均较治疗前有变化，且差异均有显著性，但二组之间差异无显著性。Scr、TRIG各治疗组较之病理组差异均无显著性。见表1、2。
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2.2 肾组织病理改变 病理组大鼠可见明显肾小球增生、肥大，系膜细胞及间质增殖，局灶节段性肾小球硬化，间质纤维化并有淋巴细胞浸润，部分肾小管内可见蛋白管型(见图1～2)。用药后各组肾小球增生、肥大、硬化均明显减轻，间质纤维化减少。其中中药组各种病变减轻更为明显(中药组见图3～4，雷公藤组见图5～6)。
表1 CTM和雷公藤对肾功能和尿蛋白定量的影响 略
表2 CTM和雷公藤对血脂的影响 略
3 讨论
局灶节段性肾小球硬化呈进行性发展的过程，预后较差，最终发展到肾功能衰竭。其发病机制，既往认为肾小管上皮细胞大量重吸收尿蛋白，可刺激肾小管上皮细胞增殖分泌细胞外基质蛋白，合成炎症趋化因子而使肾小管间质损伤;高血脂，特别是肾小球局部的脂质代谢异常、脂质沉积可引起肾小球内皮细胞损伤，释放细胞因子，刺激细胞外基质的生成而导致局灶节段性肾小球硬化 [1] 。有报道称，尿蛋白在肾小管上皮细胞内的过度穿梭对淋巴细胞的浸润和纤维化有诱导作用 [2] 。而肾小管间质病变程度较肾小球更能影响肾脏存活率。尿蛋白的减少，可能有助于减少淋巴细胞的浸润，从而有助于减轻肾脏的病变。
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图1 (HE染色，200倍)可见肾小球局灶硬化，囊壁与间质纤维化 略
图2 (HE染色，200倍)肾间质纤维化，伴有大量中性粒细胞及淋巴细胞浸润 略
图3 (HE染色，200倍)肾小球囊壁及间质纤维化伴蛋白管型，炎性细胞浸润 略
图4 (HE染色，200倍)肾小球轻度肥大伴纤维化，间质纤维化 略
图5 (HE染色，200倍)肾小球硬化，囊壁纤维化，炎性细胞浸润，伴蛋白管型 略
单侧肾结扎合并阿霉素2次注射诱导模型，目前被认为是成熟的局灶节段性肾小球硬化大鼠模型。其病理学特点与人类肾小球硬化的发病过程类似。在残肾间质中有大量淋巴细胞集聚，提示它可能在残肾的纤维化中起重要作
图6 (HE染色，40倍)肾小球局灶硬化，间质纤维化，伴蛋白管型 略
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用。因此，我们选择该模型，期望清热凉血活血方能在该模型中延缓肾脏病变，并探讨其可能的作用机制。
我们发现，应用清热凉血活血方后，该模型大鼠蛋白尿明显减少，BUN、CHOL、HDL、LDL显著降低，且差异有显著性;在病理上，肾间质纤维化和肾小球硬化程度明显减轻，范围缩小。且较对照组更为显著。
综上所述，我们认为，在局灶节段性肾小球硬化大鼠模型中，清热凉血活血方能通过抑制肾脏组织的异常增殖，减少间质纤维化，肾小球硬化。减少蛋白尿、改善脂质代谢，从而明显减轻肾脏的损害。由于中药方具有明显降低蛋白尿，改善脂质代谢的作用，在病理上对肾小球硬化有明显的阻抑作用，因而它可能作为一种很有前景的延缓慢性肾损害向终末期肾病演进的药物，值得进一步深入研究。
参考文献
1 林善锬.当代肾脏病学.上海:上海科技教育出版社，2001，490-1200.
2 朱忠华，张春，邓安国，等.霉酚酸酯抑制大鼠肾间质纤维化的研究。中华肾脏病杂志
，2002，4(18):295-297.
作者单位:1 201200上海浦东新区人民医院
2 200021上海中医药大学附属曙光医院肾内科
3 200040上海交通大学附属儿童医院
4 200032上海中医药大学
(编辑 曲全), 百拇医药
关键词 中药方 局灶节段性肾小球硬化 动物模型
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【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2004)09-0800-03
Nephroprotective effect of Chinese traditional medicine(CTM)
on rat with focal segmen talglomeruloseclerosis
Zhou Qinghua，He Liqun，Tang liang，et al.
Pu Dong NewArea People’s Hospital Shanghai201200
【Abstract】 Objective To investigate the nephroprotective effect of(CTM)on focal segmental glomeruloseˉclerosis(FSGS)rat and explore its mechanism.Methods The SD rats were used.After the operation，20g/kg CTM，20mg/kg leigongteng were respectively delivered daily by gavage for8weeks.Renal function as well as urinary protein were measured at the end of the study and the renal pathological changes were evaluated also.Results Compared with the untreated group，urinary protein of CTM and leigongteng treated groups rats were substantially decreased，so was the UREA.Serum albumin significantly increased.Pathological study revealed that，compare with the untreated group，there were less glomerular matrix and renal interstitial fibrosis.Conclusion CTM can inhibit glomerular matrix and renal interstitial fibrosis.CTM significantly prevents renal injury following focal segmental glomeruloseclerosis.Key words CTM focal segmental glomeruloseclerosis animal model
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清热凉血活血方是我院经多年临床应用的处方。由连翘、鱼腥草、白花蛇舌草、粉丹皮、粉川芎、益母草、云茯苓配伍而成，具有清热解毒、凉血活血、利湿的功效。多年来临床治疗慢性肾炎有较好疗效。本研究目的在于探讨清热凉血活血方对局灶节段性肾小球硬化大鼠残肾的保护作用，并探讨其可能的机理。
1 材料与方法
1.1 实验动物 选取成年雄性SD大鼠19只，体重200～250g(购自中国科学院实验动物中心)。本研究采用单侧肾结扎合并阿霉素静脉2次注射造模。用2%戊巴比妥钠50mg/kg腹腔注射，待大鼠麻醉后，将其置于温暖手术台上，经侧腹部切口，暴露左侧肾脏，行左肾结扎术，术后第一周阿霉素4mg/kg尾静脉注射。于第一次阿霉素注射后72h留取24h蛋白尿，根据造模成功后的24h尿蛋白定量值，分模型组、治疗组及对照组，保证各组治疗前24h蛋白尿值无显著差异。其中模型组6只，治疗组6只，用清热凉血活血方治疗;对照组7只，用雷公藤多苷片治疗。根据人鼠剂量换算约为人剂量的20倍，分别予中药方(CTM，20g·kg -1 ·d -1 )，雷公藤(20mg·kg -1 ·d -1 )。分组后开始经胃给药，每日一次，至第8周末。于第7周末重复注射阿霉素2mg/kg，于第8周末，将大鼠置于清洁的代谢笼中，留取24h尿液，测尿量，然后将大鼠称重，予2%戊巴比妥钠50mg/kg腹腔注射，待大鼠麻醉后，沿大鼠腹腔正中线剪开，经腹主动脉采血。摘取残肾，称肾重，部分肾组织置于10%中性福尔马林溶液中以便制作石蜡切片。
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1.2 血、尿生化免疫检测 尿样经尿蛋白定量液滴定后，用722光栅分光光度计，进行光比色定量分析;血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)、血浆白蛋白(ALB)、血脂(HDL、CHOL、TRIG、LDL)用全自动生化分析仪(型号:ABBOTT-AREˉOSET)进行分析。
1.3 肾脏病理检查 所用标本按常规方法固定、包埋，切片厚4μm，行HE染色。每张切片在20倍目镜下至少观察20个完整的肾小球。
1.4 统计学方法 计算数据用ˉx±s表示，组间比较采用单因素方差分析。用SPSS11.5统计软件进行统计分析。
2 结果
2.1 各组指标检测结果 造模成功后，各组大鼠蛋白尿均明显增加。和正常组比，P<0.001。经治疗，中药组和雷公藤组均较病理组蛋白尿明显减少，差异有显著性。中药组比雷公藤组有更明显的降蛋白尿的作用，二者之间差异有非常显著性(P<0.001)。同时血浆白蛋白于治疗后明显增高，各治疗组较之病理组差异均有显著性，但中药组与雷公藤组之间，差异无显著性。BUN在中药组和雷公藤组均较治疗前有变化，且差异均有显著性。BUN、CHOL、HDL、LDL 在中药组和雷公藤组均较治疗前有变化，且差异均有显著性，但二组之间差异无显著性。Scr、TRIG各治疗组较之病理组差异均无显著性。见表1、2。
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2.2 肾组织病理改变 病理组大鼠可见明显肾小球增生、肥大，系膜细胞及间质增殖，局灶节段性肾小球硬化，间质纤维化并有淋巴细胞浸润，部分肾小管内可见蛋白管型(见图1～2)。用药后各组肾小球增生、肥大、硬化均明显减轻，间质纤维化减少。其中中药组各种病变减轻更为明显(中药组见图3～4，雷公藤组见图5～6)。
表1 CTM和雷公藤对肾功能和尿蛋白定量的影响 略
表2 CTM和雷公藤对血脂的影响 略
3 讨论
局灶节段性肾小球硬化呈进行性发展的过程，预后较差，最终发展到肾功能衰竭。其发病机制，既往认为肾小管上皮细胞大量重吸收尿蛋白，可刺激肾小管上皮细胞增殖分泌细胞外基质蛋白，合成炎症趋化因子而使肾小管间质损伤;高血脂，特别是肾小球局部的脂质代谢异常、脂质沉积可引起肾小球内皮细胞损伤，释放细胞因子，刺激细胞外基质的生成而导致局灶节段性肾小球硬化 [1] 。有报道称，尿蛋白在肾小管上皮细胞内的过度穿梭对淋巴细胞的浸润和纤维化有诱导作用 [2] 。而肾小管间质病变程度较肾小球更能影响肾脏存活率。尿蛋白的减少，可能有助于减少淋巴细胞的浸润，从而有助于减轻肾脏的病变。
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图1 (HE染色，200倍)可见肾小球局灶硬化，囊壁与间质纤维化 略
图2 (HE染色，200倍)肾间质纤维化，伴有大量中性粒细胞及淋巴细胞浸润 略
图3 (HE染色，200倍)肾小球囊壁及间质纤维化伴蛋白管型，炎性细胞浸润 略
图4 (HE染色，200倍)肾小球轻度肥大伴纤维化，间质纤维化 略
图5 (HE染色，200倍)肾小球硬化，囊壁纤维化，炎性细胞浸润，伴蛋白管型 略
单侧肾结扎合并阿霉素2次注射诱导模型，目前被认为是成熟的局灶节段性肾小球硬化大鼠模型。其病理学特点与人类肾小球硬化的发病过程类似。在残肾间质中有大量淋巴细胞集聚，提示它可能在残肾的纤维化中起重要作
图6 (HE染色，40倍)肾小球局灶硬化，间质纤维化，伴蛋白管型 略
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用。因此，我们选择该模型，期望清热凉血活血方能在该模型中延缓肾脏病变，并探讨其可能的作用机制。
我们发现，应用清热凉血活血方后，该模型大鼠蛋白尿明显减少，BUN、CHOL、HDL、LDL显著降低，且差异有显著性;在病理上，肾间质纤维化和肾小球硬化程度明显减轻，范围缩小。且较对照组更为显著。
综上所述，我们认为，在局灶节段性肾小球硬化大鼠模型中，清热凉血活血方能通过抑制肾脏组织的异常增殖，减少间质纤维化，肾小球硬化。减少蛋白尿、改善脂质代谢，从而明显减轻肾脏的损害。由于中药方具有明显降低蛋白尿，改善脂质代谢的作用，在病理上对肾小球硬化有明显的阻抑作用，因而它可能作为一种很有前景的延缓慢性肾损害向终末期肾病演进的药物，值得进一步深入研究。
参考文献
1 林善锬.当代肾脏病学.上海:上海科技教育出版社，2001，490-1200.
2 朱忠华，张春，邓安国，等.霉酚酸酯抑制大鼠肾间质纤维化的研究。中华肾脏病杂志
，2002，4(18):295-297.
作者单位:1 201200上海浦东新区人民医院
2 200021上海中医药大学附属曙光医院肾内科
3 200040上海交通大学附属儿童医院
4 200032上海中医药大学
(编辑 曲全), 百拇医药