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编号:10446125
免疫组化法与AgNOR法检测大肠癌p53蛋白表达的相关性
http://www.100md.com 《中华中西医杂志》 2004年第9期
     【摘要】 目的 研究大肠癌p53蛋白免疫组化表达与核仁组成区嗜银蛋白染色(AgNOR)计数的关联性。方法 应用免疫组化和银染计数对80例大肠癌细胞中的p53蛋白、核仁组成区嗜银蛋白进行测定。结果 大肠癌、腺瘤和正常粘膜细胞内的p53蛋白表达阳性率分别为76.7%、16.7%、5.0%,AgNOR颗粒计数分别为9.30±3.53,5.40±1.95,4.38±1.28。大肠腺癌细胞内的p53蛋白表达阳性率和AgNOR计数明显高于大肠腺瘤细胞及正常粘膜细胞(P<0.01),大肠腺瘤细胞与正常粘膜细胞内的p53蛋白表达阳性率比较差异无显著性(P>0.05)。p53阳性组AgNOR颗粒计数明显高于p53阴性组(P<0.01)。结论 两方法呈正相关,联合应用进行检测p53蛋白,对大肠癌的鉴别诊断、恶性程度判定及预后评估有一定临床应用价值。

    关键词 大肠癌 腺瘤 p53蛋白 核仁组成区 嗜银蛋白染色

    【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2004)09-0801-02
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    Relevance between immunohistochemical assay and AgNOR counting

    on p53protein expression in the colorectal cancer cells

    Feng Shaogang,Li Hong,Gao Aifeng,et al.

    Department of Pathology,Shenyang Railway Part Central Hospital,Shenyang110005.

    【Abstract】 Objective To investigate the relevance between p53protein immunohistochemical expression in the colorectal cancer cells and silver-staining counting.Methods Applying the method to assay p53protein in the cells and using the silver staining technique to count the number of the silver-stained proteins in the nucleolar orgaˉnizer regions(AgNOR)of the cells from the80patients withthe colorectal cancers.Results p53protein expression positive rates in the cancer cells,adenoma cells and normal mucous cells were76.7%,16.7%and5.0%respectiveˉly,the numbers of AGNOR particle counter were9.30±3.53,5.40±1.95and4.38±1.28respectively.The p53protein expression positive proportional rate in the adenoma-carcinoma cells and the number of AgNOR counter were significantly higher than those in the adenoma cells and normal mucous cells(P<0.01),and there was also no signifˉicant difference between those in the adenoma cells and in normalmucous cells(P>0.05).The number of AgNOR particle counter was significantly higher in the p53positive group than p53negative group.Conclusion There is a positive relevance between p53protein immunohistochemical expression and silver-staining counting.Assaying the p53protein by combining the two methods would have some clinical applicable value in the identification,diagnosis,the malignant degree evaluation and prognosis assessment of the colorectal cancer in paitents.
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    Key words colorectal cancer p53protein adenoma nucleolar organizer region silver-staining protein

    大肠癌是人类最常见的肿瘤之一,从病理形态学看,腺瘤与腺癌比较容易区分,但重度不典型增生腺瘤与癌有时很难辨别。研究发现,突变型p53蛋白和AgNOR计数对判断癌变、肿瘤的恶性程度及预后有一定的参考价值 [1] 。本文应用免疫组化和AgNOR计数对30例大肠癌、30例大肠腺瘤、20例正常粘膜的p53蛋白,AgNOR进行研究分析,探讨它们在大肠癌发生发展中的作用及相互关系。

    1 材料与方法

    1.1 材料 收集我院1996~2001年手术切除及肠镜活检标本,其中大肠腺癌30例、大肠腺瘤30例、癌旁正常粘膜20例。所有标本均经福尔马林固定,石蜡包埋,5μm厚连续切片,每个蜡块切3张,HE染色,p53免疫组化染色,银染各一张。
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    1.2 方法

    1.2.1 免疫组化染色 p53蛋白表达采用S-P法,其主要步骤:石蜡切片脱蜡水化,3%双氧水浸泡20min,羊血清孵育10min,依次加一抗室温下60min,二抗室温30min,链亲和素-过氧化物酶溶液室温10min,DAB显色,苏木素复染,脱水封片,镜下观察。

    1.2.2 银染色主要步骤 (1)切面经二甲苯脱蜡,逐级乙醇、蒸馏水洗2次。(2)AgNOR工作液的配制:甲:取明胶2g溶于99m1双蒸馏水中,加热溶解,后加甲酸lml摇匀。乙:硝酸银50g溶于双蒸馏水中,至1000ml充分溶解,4℃保存。甲乙按l∶2混合配制成工作液。(3)将切片置于工作液中45min。(4)双蒸馏水洗3次,无水乙醇洗2次。(5)透明封片。

    2 结果

    2.1 p53蛋白免疫组化表达 p53蛋白阳性产物位于细胞核,大肠腺癌中的阳性率为76.7%,阳性细胞较密集,大肠腺瘤中的阳性率为16.7%,且阳性细胞呈灶性或散在分布,癌周正常粘膜为5.0%且呈弱阳性。大肠腺癌的p53阳性表达率及表达强度明显高于大肠腺瘤(P<0.01)。大肠腺瘤与正常粘膜比较差异无显著性。见表1。
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    表1 p53蛋白的表达略

    2.2 AgNOR染色计数 结果银染细胞核内颗粒呈棕褐色。正常粘膜细胞核内的AgNOR颗粒以中颗粒为主,圆形,每个细胞核内平均数为4.38±1.28,大肠腺瘤也以中颗粒为主,单个或多个,部分区域颗粒数增多,有的出现大颗粒,细胞核内的平均数为5.40±1.95。癌组以小颗粒为主,多数,有1~3个大颗粒,形态不规则,分布无规律性,呈串珠状或散在分布,平均颗粒数为9.30±3.53,平均每个细胞核内AgNOR颗粒数和形态在大肠腺癌中明显高于大肠腺瘤及正常粘膜(P<0.01),大肠腺瘤与正常粘膜比较无明显差异(P>0.05),见表2。

    表2 AgNO 3 颗粒的计数略

    大肠腺癌中的p53蛋白阳性组与阴性组AgNOR颗粒平均计数分别为7.53±1.01、4.81±2.01,两组比较差异有非常显著性(P<0.01)。
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    3 讨论

    p53基因突变或缺失是许多肿瘤发生的原因,突变型 p53基因在细胞内积聚则促进细胞的转化和增殖,导致肿瘤的发生 [2] 。多数报道认为,正常粘膜及癌旁粘膜组织无p53蛋白的表达,p53蛋白的过度表达与腺瘤的恶性倾向及肿瘤的分化程度有关。我们应用免疫组化对大肠肿瘤的p53蛋白的表达情况进行研究分析,发现大肠腺癌的阳性率为76.7%,染色强度随着异型性的增强而加重。大肠腺瘤中有5例局部区域为阳性,组织形态学上表现为细胞增生活跃,该区域细胞内AgNOR数目明显增多,且形态趋于不规则,有较大的颗粒。表明这些瘤细胞可能具有潜在的恶性行为,甚至已经发生了恶变。p53蛋白阳性组较阴性组AgNOR计数增高。进一步说明p53基因突变在大肠腺癌进展中起重要作用。

    AgNOR是存在于细胞核仁内具有调节rDNA转录作用的分组蛋白,其含量是反映细胞增殖状态的主要指标 [3] 。本文研究30例大肠癌、30例大肠腺瘤、20例正常粘膜,可以观察到癌组每个细胞内的平均颗粒数是9.30±3.53,大肠腺癌5.40±1.95,正常粘膜是4.38±1.28。癌组与腺瘤及正常粘膜比较差异有非常显著性(P<0.01)。形态上正常粘膜呈圆形、居中。癌细胞中AgNOR颗粒大小不等,形态不规则,分布无规律性。大肠腺瘤界于两者之间,局部区域随着异型性的加重,颗粒数有递增的趋势,有的出现大颗粒。
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    综上所述,p53蛋白表达与AgNOR计数联合检测,对鉴别肿瘤的良恶性、恶性程度、估计预后有重要的指导意义。在实际工作中,AgNOR时计数较困难,而p53组化染色可减少主观的影响,两者联合起来研究,会更准确地评估大肠癌生物学行为的发展趋势及大肠癌的早期诊断和预后判断。

    参考文献

    1 纪小龙,张作霖.诊断免疫组化学.北京:军事医学科学出版社,1996,622.

    2 孙保存,张乃鑫,赵秀兰,等.大肠癌和腺瘤中的细胞凋亡及其调控基因表达.中华病理学杂志,1997,26(3):137.

    3 Clocker J.J Clin Pathol,1987,40:885.

    作者单位:1110005辽宁沈阳沈阳铁路局中心医院病理科

    2110035辽宁沈阳中国刑事警察学院法医学系

    (编辑 曲全), 百拇医药