中药丹参所含丹酚酸B在大鼠血浆中浓度的检测
【摘要】 目的 建立大鼠血浆中丹酚酸B的含量测定方法。方法 用HPLC法进行含量分析;色谱柱为Diamonsil C 18 柱(4.6mm×250mm，5μm)以及Agilent预柱;流动相为梯度洗脱，乙腈(A)-0.5%甲酸水溶液(B)梯度洗脱(0～40min，20%～65%A);流速为1.0ml/min，检测波长288nm;以肉桂酸作为内标物。结果 回收率在99.1%～103.5%，提取回收率大于86%，日内、日间精密度均低于5.0%。结论 该法可作为丹酚酸B在大鼠体内药物动力学研究的检测手段。
关键词 血浆 丹酚酸B HPLC
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2004)10-0880-02
Determination of salvianolic acid B from
radix salviae in rat plasma
, 百拇医药
Zhang Qin，Wang Qiang，Liu Xiaodong
Department of Traditional Chinese Medicine，China Pharmaceutical University，Nanjing210038.
【Abstract】 Objective To develop an method for determining salivanolic acidB in rat plasma.Methods HPLC method and diamonsil C 18 column(4.6mm×250mm，5μm)were used.The mobile phase was acetontrile(A)and0.5%formic acid(B)was used for gradient elution(0～40min，20%～65%A)at flow rate of1.0ml/min，the UV detection wavelength was288nm.Cinnamic acid was used as internal standard.ResultsThe recovery of the method was in the range of99.1%～103.5%，the recovery of the extraction was over86%.The within-day precision and the day-to-day precision were both lower than5.0%，and good linearity of Sal B was obtained(r=0.9995)within the range of5～60μg/ml.Conclusion The method is appropriate for the determination of Sal B when pharmacokinetˉics of it be studied in rat plasma.
, 百拇医药
Key words plasma salvianolic acid B HPLC
丹酚酸(salvinolic acid)是从鼠尾草属植物丹参中提取的一类既有咖啡酰缩酚酸结构又有新木质素骨架的水溶性成分，包括丹酚酸A、B、C、D、E、F、G、H、I和异丹酚酸C等，都具有很强的抗脂质过氧化和清除自由基作用 [1] ，其中含量最高的丹酚酸B(SalB)活性最强，对脂质过氧化引起的细胞膜损伤有明显的保护作用。研究表明其具有抗肝纤维化 [2] 、抗动脉粥样硬化 [3] 和改善记忆功能障碍 [4] 等作用，但血浆样品中SalB含量的测定方法未见报道。本实验以桂皮酸为内标建立了HPLC法测定大鼠血浆样品中SalB含量的分析方法，为进行SalB的药物动力学研究提供了一个灵敏、可靠的检测手段。
1 材料
1.1 仪器 高效液相色谱仪Agilent1100;pH计Mettler Toledo320-S型;离心机BECKMAN CENTRIFUGE GS-15R型(made in USA);混匀器IKA MS1minishake(made in Gerˉmany);GILSON精密移液器(made in France)。
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1.2 药品与试剂 丹酚酸B(自制，纯度达98%以上)、丹参酚酸成分(自制，丹酚酸B含量达90%)、肉桂酸(分析纯)、甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。
1.3 动物 SD雄性大鼠，体重(200±10)g，购自中国药科大学动物中心。
2 实验方法与结果
2.1 色谱条件 色谱柱Diamonsil C 18 柱(250mm×4.6mm，5μm);流动相:采用梯度洗脱，乙腈(A)-0.5%甲酸水溶液(B)(0～40min，20%～65%A);流速:1.0ml/min;柱温:室温;检测波长:288nm;灵敏度:0.01AUFS。
2.2 对照品溶液的配制 精密称取约1mg丹酚酸B(salˉvianolic acid B)置10ml容量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，得100μg/ml的对照品贮备液，以此来配制系列浓度的对照品溶液。精密称取内标物桂皮酸10.0mg以水定容于100ml容量瓶中，精密量取1.0ml置25ml容量瓶中用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，得4μg/ml内标溶液。以上溶液均置冰箱(4℃)保存备用。
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2.3 血样预处理 取大鼠空白血浆0.1ml置5.0ml离心管中，加0.5mol/L HCl50μl，超声振荡5min，加入内标溶液30μl，再加乙腈0.4ml沉淀蛋白，置混合器上涡旋5min。离心(3000rpm)10min。吸取上清液，置5ml具塞试管中，于37℃水浴下氮气吹干，残余物中加入流动相200μl，超声溶解，离心(2000rpm)5min，取上清液进样(定量阀20μl)。
2.4 系统适用性试验 在选定的条件下，注入上述血浆样品溶液，记录色谱图。按SalB计算得到色谱柱的最小理论板数为26192，血浆中SalB与肉桂酸的分离度R>1.5，对称因子为0.96，均符合药典要求。
2.5 方法专属性的考察 将实验动物的血浆按上述方法处理后，取20μl注入高效液相色谱仪。同法处理空白血浆样品。所得色谱图见图1。可见，在上述色谱条件下，SalB与内标物肉桂酸具有良好的分离度。空白血浆对SalB及内标物的分析测定无干扰，因此本方法具有良好的专属性。
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2.6 标准曲线的制备 精密量取空白血浆0.1ml，分别加入5、10、20、30、40、60μl丹酚酸B对照品溶液。使血药浓度分别为5，10，20，30，40，60μg/ml。按上述样品处理过程分析，以SalB与内标物峰面积比值为纵坐标，SalB浓度为横坐标绘制标准曲线，计算得血浆中丹酚酸B的标准曲线方 程为Y=-0.0228+0.0121X，r=0.9995。
2.7 最低检测浓度的测定 按峰高为基线噪音3倍计算，血浆中SalB最低检测浓度为3.3μg/ml。
2.8 精密度试验 用空白血浆配制含SalB5.0，20.0，60.0μg/ml样品各5管。分别计算日内精密度和日间精密度。结果见表1。图1 HPLC图谱
表1 血浆中丹酚酸B的精密度实验(n=5)浓度
2.9 回收率试验 分别于空白血浆中准确加入一定量的SalB，经预处理后进行色谱测定。测定结果与标准曲线中相应浓度比较，得方法回收率。用未经试验处理的SalB对照品溶液5、20、60μg/ml浓度在已定的HPLC条件下测定，计算提取回收率。结果见表2。
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表2 回收率实验结果(n=4)浓度
结果表明丹酚酸B在血浆中的提取回收率较高，均在86%以上，方法回收率在99.1%～103.5%，符合测定要求。
3 讨论
本实验以肉桂酸为内标，用HPLC-UV法测定大鼠血浆中丹酚酸B的浓度，血浆中的内源性物质不干扰丹酚酸B及内标物的测定，操作简便，精密度及重现性均较好。本实验考察了乙腈与0.5%甲酸不同比例组成的流动相的分离度，发现以恒定组成的流动相分离时基线漂移严重，可能由于血浆内源性物质的干扰，而采用梯度洗脱后的分离效果最好。丹参中水溶性酚酸类成分复杂多样，结构相近，极性相似，采用梯度洗脱使得丹参总酚酸中各成分均得到良好的分离，为后期的体内、非单一成分研究提供依据。
参考文献
1 戈升荣(Ge SR)，俞一心(Yu YX)，谢更新(Xie GX).丹酚酸的药理作用研究进展.中药材(J of Chin Med Materials)，2002，25(9):683-686.
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2 Lay IS，Chiu JH.Crude extract of Salvia miltiorrhiza and salvianolic acidβ-enhance in vitro angiogenesis in murine SVR endothelial cell line.Planta Med，2003，69(1):26-32.
3 Hung HH，Cheng YL.A salvianolic acid B-rich fraction of Salvia miltiˉorrhiza induces neointimal cell apoptosis in rabbit angioplasty mode.Hisˉtol Histopathol，2001，16(1):175-183.
4 冯征(Feng Z)，张均田(Zhang JT).丹酚酸B对β-淀粉样蛋白介导原代培养皮层神经元毒性的保护作用.药学学报(Acta Pharm Sinica)，2000，35(12):881-885.
作者单位:210038江苏南京中国药科大学中药学院(药代中心)
通讯作者:E-mail:qwang49@sohu.com
(编辑元 红), http://www.100md.com
关键词 血浆 丹酚酸B HPLC
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2004)10-0880-02
Determination of salvianolic acid B from
radix salviae in rat plasma
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Zhang Qin，Wang Qiang，Liu Xiaodong
Department of Traditional Chinese Medicine，China Pharmaceutical University，Nanjing210038.
【Abstract】 Objective To develop an method for determining salivanolic acidB in rat plasma.Methods HPLC method and diamonsil C 18 column(4.6mm×250mm，5μm)were used.The mobile phase was acetontrile(A)and0.5%formic acid(B)was used for gradient elution(0～40min，20%～65%A)at flow rate of1.0ml/min，the UV detection wavelength was288nm.Cinnamic acid was used as internal standard.ResultsThe recovery of the method was in the range of99.1%～103.5%，the recovery of the extraction was over86%.The within-day precision and the day-to-day precision were both lower than5.0%，and good linearity of Sal B was obtained(r=0.9995)within the range of5～60μg/ml.Conclusion The method is appropriate for the determination of Sal B when pharmacokinetˉics of it be studied in rat plasma.
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Key words plasma salvianolic acid B HPLC
丹酚酸(salvinolic acid)是从鼠尾草属植物丹参中提取的一类既有咖啡酰缩酚酸结构又有新木质素骨架的水溶性成分，包括丹酚酸A、B、C、D、E、F、G、H、I和异丹酚酸C等，都具有很强的抗脂质过氧化和清除自由基作用 [1] ，其中含量最高的丹酚酸B(SalB)活性最强，对脂质过氧化引起的细胞膜损伤有明显的保护作用。研究表明其具有抗肝纤维化 [2] 、抗动脉粥样硬化 [3] 和改善记忆功能障碍 [4] 等作用，但血浆样品中SalB含量的测定方法未见报道。本实验以桂皮酸为内标建立了HPLC法测定大鼠血浆样品中SalB含量的分析方法，为进行SalB的药物动力学研究提供了一个灵敏、可靠的检测手段。
1 材料
1.1 仪器 高效液相色谱仪Agilent1100;pH计Mettler Toledo320-S型;离心机BECKMAN CENTRIFUGE GS-15R型(made in USA);混匀器IKA MS1minishake(made in Gerˉmany);GILSON精密移液器(made in France)。
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1.2 药品与试剂 丹酚酸B(自制，纯度达98%以上)、丹参酚酸成分(自制，丹酚酸B含量达90%)、肉桂酸(分析纯)、甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。
1.3 动物 SD雄性大鼠，体重(200±10)g，购自中国药科大学动物中心。
2 实验方法与结果
2.1 色谱条件 色谱柱Diamonsil C 18 柱(250mm×4.6mm，5μm);流动相:采用梯度洗脱，乙腈(A)-0.5%甲酸水溶液(B)(0～40min，20%～65%A);流速:1.0ml/min;柱温:室温;检测波长:288nm;灵敏度:0.01AUFS。
2.2 对照品溶液的配制 精密称取约1mg丹酚酸B(salˉvianolic acid B)置10ml容量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，得100μg/ml的对照品贮备液，以此来配制系列浓度的对照品溶液。精密称取内标物桂皮酸10.0mg以水定容于100ml容量瓶中，精密量取1.0ml置25ml容量瓶中用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，得4μg/ml内标溶液。以上溶液均置冰箱(4℃)保存备用。
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2.3 血样预处理 取大鼠空白血浆0.1ml置5.0ml离心管中，加0.5mol/L HCl50μl，超声振荡5min，加入内标溶液30μl，再加乙腈0.4ml沉淀蛋白，置混合器上涡旋5min。离心(3000rpm)10min。吸取上清液，置5ml具塞试管中，于37℃水浴下氮气吹干，残余物中加入流动相200μl，超声溶解，离心(2000rpm)5min，取上清液进样(定量阀20μl)。
2.4 系统适用性试验 在选定的条件下，注入上述血浆样品溶液，记录色谱图。按SalB计算得到色谱柱的最小理论板数为26192，血浆中SalB与肉桂酸的分离度R>1.5，对称因子为0.96，均符合药典要求。
2.5 方法专属性的考察 将实验动物的血浆按上述方法处理后，取20μl注入高效液相色谱仪。同法处理空白血浆样品。所得色谱图见图1。可见，在上述色谱条件下，SalB与内标物肉桂酸具有良好的分离度。空白血浆对SalB及内标物的分析测定无干扰，因此本方法具有良好的专属性。
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2.6 标准曲线的制备 精密量取空白血浆0.1ml，分别加入5、10、20、30、40、60μl丹酚酸B对照品溶液。使血药浓度分别为5，10，20，30，40，60μg/ml。按上述样品处理过程分析，以SalB与内标物峰面积比值为纵坐标，SalB浓度为横坐标绘制标准曲线，计算得血浆中丹酚酸B的标准曲线方 程为Y=-0.0228+0.0121X，r=0.9995。
2.7 最低检测浓度的测定 按峰高为基线噪音3倍计算，血浆中SalB最低检测浓度为3.3μg/ml。
2.8 精密度试验 用空白血浆配制含SalB5.0，20.0，60.0μg/ml样品各5管。分别计算日内精密度和日间精密度。结果见表1。图1 HPLC图谱
表1 血浆中丹酚酸B的精密度实验(n=5)浓度
2.9 回收率试验 分别于空白血浆中准确加入一定量的SalB，经预处理后进行色谱测定。测定结果与标准曲线中相应浓度比较，得方法回收率。用未经试验处理的SalB对照品溶液5、20、60μg/ml浓度在已定的HPLC条件下测定，计算提取回收率。结果见表2。
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表2 回收率实验结果(n=4)浓度
结果表明丹酚酸B在血浆中的提取回收率较高，均在86%以上，方法回收率在99.1%～103.5%，符合测定要求。
3 讨论
本实验以肉桂酸为内标，用HPLC-UV法测定大鼠血浆中丹酚酸B的浓度，血浆中的内源性物质不干扰丹酚酸B及内标物的测定，操作简便，精密度及重现性均较好。本实验考察了乙腈与0.5%甲酸不同比例组成的流动相的分离度，发现以恒定组成的流动相分离时基线漂移严重，可能由于血浆内源性物质的干扰，而采用梯度洗脱后的分离效果最好。丹参中水溶性酚酸类成分复杂多样，结构相近，极性相似，采用梯度洗脱使得丹参总酚酸中各成分均得到良好的分离，为后期的体内、非单一成分研究提供依据。
参考文献
1 戈升荣(Ge SR)，俞一心(Yu YX)，谢更新(Xie GX).丹酚酸的药理作用研究进展.中药材(J of Chin Med Materials)，2002，25(9):683-686.
, http://www.100md.com
2 Lay IS，Chiu JH.Crude extract of Salvia miltiorrhiza and salvianolic acidβ-enhance in vitro angiogenesis in murine SVR endothelial cell line.Planta Med，2003，69(1):26-32.
3 Hung HH，Cheng YL.A salvianolic acid B-rich fraction of Salvia miltiˉorrhiza induces neointimal cell apoptosis in rabbit angioplasty mode.Hisˉtol Histopathol，2001，16(1):175-183.
4 冯征(Feng Z)，张均田(Zhang JT).丹酚酸B对β-淀粉样蛋白介导原代培养皮层神经元毒性的保护作用.药学学报(Acta Pharm Sinica)，2000，35(12):881-885.
作者单位:210038江苏南京中国药科大学中药学院(药代中心)
通讯作者:E-mail:qwang49@sohu.com
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