组织工程化人工食管的构建及动物实验研究(基金项目)
http://www.100md.com
基金项目:该研究获2002年度国家重点学科(肿瘤学)
建设项目资助该研究获2003年度广东省科技计划项目重大攻关资助(项目编号:2003A3020103)
该研究获2003年度广东省自然科学基金资助(项目编号:31717)
【摘要】 目的 构建不同生物材料的人工食管，建立犬胸段食管缺损模型并以人工食管植入重建，寻求解决术后吻合口瘘及狭窄的方法。方法 采用不同生物材料人工食管以不同吻合方式对两组共45只中国杂种犬进行胸段食管缺损植入重建。结果 两组围手术期存活率分别为53.33%(8/15)及93.33%(28/30)，吻合口瘘发生率为40%(6/15)及6.67%(2/30)，“叠瓦套入式”吻合法可明显降低术后吻合口瘘(P<0.01)。胃镜检查发现“新生食管”于术后60～75d出现不同程度狭窄，狭窄经扩张或支架置入可完全缓解。组织病理结果显示“新生食管”由纤维结缔组织构成，3～6个月后“新生食管”可完全覆盖鳞状上皮，1年后粘膜下层可见腺体及神经再生。结论 猪主动脉材料是理想的人工食管构建材料，植入后可短暂替代食管并由机体修复为有上皮组织爬覆的纤维结缔组织的“新生食管”。术后吻合口瘘主要与手术方法及材料选择等因素有关，“叠瓦套入式”吻合可明显降低吻合口瘘。术后狭窄经妥善的内科治疗可缓解。该动物模型可成功反映人工食管植入重建后的转归及愈合过程。
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关键词 人工食管 生物材料 组织病理
【文献标识码】 A 【文章编号】 1726-7587(2004)06-0769-03
Experimental study of the tissue engineering biological artificial esophagus
Zhang Lanjun，Rong Tiehua，Long Hao，et al.
Department of Thoracic Surgery，Cancer Hospital of Sun Yat-sen University，Guang dong510060.
【Abstract】 Objective To design different type biological material artificial esophagus and to observe the healing process of the regenerated esophagus in dog.Methods Different types biological artifical esophagus were imˉplanted to45Chinese mongrels with different anastomosis.Results The postoperative survivalrates in two groups were53.33%(8/15)～93.3%(28/30)，and the anastomotic leakage rates were40%(6/15)～6.67%(2/30)，the“cross and fold”anastomosis can significant decrease the postoperative anastomotic leakage rate compare to the“end to end”anastomosis(P<0.01).The postoperative stenosis of regenerated esophagus was occurred about2～3months after implantation，and it can relieved by theendoscopical dilation or esophageal stent implantation.The histology and endoscopical findings show that the luminal surface of regenerated esophagus was covered with smooth mucosa and the complete epithelialization was observed at3～6months.Conclusion The biological artificial esophagus was one of safe and effective way to reconstruction of esophagus，and the“cross and fold”anastomosis can significant decrease the postoperative anastomotic leakage rate，postoperative stenosis of regenerated esophagus can be relieved by the endoˉscopical therapy or esophageal stent implantation.The animal trial model can successful testing the healing process of the biological artificial esophagus in dog.
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Key words artificial esophagus biological materials histopathology
术后吻合口瘘及狭窄是人工食管研究中的两大难题 [1～4] ，为了筛选构建组织工程化人工食管的生物材料并寻求解决术后吻合口瘘及狭窄的方法，我们自1999年6月开始建立犬胸段食管缺损模型并以不同类型的人工食管进行重建，取得了一定的进展，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 构建人工食管的生物材料筛选
1.1.1 牛主动脉材料管 选取新鲜、健康、直径为1.8～2.5cm、长度为10～15cm的牛降主动脉进行预处理，剥离外膜的脂肪组织，结扎侧枝血管，并以专利技术进行组织处理，将处理后的管道制成10～15cm长的人工食管并浸入30%乙醇溶液中封存备用。
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1.1.2 猪主动脉材料管 选取猪主动脉为原料进行清洗及组织处理(组织处理方法同上)，将处理后的猪主动脉剪制成长方形的片状材料，把4片该材料在洁净工作台下固定于模具上，以4-0平制羊肠线缝制成内径2.0cm，壁厚0.5cm，长8～12cm的人工食管(见图1)，以生理盐水封存于密封胶袋中经钴60照射消毒后备用。
1.2 动物模型建立及实验分组 选用健康中国杂种犬，由中山大学动物研究中心提供普通级中国杂种犬，雌雄不限，体重17.5～25.5kg，以盐酸左旋咪唑驱虫及犬五联活疫苗免疫。实验前犬禁食、水6h，以3%戊巴比妥钠静脉麻醉(1ml/kg)，以卡肌宁维持肌松(1mg/kg)，气管插管、呼吸机辅助呼吸，经右胸后外侧切口第五肋间入胸，自奇静脉水平图1 猪主动脉材料人工食管至贲门上方3cm处游离并切除犬胸段食管10～14cm长，制备成犬胸段食管缺损模型以备人工食管原位植入重建。实验分为以下两组。
1.2.1 牛主动脉材料管组 实验犬15只，平均体重17.65kg，雌雄比例1:1.83，植入人工食管长度为5～12cm，平均6.8cm。重建采用间断、全层、端端吻合，后壁内翻，前壁外翻，上、下吻合口均采用1-0丝线及5×17弧度圆针吻合，吻合口外未包埋。
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1.2.2 猪主动脉材料管组 实验犬30只，体重17.5～25.5kg，雌雄比例1:2。植入人工食管长度均为8cm。重建采用“叠瓦套入式”吻合，即上、下吻合口后壁以人工食管交叠套入犬食管粘膜层与肌层之间约0.4～0.5cm行间断、全层、端端吻合，线结打在犬食管粘膜层上。而上、下吻合口前壁以犬食管全层叠套于人工食管上约0.4～0.5cm行间断、全层、端端吻合，线结打在犬食管外膜上。缝线采用3-0无损伤编织涤纶线及5×14弧度无损伤圆针，吻合口外以纵隔胸膜覆盖包埋。
两组术后均禁食、水5～6d，以静脉营养维持(100ml/kg)，术后第7～8d进全流质饮食，术后10d进半流质饮食，术后3周正常喂养。
1.3 观测指标 观察两组间围手术期存活率、吻合口瘘及狭窄发生率。术后以Olympus-XQ-230型电子胃镜对存活犬于术后1、3、6、12、24个月进行内镜检查以观察人工食管的脱落过程和“新生食管”粘膜爬覆情况。术后1、3、6、12、15、18、24个月各处死2只存活犬行组织病理学检查，观察“新生食管”外观、质地和组织结构，镜下观察“新生食管”粘膜爬覆、粘膜下结构及其重塑变化。
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2 结果
2.1 术后吻合口瘘及存活情况
2.1.1 牛主动脉材料管组 15只犬中8只围手术期存活，其中最长存活15个月。发生吻合口瘘6只均处死解剖，麻醉时意外死亡1只。全组围手术期存活率为53.33%(8/15)，吻合口瘘发生率为40%(6/15)。术后1、3个月各处死存活犬2只，术后3～6个月因新生食管狭窄致营养不良、衰竭死亡3例，于术后15个月处死存活犬1例。
2.1.2 猪主动脉材料组 30只犬中28只围手术期存活，其中最长存活已超过2年，吻合口瘘死亡2例，围手术期存活率为93.3%(28/30)，吻合口瘘发生率6.67%(2/30)。术后胃镜下球囊扩张致新生食管撕裂死亡2例，后期因肺炎死亡1例。依方案分别于术后1、3、6、12、15、18、24个月各处死存活犬2只行病理检查。手术2年后因胃溃疡出血死亡1例、肝炎及犬皮肤血螨病死亡4例。自然死亡3例、不明原因死亡1例(病理检查均未发现呼吸、循环及消化系统异常)，2年后因结束实验处死存活犬2例行病理检查。
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2.1.3 两组吻合口瘘 经χ 2 检验结果显示:χ 2 值=7.601，当自由度为1时，P<0.01，两组间差异有非常显著性。
2.2 术后狭窄及治疗
2.2.1 牛主动脉材料管组 所有存活犬均发生术后新生食管狭窄，其中3例因进食障碍致营养不良死亡，1例存活。
2.2.2 猪主动脉材料管组 22例于术后60～75d出现不同程度的狭窄，其中Cwikiel [5] 分级1～2级者13例(59.1%)，3级者2例(9.1%)，4级者7例(31.8%)。有18例需行镜下扩张治疗，其中13例经2～3次扩张后治愈，5例需行食管内支架置入，全组无一例因食管狭窄而致营养不良死亡者。
2.3 术后电子胃镜检查 牛主动脉材料管组未行术后胃镜检查，而猪主动脉材料管组存活犬于术后1、3、6、12、24个月行胃镜检查，镜下见术后26～47d时人工食管自上吻合口处开始向内卷曲并逐渐剥脱，人工食管外周形成一个以人工食管为支撑的、完整连续的纤维管道，人工食管与纤维管道间尚无内皮爬覆。当人工食管完全脱落后上皮逐渐覆盖内层的纤维创面，术后约3～6个月粘膜上皮完全覆盖新生的纤维管道腔内面，术后12、24个月见“新生食管”内壁光滑、粘膜覆盖完全、无狭窄(见图2)。
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图2 术后1个月人工食管镜下观
2.4 术后组织病理学检查 猪主动脉材料组于术后1、3、6、12、15、18、24个月各处死2例存活犬，进行病理学检查，并以HE染色及Masson、Aketin、VG等特殊染色观察。结果示:术后1个月“新生食管”为一纤维结缔组织包裹的连续管道，剖面可见人工食管与纤维组织管紧密粘附，纤维层厚约2～3mm，镜下为杂乱的疏松纤维结缔组织，未见粘膜上皮。术后3个月“新生食管”为深红色、较硬的纤维管道，粘连较术后1个月减轻，剖面为一连续的组织管道，人工食管已脱落，镜下见“新生食管”为纤维结缔组织所构成，有薄层粘膜上皮爬覆。术后6个月“新生食管”为均匀的粉红色“肌性”管道，质软，剖面可见完整的食管鳞状上皮，细胞层较厚，Masson染色及Aketin染色可见粘膜下肌层，粘膜下可见丰富的血管，部分血管周围可见散在的肌细胞巢(图3)。术后1年“新生食管”为连续的肌性管道，粘膜光整。镜下见完整的鳞状上皮，其下为粘膜肌层，可见食管腺体，粘膜下可见散在的神经纤维，“新生食管”壁为致密且排列有序的纤维结缔组织(图4)。
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图3 术后1年人工食管大体标本
3 讨论
3.1 人工食管构建材料的筛选 人工食管的构建材料包括自体组织、生物材料、人工材料及复合材料。自体组织应用最早，也是目前应用最成熟的重建方式，常见的有胃、结肠、空肠等代食管术 [7，8] ，但却存在手术创伤大、干扰生理功能及术后反流等无法克服的缺陷。人工材料及复合材料是应用较广泛的材料，包括聚乙烯、膨体聚四氟乙烯及碳素纤维等，其缺点是生物相容性差，质硬，脱落后不安全等。1999年Miki [6] 以聚乙烯网状支架作支撑，把胶原蛋白及人鳞状上皮附着在支撑物上培养，缝制成食管。2002年徐志飞 [9]采用聚氨酯-胶原蛋白复合材料构建成人工食管。但均存在管道脱落不安全及吻合口瘘发生率较高的问题。张兰军 [10] 等应用异体生物组织做原材料，将其处理成无抗原性及残余毒性，组织相容性好，可安全脱落或吸收的人工材料，制成可工业化生产的人工食管，但从实验结果可以看出，牛主动脉材料较厚，质硬，弹性差，且口径相差太大，不易工业化标准生产，而且牛主动脉材料与实验动物犬之间存在一定程度的免疫源性，故吻合口瘘发生率较高。而猪主动脉材料柔软，厚薄适中，弹性好，来源方便易采集，可标准化工业生产，与人体或犬生物相容性好，是理想的人工食管构建材料，该人工食管材料经国家药品监督管理局中国生物制品检定所检验后认为无毒性，无致敏性及致畸性，符合长期植入人体标准。
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3.2 吻合口瘘 吻合口瘘是人工食管术后最严重的并发症，发生率10%～60% [1～4] ，究其原因我们认为主要与吻合方法、构建材料等诸多因素有关，也与缝线、缝针等因素有关。本实验结果发现“叠瓦套入式”吻合组明显较端端吻合组吻合口瘘发生率低(P<0.01)，我们认为“叠瓦套入式”吻合术可较好的提供人工食管的受力点，避免拉伤人工食管壁特别是进针点，从而缓解吻合口张力及有利于上皮组织爬覆。而无损伤编织线或聚丙烯线较丝线理想，另外吻合时的线结位于宿主食管面时可较好缓冲线结拉力。其它的因素尚与食管血运，犬卫生习惯及进食方式等有关。犬为匍形动物，进食时急迫，且肠蠕动活跃，反流较多，故下吻合口较易发生瘘。本组吻合口瘘发生率从40%下降到6.67%，除与手术方法的改进有直接关系外，也与人工材料的改进有关。
3.3 术后狭窄 术后狭窄致营养不良是人工食管难以妥善临床应用的另一难题。本研究中猪主动脉材料组有18例犬行狭窄后镜下治疗，除5例经扩张无效而放置支架外，其余13例均经2～3次镜下扩张而治愈。全组目前无一例因狭窄而致死亡者。而牛主动脉材料组未行镜下治疗，结果3例死亡、仅1例存活。我们认为术后狭窄主要是由于人工食管脱管后新生食管的疤痕增生所致，也与新生食管环形收缩及纵向缩短有关，但上皮组织完全爬覆后狭窄逐渐缓解，其原因与上皮组织爬覆后抑制疤痕增长有关，另外上皮下结构完善及纤维结缔组织重塑也是缓解狭窄的原因。故术后狭窄发生可于术后2～4个月内，若仔细、耐心的反复镜下扩张以及坚持喂养固体食物(因为固体食物的反复刺激具有扩张作用)可期望达到缓解，只有当扩张无效时才考虑置入支架。
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3.4 “新生食管”的愈合及重塑现象 试验发现人工食管植入后仅起短暂的替代、支撑作用，术后1周即在其外周形 成一个由血液及结缔组织渗出覆着的胶原纤维管道，约在术后30d左右，由于进食刺激及食物中的细菌作用，使上吻合口部位出现剥脱，术后30～45d左右人工食管完全脱落并被排出。脱管后的纤维结缔组织内壁由上下两端的食管上皮向中心爬覆，3个月左右上皮基本爬覆，6个月左右完全覆盖。新生食管上皮化后逐渐柔软、通畅而定型。而胃镜下及病理可以看出“新生食管”是由致密的纤维结缔组织构成，表面覆盖与机体食管鳞状上皮一致的上皮细胞，纤维结缔组织内可见血管。刘谦及Fukushima [2，7] 等报道发现有肌肉及腺体再生，Yasumichi [8] 也认为只要人工食管停留4周以上，均能见腺体和肌肉再生。而我们的研究中可以看到粘膜下肌层及散在于血管旁的肌细胞巢，另见食管腺体及神经再生，胶原排列的有明显的重塑现象。
4 结论
(1)组织工程化人工食管做为新的食管重建方法之一，其手术方法简单、并发症少，对心肺影响小，不干扰正常生理功能，是理想的食管重建方式。(2)手术方法及吻合技术是减少及防止吻合口瘘发生的主要手段，“叠瓦套入式”吻合法可明显减少生物型人工食管术后吻合口瘘的发生。猪主动脉材料柔软、易取材、可工业化生产、有良好的生物耐受性，是理想的人工食管构建材料。(3)术后狭窄与疤痕增生及“新生管道”收缩有关，内镜下扩张或支架置放可治疗狭窄而完全缓解症状。(4)生物型人工食管在体内短暂替代食管并由机体产生有上皮爬覆的纤维结缔组织结构的“新生食管”，随着时间延长“新生食管”粘膜下肌层及部分腺体再生，而“新生食管”的纤维结缔组织在后期可适应进食而出现重塑。(5)该动物模型可较好反映愈合过程及并发症发生和转归，能为临床试验提供有效数据。(本文图4见封三)
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参考文献
1 孙公甲，孙敏，朱福秀，等.组合式人工食管的实验研究.中国生物医学工程学报，1990，12，147:267-269.
2 刘谦，王桂茹，陈桂荣，等.碳素人工食管的实验研究.中华肿瘤杂志，1984，6(2):147-150.
3 田柳堤，姚伯元，郭风林，等.应用哑铃型人工食管对犬的食管重建的实验研究.中国生物医学工程学报，1989，8(3):151-157.
4 陈耀辉，张大力，黄国俊，等.人工食管的实验研究.中华胸心血管外科杂志，1992，8(2):115-117.
5 Cwikiel W，Stridbeck H，Tranberg KG，et al.Malignant esophageal stricutres:treatment with a self-expanding nitinol stent.Radiology，1993，187:661-665.
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6 Miki H，Ando N，Ozawa S，et al.An artificial esophagus constructed of cultured human esophageal epithelial cells，fibroblasts，polyglycolic acid mesh，andcollagen.ASAIO Journal，1999，45:502-508.
7 Fuknshima M，Kako N，Chiba K，et al.Seven-year follow-up study after the replacement of the esophagus with an artificial esophagus in the dog.Surgery，1983，93(1):70-77.
8 Yasumichi Y，Nakamura T，Shimizu Y，et al.Experimental replacement of thoracic esophagus with a bioabsorbable collegen sponge scaffold supˉported by a silicone stent in dogs.ASAIO Journal，1999，45:311-316.
9 徐志飞，秦雄，赵学维，等.聚氨酯-胶原蛋白复合人工食管替换犬颈段食管的实验研究.中华胸心血管外科杂志，2002，18(5):301-305.
10 张兰军，智发朝，戎铁华，等.生物型人工食管的实验研究.中华胃肠外科杂志，2001，4(3):157-160.
作者单位:510060广东广州中山大学肿瘤医院胸科
(收稿日期:2004-02-13)
(编辑李 阳), 百拇医药
建设项目资助该研究获2003年度广东省科技计划项目重大攻关资助(项目编号:2003A3020103)
该研究获2003年度广东省自然科学基金资助(项目编号:31717)
【摘要】 目的 构建不同生物材料的人工食管，建立犬胸段食管缺损模型并以人工食管植入重建，寻求解决术后吻合口瘘及狭窄的方法。方法 采用不同生物材料人工食管以不同吻合方式对两组共45只中国杂种犬进行胸段食管缺损植入重建。结果 两组围手术期存活率分别为53.33%(8/15)及93.33%(28/30)，吻合口瘘发生率为40%(6/15)及6.67%(2/30)，“叠瓦套入式”吻合法可明显降低术后吻合口瘘(P<0.01)。胃镜检查发现“新生食管”于术后60～75d出现不同程度狭窄，狭窄经扩张或支架置入可完全缓解。组织病理结果显示“新生食管”由纤维结缔组织构成，3～6个月后“新生食管”可完全覆盖鳞状上皮，1年后粘膜下层可见腺体及神经再生。结论 猪主动脉材料是理想的人工食管构建材料，植入后可短暂替代食管并由机体修复为有上皮组织爬覆的纤维结缔组织的“新生食管”。术后吻合口瘘主要与手术方法及材料选择等因素有关，“叠瓦套入式”吻合可明显降低吻合口瘘。术后狭窄经妥善的内科治疗可缓解。该动物模型可成功反映人工食管植入重建后的转归及愈合过程。
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关键词 人工食管 生物材料 组织病理
【文献标识码】 A 【文章编号】 1726-7587(2004)06-0769-03
Experimental study of the tissue engineering biological artificial esophagus
Zhang Lanjun，Rong Tiehua，Long Hao，et al.
Department of Thoracic Surgery，Cancer Hospital of Sun Yat-sen University，Guang dong510060.
【Abstract】 Objective To design different type biological material artificial esophagus and to observe the healing process of the regenerated esophagus in dog.Methods Different types biological artifical esophagus were imˉplanted to45Chinese mongrels with different anastomosis.Results The postoperative survivalrates in two groups were53.33%(8/15)～93.3%(28/30)，and the anastomotic leakage rates were40%(6/15)～6.67%(2/30)，the“cross and fold”anastomosis can significant decrease the postoperative anastomotic leakage rate compare to the“end to end”anastomosis(P<0.01).The postoperative stenosis of regenerated esophagus was occurred about2～3months after implantation，and it can relieved by theendoscopical dilation or esophageal stent implantation.The histology and endoscopical findings show that the luminal surface of regenerated esophagus was covered with smooth mucosa and the complete epithelialization was observed at3～6months.Conclusion The biological artificial esophagus was one of safe and effective way to reconstruction of esophagus，and the“cross and fold”anastomosis can significant decrease the postoperative anastomotic leakage rate，postoperative stenosis of regenerated esophagus can be relieved by the endoˉscopical therapy or esophageal stent implantation.The animal trial model can successful testing the healing process of the biological artificial esophagus in dog.
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Key words artificial esophagus biological materials histopathology
术后吻合口瘘及狭窄是人工食管研究中的两大难题 [1～4] ，为了筛选构建组织工程化人工食管的生物材料并寻求解决术后吻合口瘘及狭窄的方法，我们自1999年6月开始建立犬胸段食管缺损模型并以不同类型的人工食管进行重建，取得了一定的进展，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 构建人工食管的生物材料筛选
1.1.1 牛主动脉材料管 选取新鲜、健康、直径为1.8～2.5cm、长度为10～15cm的牛降主动脉进行预处理，剥离外膜的脂肪组织，结扎侧枝血管，并以专利技术进行组织处理，将处理后的管道制成10～15cm长的人工食管并浸入30%乙醇溶液中封存备用。
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1.1.2 猪主动脉材料管 选取猪主动脉为原料进行清洗及组织处理(组织处理方法同上)，将处理后的猪主动脉剪制成长方形的片状材料，把4片该材料在洁净工作台下固定于模具上，以4-0平制羊肠线缝制成内径2.0cm，壁厚0.5cm，长8～12cm的人工食管(见图1)，以生理盐水封存于密封胶袋中经钴60照射消毒后备用。
1.2 动物模型建立及实验分组 选用健康中国杂种犬，由中山大学动物研究中心提供普通级中国杂种犬，雌雄不限，体重17.5～25.5kg，以盐酸左旋咪唑驱虫及犬五联活疫苗免疫。实验前犬禁食、水6h，以3%戊巴比妥钠静脉麻醉(1ml/kg)，以卡肌宁维持肌松(1mg/kg)，气管插管、呼吸机辅助呼吸，经右胸后外侧切口第五肋间入胸，自奇静脉水平图1 猪主动脉材料人工食管至贲门上方3cm处游离并切除犬胸段食管10～14cm长，制备成犬胸段食管缺损模型以备人工食管原位植入重建。实验分为以下两组。
1.2.1 牛主动脉材料管组 实验犬15只，平均体重17.65kg，雌雄比例1:1.83，植入人工食管长度为5～12cm，平均6.8cm。重建采用间断、全层、端端吻合，后壁内翻，前壁外翻，上、下吻合口均采用1-0丝线及5×17弧度圆针吻合，吻合口外未包埋。
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1.2.2 猪主动脉材料管组 实验犬30只，体重17.5～25.5kg，雌雄比例1:2。植入人工食管长度均为8cm。重建采用“叠瓦套入式”吻合，即上、下吻合口后壁以人工食管交叠套入犬食管粘膜层与肌层之间约0.4～0.5cm行间断、全层、端端吻合，线结打在犬食管粘膜层上。而上、下吻合口前壁以犬食管全层叠套于人工食管上约0.4～0.5cm行间断、全层、端端吻合，线结打在犬食管外膜上。缝线采用3-0无损伤编织涤纶线及5×14弧度无损伤圆针，吻合口外以纵隔胸膜覆盖包埋。
两组术后均禁食、水5～6d，以静脉营养维持(100ml/kg)，术后第7～8d进全流质饮食，术后10d进半流质饮食，术后3周正常喂养。
1.3 观测指标 观察两组间围手术期存活率、吻合口瘘及狭窄发生率。术后以Olympus-XQ-230型电子胃镜对存活犬于术后1、3、6、12、24个月进行内镜检查以观察人工食管的脱落过程和“新生食管”粘膜爬覆情况。术后1、3、6、12、15、18、24个月各处死2只存活犬行组织病理学检查，观察“新生食管”外观、质地和组织结构，镜下观察“新生食管”粘膜爬覆、粘膜下结构及其重塑变化。
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2 结果
2.1 术后吻合口瘘及存活情况
2.1.1 牛主动脉材料管组 15只犬中8只围手术期存活，其中最长存活15个月。发生吻合口瘘6只均处死解剖，麻醉时意外死亡1只。全组围手术期存活率为53.33%(8/15)，吻合口瘘发生率为40%(6/15)。术后1、3个月各处死存活犬2只，术后3～6个月因新生食管狭窄致营养不良、衰竭死亡3例，于术后15个月处死存活犬1例。
2.1.2 猪主动脉材料组 30只犬中28只围手术期存活，其中最长存活已超过2年，吻合口瘘死亡2例，围手术期存活率为93.3%(28/30)，吻合口瘘发生率6.67%(2/30)。术后胃镜下球囊扩张致新生食管撕裂死亡2例，后期因肺炎死亡1例。依方案分别于术后1、3、6、12、15、18、24个月各处死存活犬2只行病理检查。手术2年后因胃溃疡出血死亡1例、肝炎及犬皮肤血螨病死亡4例。自然死亡3例、不明原因死亡1例(病理检查均未发现呼吸、循环及消化系统异常)，2年后因结束实验处死存活犬2例行病理检查。
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2.1.3 两组吻合口瘘 经χ 2 检验结果显示:χ 2 值=7.601，当自由度为1时，P<0.01，两组间差异有非常显著性。
2.2 术后狭窄及治疗
2.2.1 牛主动脉材料管组 所有存活犬均发生术后新生食管狭窄，其中3例因进食障碍致营养不良死亡，1例存活。
2.2.2 猪主动脉材料管组 22例于术后60～75d出现不同程度的狭窄，其中Cwikiel [5] 分级1～2级者13例(59.1%)，3级者2例(9.1%)，4级者7例(31.8%)。有18例需行镜下扩张治疗，其中13例经2～3次扩张后治愈，5例需行食管内支架置入，全组无一例因食管狭窄而致营养不良死亡者。
2.3 术后电子胃镜检查 牛主动脉材料管组未行术后胃镜检查，而猪主动脉材料管组存活犬于术后1、3、6、12、24个月行胃镜检查，镜下见术后26～47d时人工食管自上吻合口处开始向内卷曲并逐渐剥脱，人工食管外周形成一个以人工食管为支撑的、完整连续的纤维管道，人工食管与纤维管道间尚无内皮爬覆。当人工食管完全脱落后上皮逐渐覆盖内层的纤维创面，术后约3～6个月粘膜上皮完全覆盖新生的纤维管道腔内面，术后12、24个月见“新生食管”内壁光滑、粘膜覆盖完全、无狭窄(见图2)。
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图2 术后1个月人工食管镜下观
2.4 术后组织病理学检查 猪主动脉材料组于术后1、3、6、12、15、18、24个月各处死2例存活犬，进行病理学检查，并以HE染色及Masson、Aketin、VG等特殊染色观察。结果示:术后1个月“新生食管”为一纤维结缔组织包裹的连续管道，剖面可见人工食管与纤维组织管紧密粘附，纤维层厚约2～3mm，镜下为杂乱的疏松纤维结缔组织，未见粘膜上皮。术后3个月“新生食管”为深红色、较硬的纤维管道，粘连较术后1个月减轻，剖面为一连续的组织管道，人工食管已脱落，镜下见“新生食管”为纤维结缔组织所构成，有薄层粘膜上皮爬覆。术后6个月“新生食管”为均匀的粉红色“肌性”管道，质软，剖面可见完整的食管鳞状上皮，细胞层较厚，Masson染色及Aketin染色可见粘膜下肌层，粘膜下可见丰富的血管，部分血管周围可见散在的肌细胞巢(图3)。术后1年“新生食管”为连续的肌性管道，粘膜光整。镜下见完整的鳞状上皮，其下为粘膜肌层，可见食管腺体，粘膜下可见散在的神经纤维，“新生食管”壁为致密且排列有序的纤维结缔组织(图4)。
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图3 术后1年人工食管大体标本
3 讨论
3.1 人工食管构建材料的筛选 人工食管的构建材料包括自体组织、生物材料、人工材料及复合材料。自体组织应用最早，也是目前应用最成熟的重建方式，常见的有胃、结肠、空肠等代食管术 [7，8] ，但却存在手术创伤大、干扰生理功能及术后反流等无法克服的缺陷。人工材料及复合材料是应用较广泛的材料，包括聚乙烯、膨体聚四氟乙烯及碳素纤维等，其缺点是生物相容性差，质硬，脱落后不安全等。1999年Miki [6] 以聚乙烯网状支架作支撑，把胶原蛋白及人鳞状上皮附着在支撑物上培养，缝制成食管。2002年徐志飞 [9]采用聚氨酯-胶原蛋白复合材料构建成人工食管。但均存在管道脱落不安全及吻合口瘘发生率较高的问题。张兰军 [10] 等应用异体生物组织做原材料，将其处理成无抗原性及残余毒性，组织相容性好，可安全脱落或吸收的人工材料，制成可工业化生产的人工食管，但从实验结果可以看出，牛主动脉材料较厚，质硬，弹性差，且口径相差太大，不易工业化标准生产，而且牛主动脉材料与实验动物犬之间存在一定程度的免疫源性，故吻合口瘘发生率较高。而猪主动脉材料柔软，厚薄适中，弹性好，来源方便易采集，可标准化工业生产，与人体或犬生物相容性好，是理想的人工食管构建材料，该人工食管材料经国家药品监督管理局中国生物制品检定所检验后认为无毒性，无致敏性及致畸性，符合长期植入人体标准。
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3.2 吻合口瘘 吻合口瘘是人工食管术后最严重的并发症，发生率10%～60% [1～4] ，究其原因我们认为主要与吻合方法、构建材料等诸多因素有关，也与缝线、缝针等因素有关。本实验结果发现“叠瓦套入式”吻合组明显较端端吻合组吻合口瘘发生率低(P<0.01)，我们认为“叠瓦套入式”吻合术可较好的提供人工食管的受力点，避免拉伤人工食管壁特别是进针点，从而缓解吻合口张力及有利于上皮组织爬覆。而无损伤编织线或聚丙烯线较丝线理想，另外吻合时的线结位于宿主食管面时可较好缓冲线结拉力。其它的因素尚与食管血运，犬卫生习惯及进食方式等有关。犬为匍形动物，进食时急迫，且肠蠕动活跃，反流较多，故下吻合口较易发生瘘。本组吻合口瘘发生率从40%下降到6.67%，除与手术方法的改进有直接关系外，也与人工材料的改进有关。
3.3 术后狭窄 术后狭窄致营养不良是人工食管难以妥善临床应用的另一难题。本研究中猪主动脉材料组有18例犬行狭窄后镜下治疗，除5例经扩张无效而放置支架外，其余13例均经2～3次镜下扩张而治愈。全组目前无一例因狭窄而致死亡者。而牛主动脉材料组未行镜下治疗，结果3例死亡、仅1例存活。我们认为术后狭窄主要是由于人工食管脱管后新生食管的疤痕增生所致，也与新生食管环形收缩及纵向缩短有关，但上皮组织完全爬覆后狭窄逐渐缓解，其原因与上皮组织爬覆后抑制疤痕增长有关，另外上皮下结构完善及纤维结缔组织重塑也是缓解狭窄的原因。故术后狭窄发生可于术后2～4个月内，若仔细、耐心的反复镜下扩张以及坚持喂养固体食物(因为固体食物的反复刺激具有扩张作用)可期望达到缓解，只有当扩张无效时才考虑置入支架。
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3.4 “新生食管”的愈合及重塑现象 试验发现人工食管植入后仅起短暂的替代、支撑作用，术后1周即在其外周形 成一个由血液及结缔组织渗出覆着的胶原纤维管道，约在术后30d左右，由于进食刺激及食物中的细菌作用，使上吻合口部位出现剥脱，术后30～45d左右人工食管完全脱落并被排出。脱管后的纤维结缔组织内壁由上下两端的食管上皮向中心爬覆，3个月左右上皮基本爬覆，6个月左右完全覆盖。新生食管上皮化后逐渐柔软、通畅而定型。而胃镜下及病理可以看出“新生食管”是由致密的纤维结缔组织构成，表面覆盖与机体食管鳞状上皮一致的上皮细胞，纤维结缔组织内可见血管。刘谦及Fukushima [2，7] 等报道发现有肌肉及腺体再生，Yasumichi [8] 也认为只要人工食管停留4周以上，均能见腺体和肌肉再生。而我们的研究中可以看到粘膜下肌层及散在于血管旁的肌细胞巢，另见食管腺体及神经再生，胶原排列的有明显的重塑现象。
4 结论
(1)组织工程化人工食管做为新的食管重建方法之一，其手术方法简单、并发症少，对心肺影响小，不干扰正常生理功能，是理想的食管重建方式。(2)手术方法及吻合技术是减少及防止吻合口瘘发生的主要手段，“叠瓦套入式”吻合法可明显减少生物型人工食管术后吻合口瘘的发生。猪主动脉材料柔软、易取材、可工业化生产、有良好的生物耐受性，是理想的人工食管构建材料。(3)术后狭窄与疤痕增生及“新生管道”收缩有关，内镜下扩张或支架置放可治疗狭窄而完全缓解症状。(4)生物型人工食管在体内短暂替代食管并由机体产生有上皮爬覆的纤维结缔组织结构的“新生食管”，随着时间延长“新生食管”粘膜下肌层及部分腺体再生，而“新生食管”的纤维结缔组织在后期可适应进食而出现重塑。(5)该动物模型可较好反映愈合过程及并发症发生和转归，能为临床试验提供有效数据。(本文图4见封三)
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参考文献
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6 Miki H，Ando N，Ozawa S，et al.An artificial esophagus constructed of cultured human esophageal epithelial cells，fibroblasts，polyglycolic acid mesh，andcollagen.ASAIO Journal，1999，45:502-508.
7 Fuknshima M，Kako N，Chiba K，et al.Seven-year follow-up study after the replacement of the esophagus with an artificial esophagus in the dog.Surgery，1983，93(1):70-77.
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9 徐志飞，秦雄，赵学维，等.聚氨酯-胶原蛋白复合人工食管替换犬颈段食管的实验研究.中华胸心血管外科杂志，2002，18(5):301-305.
10 张兰军，智发朝，戎铁华，等.生物型人工食管的实验研究.中华胃肠外科杂志，2001，4(3):157-160.
作者单位:510060广东广州中山大学肿瘤医院胸科
(收稿日期:2004-02-13)
(编辑李 阳), 百拇医药